大家好！今天跟大家分享的文獻(xiàn)是2021年3月發(fā)表在Molecular Therapy: Nucleic Acid （IF=7.032）雜志上的一篇文章。本研究根據(jù)DNA甲基化水平對胃癌患者分為三個(gè)亞型并構(gòu)建DNA甲基化相關(guān)性打分（DMS）。DMS可用于預(yù)測預(yù)后和免疫治療效果。
題目：DNA methylation regulator-mediated modification patterns and tumor microenvironment characterization in gastric cancer
DNA甲基化調(diào)控因子介導(dǎo)胃癌修飾模式和腫瘤微環(huán)境特征
摘要
DNA甲基化與腫瘤免疫和免疫治療之間具有相關(guān)性。然而，DNA甲基化對腫瘤微環(huán)境特征和免疫治療效果的作用仍然需要進(jìn)一步闡明。本研究對20個(gè)DNA甲基化調(diào)控因子的基因表達(dá)水平進(jìn)行聚類，評估1619例胃癌患者的DNA甲基化調(diào)控因子模式和腫瘤微環(huán)境特征。共發(fā)現(xiàn)三種胃癌亞型具有不同的DNA甲基化修飾模式和腫瘤微環(huán)境特征。隨后，構(gòu)建DNA甲基化相關(guān)性打分（DMS）評估DNA甲基化修飾。高DMS與免疫激活狀態(tài)，腫瘤突變負(fù)荷較高和預(yù)后較好有關(guān)。低DMS與間質(zhì)激活，免疫細(xì)胞浸潤缺失和生存較差有關(guān)?？偟膩碚f，DNA甲基化修飾模式有助于對胃癌腫瘤免疫微環(huán)境的認(rèn)識，指導(dǎo)未來個(gè)性化的免疫治療策略。
流程圖
結(jié)果
1. 數(shù)據(jù)的獲取和整理
從GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫下載8個(gè)GC隊(duì)列，包括1619例患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。從UCSC下載體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)和甲基化數(shù)據(jù)。
2. GC患者中DNA甲基化調(diào)控因子的多組學(xué)研究
本研究收集了20個(gè)DNA甲基化調(diào)控因子，包括3個(gè)writers，3個(gè)erasers和14個(gè)reads（圖1A）。這些調(diào)控因子的突變率較低（圖1B），MECP2，DNMT3B和ZBTB38的拷貝數(shù)擴(kuò)增頻率較高，而MBD1和MBD2主要發(fā)生拷貝數(shù)缺失（圖1C）。使用STRING構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（圖1D）。大多數(shù)調(diào)控因子在腫瘤組織中表達(dá)水平較高（圖1E）。以上結(jié)果表明，DNA甲基化調(diào)控因子的互作可能在胃癌發(fā)生，發(fā)展和異質(zhì)性中起到關(guān)鍵作用。
圖1 胃癌患者的DNA甲基化調(diào)控因子多組學(xué)分析
3. DNA甲基化調(diào)控因子的預(yù)后和免疫特征
作者對8個(gè)隊(duì)列的1619例患者進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)所有調(diào)控因子與細(xì)胞周期通路正相關(guān)。表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn)DNMT1，UHRF1和UNG呈正相關(guān)（圖2A）。通過單因素Cox回歸分析研究這20個(gè)DNA甲基化調(diào)控因子的預(yù)后價(jià)值。這些調(diào)控因子的相互作用和預(yù)后作用如圖2A所示。MBD2，TET2和DNMT1的表達(dá)水平與免疫細(xì)胞呈正相關(guān)（圖2B）。MBD2高表達(dá)組中免疫細(xì)胞浸潤程度較高。