SUMO化蛋白翻譯后修飾，又稱為SUMOylation，在細(xì)胞功能中起著不可或缺的作用，與DNA修復(fù)、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中比較常見的三種SUMO化修飾類型：SUMO1、SUMO2和SUMO3，其中SUMO2和SUMO3有96%的同源性，而SUMO1和其他兩種修飾只有45%的序列同源性。
圖1
蛋白SUMO化酶級(jí)聯(lián)效應(yīng)與泛素化途徑具有較高的相似性，兩者分子機(jī)制都需要E1（活化）和E2（結(jié)合）兩種分子，如圖1所示。在ATP驅(qū)動(dòng)機(jī)制下，SUMO化C端羧基部分首先由SAE1/SAE2異二聚體（E1）激活，在E1和SUMO羧基之間形成硫酯鍵。SUMO分子集團(tuán)隨后通過硫代反應(yīng)從E1絡(luò)合物轉(zhuǎn)移到Ubc9（E2）。在某些情況下，E3連接酶蛋白需要有效底物，通過提供Ubc9和底物蛋白之間的額外親和力超過其他的作用力不佳的相互作用蛋白。當(dāng)目標(biāo)賴氨酸位于正向或者反向共有基序時(shí)，SUMO化則不需要E3連接酶，只需要E1和E2兩種酶。目前，尚不清楚E1和E2（Ubc9）如何在E3沒有參與的情況下控制如此眾多的底物發(fā)生選擇性SUMO化。這與泛素化形成鮮明的比對，泛素化通路過程中有10多種E1激活酶、35種E2結(jié)合酶以及數(shù)百種E3連接酶參與。蛋白質(zhì)的SUMO化調(diào)控著多種細(xì)胞底物的活性，為了了解此修飾如何影響蛋白質(zhì)功能，常常需要鑒定SUMO化修飾位點(diǎn)。然而，質(zhì)譜法（MS）對賴氨酸上發(fā)生的此修飾鑒定，仍然有很大的挑戰(zhàn)性，因?yàn)檫@種修飾的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、較低的化學(xué)計(jì)量性質(zhì)以及胰蛋白酶消化后肽骨架上相對較大的SUMO殘基。這里報(bào)道了一種多用途的方法，以確定修飾位點(diǎn)和體外重組蛋白的SUMO化修飾程度。與其他實(shí)驗(yàn)方法的比較Western Blots 傳統(tǒng)上用于檢測細(xì)胞提取物或體外實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)SUMO化的變化。雖然這些實(shí)驗(yàn)可以檢測細(xì)胞提取物或特定底物上蛋白質(zhì)SUMO化修飾整體變化，但是很難確定哪些賴氨酸殘基上發(fā)生修飾。為了利用Western Blot鑒定SUMO化位點(diǎn)，必須建立目標(biāo)底物的各種突變文庫，其中需用Arg代替每個(gè)Lys，然后對相應(yīng)的突變蛋白進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。此外，如果使用Western Blotting進(jìn)行分析，必須經(jīng)常與SUMO1一起使用，避免SUMO發(fā)生聚合，這樣會(huì)稀釋信號(hào)，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。此外，蛋白質(zhì)SUMO化能阻斷抗原表位的識(shí)別，因此產(chǎn)生假陰性結(jié)果。最后，Western Blot可以監(jiān)測蛋白SUMO化的整體變化，但是不能確定蛋白底物不同修飾位點(diǎn)上的SUMO化修飾的動(dòng)力學(xué)變化。 體內(nèi)分析方法最初，科學(xué)家用一種帶有N端His標(biāo)簽的Lys缺陷的SUMO類似物識(shí)別SUMO位點(diǎn)，還有科學(xué)家利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記（SILAC）鑒定SUMO化修飾位點(diǎn)，還有科學(xué)家利用QQKGG SUMO變體和Lys-C結(jié)合，然后使用商業(yè)化的抗-GlyGly抗體，以識(shí)別SUMO化位點(diǎn)。此處用的是Ni-NTA純化方法分離SUMO化修飾蛋白，然后進(jìn)行胰蛋白酶消化，然后利用定制化抗體富集這些SUMO肽段進(jìn)行后續(xù)分析。 實(shí)驗(yàn)流程設(shè)計(jì)工作流程如圖2所示，首先，根據(jù)不同反應(yīng)組分優(yōu)化配比配制體外SUMO化反應(yīng)，找到最優(yōu)反應(yīng)條件（步驟1-6）。反應(yīng)結(jié)束后，對蛋白質(zhì)進(jìn)行還原和烷基化處理（步驟7-11），然后用Ni-NTA純化his標(biāo)簽的蛋白質(zhì)底物，用胰蛋白酶（步驟12-24）在微球上消化，然后用LC-MS/MS（步驟33和34）進(jìn)行分析。原始數(shù)據(jù)用MaxQuant軟件處理分析。
圖2
每個(gè)體外反應(yīng)都應(yīng)包括（+）ATP和（-）ATP，則（-）ATP反應(yīng)將排除任何假陽性結(jié)果，而在（-）ATP體系中任何鑒定的SUMO化修飾位點(diǎn)結(jié)果都應(yīng)從（+）體系中排除出去，在我們實(shí)驗(yàn)過程中，從來沒在（-）ATP體系中發(fā)現(xiàn)SUMO位點(diǎn)，如圖3所示，然而串聯(lián)質(zhì)譜譜圖可以通過手工方法確證，比如通過找尋質(zhì)譜圖譜峰值m/z為243,1088和132.0768進(jìn)行驗(yàn)證。此方法以及成功鑒定了下列清單中各個(gè)蛋白的SUMO化修飾位點(diǎn)：RanGAP、UBE2K、HSP27、CDC73、HSF2、CHAF1A、PCNA、CBX1、Ubc9和SUMO3。SUMO3聚合鏈經(jīng)常被用作陽性對照，反應(yīng)1小時(shí)候，SUMO3的Lys-7和Lys-11發(fā)生SUMO修飾。
圖3
圖4
此體外SUMO化檢測手段可應(yīng)用于任何標(biāo)記蛋白和任何SUMO1，SUMO2或者SUMO3的突變體蛋白，無論它們是單獨(dú)使用還是一起使用，都可以確定所給的待檢產(chǎn)物的底物選擇性，本實(shí)驗(yàn)操作方法也