GSEA分析表明，T細(xì)胞受體信號通路，B細(xì)胞受體信號通路，抗原處理呈遞通路和免疫或炎癥相關(guān)通路在MBD2高表達(dá)組中顯著富集（圖2C）。MBD2在MSI隊(duì)列，ACRG隊(duì)列（圖2D）和TCGA STAD隊(duì)列（圖2E）中均高表達(dá)。生存分析表明，在PRJEB23709隊(duì)列（圖2F）和UC_Atezo隊(duì)列（圖2G）中MBD2高表達(dá)的患者預(yù)后較好。此外，MBD2高表達(dá)患者的臨床反應(yīng)較高（圖2H）。這些結(jié)果表明，DNA甲基化調(diào)控因子與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)，MBD2與免疫細(xì)胞浸潤正相關(guān)，可以作為胃癌預(yù)后和免疫治療效果的生物標(biāo)志物。
圖2 DNA甲基化調(diào)控因子的預(yù)后和免疫特征
4. GC患者的DNA甲基化修飾模式
作者對GC隊(duì)列的DNA甲基化調(diào)控因子的表達(dá)水平進(jìn)行無監(jiān)督聚類?；颊叻譃槿齻€(gè)亞類，分別為模式A（510例），模式B（749例）和模式C（360例）。ZBTB4, ZBTB38, MBD1, UHRF2 和TET2在模式A中高表達(dá)，UHRF1, DNMT1, UNG 和NTHL1在模式B中高表達(dá)，ZBTB33, TET3, TET1, TDG, DNMT3A, DNMT3B和MBD3在模式C中高表達(dá)（圖3A）。根據(jù)3D-PCA區(qū)分這三個(gè)模式，結(jié)果表明這三組明顯分離（圖3B）。生存分析表明，模式B與預(yù)后較好有關(guān)（圖3C），且CD8 T細(xì)胞，CD4 T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞活性最高（圖3D）。通路分析表明，模式B富集于免疫或炎癥相關(guān)通路，模式A富集于上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等通路（圖3E）。
圖3 GC隊(duì)列的DNA甲基化修飾模式
5. 三種DNA甲基化調(diào)控模式在ACRG隊(duì)列中的臨床和轉(zhuǎn)錄組特征
根據(jù)DNA甲基化調(diào)控因子的表達(dá)水平對ACRG隊(duì)列分為三種DNA甲基化模式（圖4A）。根據(jù)PCA可以將三個(gè)模式的患者區(qū)分。模式A和模式B的沒有生存優(yōu)勢（圖4B）。模式B免疫激活特征較為豐富，模式A基質(zhì)激活較為豐富（圖4C）。模式B中免疫細(xì)胞浸潤和免疫特征上調(diào)（圖4D）。此外，根據(jù)ACRG隊(duì)列的分子亞型，作者發(fā)現(xiàn)MSI亞型的大部分患者屬于模式B，EMT亞型大部分患者為模式A（圖4E）。
圖4 ACRG隊(duì)列的三種DNA甲基化調(diào)控模式的臨床和轉(zhuǎn)錄特征差異
6. DNA甲基化相關(guān)基因簇的臨床和轉(zhuǎn)錄特征和DMS構(gòu)建
為進(jìn)一步研究不同DNA甲基化調(diào)控模式的異質(zhì)性，作者鑒定組間差異表達(dá)基因，共鑒定到859個(gè)DNA甲基化調(diào)控模式相關(guān)基因。GO分析表明基因富集在免疫和DNA甲基化相關(guān)事件（圖4F）。這些結(jié)果表明，DNA甲基化調(diào)控模式的不同臨床和轉(zhuǎn)錄特征可能是這些差異基因造成的。單因素Cox回歸分析表明265個(gè)基因具有預(yù)后價(jià)值。對這些基因進(jìn)行無監(jiān)督聚類分析，將GC患者分為三類（圖5A），生存分析表明簇A的預(yù)后較好（圖5B）。簇A患者的CD8 T效應(yīng)因子和APC共刺激更高（圖5C）。簇C患者的血管生成和EMT1-3特征打分更高。這些結(jié)果表明，GC中存在三種不同的免疫表型。作者構(gòu)建基于265個(gè)DNA甲基化相關(guān)特征基因的風(fēng)險(xiǎn)打分模型（DMS）評估DNA甲基化狀態(tài)。模式B的DMS中位數(shù)最高，模式A的DMS中位數(shù)最低（圖5D）。對DNA甲基化基因簇來說，簇A的DMS中位數(shù)最高，簇C的DMS中位數(shù)最低（圖5E）。對四種ACRG亞型來說，MSI亞型的DMS最高，EMT亞型的DMS最低（圖5F）。根據(jù)DMS打分，將患者分為DMS高組和DMS低組，DNA甲基化調(diào)控模式，ACRG分子亞型，基因簇和DMS的相關(guān)性見圖5G。
圖5 DNA甲基化基因簇的臨床和轉(zhuǎn)錄特征和DMS構(gòu)建
7. TCGA隊(duì)列的DMS預(yù)后價(jià)值和GC亞型分析
接下來，作者研究DMS對胃癌患者預(yù)后的影響。生存分析表明，ACRG隊(duì)列DMS高組的生存期較長（圖6A），并使用TCGA STAD隊(duì)列進(jìn)行驗(yàn)證（圖6B）。多因素Cox回歸模型表明DMS可作為預(yù)測患者生存期的獨(dú)立預(yù)后因子。此外，作者使用多隊(duì)列對DMS的預(yù)后價(jià)值進(jìn)行驗(yàn)證。此外，也可以使用DMS評估GC患者的臨床特征（圖6C）。MSI和EBV-positive組的DMS打分更高（圖6D）。以上結(jié)果表明，DMS是一個(gè)重要的預(yù)后標(biāo)志物，可以有效預(yù)測OS，DFS，RFS和GC患者的臨床特征，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
為進(jìn)一步研究DNA甲基化調(diào)控因子模式，DMS和GC患者的甲基化狀態(tài)，作者首先采用4個(gè)CIMP亞型。結(jié)果表明，具有CIMP狀態(tài)的患者DMS更高（圖6D）。此外，作者下載TCGA STAD 450K數(shù)據(jù)，基于非監(jiān)督聚類將患者分為三組，作者命名為MethCluster。生存分析表明C2預(yù)后最好，DMS最高（圖6E）。免疫細(xì)胞比例和免疫特征分析表明C2的活化的CD8 T細(xì)胞和CD4 T細(xì)胞豐度較高。此外，C2的MHC表達(dá)豐度更高。DNA甲基化調(diào)控因子模式，TCGA亞型，CIMP狀態(tài)，MethCluster和DMS之間的關(guān)系如圖6F所示。
圖6 DMS預(yù)后價(jià)值和TCGA隊(duì)列的GC亞型的驗(yàn)證
8. DMS對免疫治療的預(yù)測價(jià)值
接下來，作者研究DMS是否可以預(yù)測患者的免疫治療效果。對免疫治療有反應(yīng)的患者DMS較高（圖7A-7B）。MSI-H和EBI-positive組的患者DMS更高（圖7C）。在UC_Atezo隊(duì)列中，接受免疫治療的患者中高DMS組的患者總生存期較長（圖7D）。部分緩解（PR）和完全患者（CR）組的DMS較高（圖7E）。作者評估結(jié)合TMB和DMS預(yù)測預(yù)后的效果，結(jié)果表明高DMS和高TMB組的總生存期較長（圖7F）。免疫炎癥表型的患者DMS最高（圖7G），高DMS組預(yù)后較好，臨床治療效果較號（圖7H-7K）。為進(jìn)一步評估DMS在GC中的預(yù)測性能，作者將DMS與之前發(fā)表的10個(gè)應(yīng)答ICI基因表達(dá)免疫特征進(jìn)行比較。結(jié)果表明，DMS預(yù)測免疫治療反應(yīng)的效果最好，AUC為0.873（圖7L）。以上結(jié)果表明DMS可以有效預(yù)測免疫治療的效果。
圖7 DMS預(yù)測免疫治療效果
結(jié)論
本研究作者從DNA甲基化程度鑒定到GC的三個(gè)亞型并構(gòu)建了一個(gè)評估DNA甲基化的DMS。在多個(gè)GC隊(duì)列中驗(yàn)證DMS對生存期的預(yù)測價(jià)值。DMS還可以評估患者的臨床病理特征和患者對免疫治療的效果。但本文還存在一定局限性，由于一些GC隊(duì)列的生存數(shù)據(jù)無法獲取，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證DMS對胃癌的預(yù)測能力。
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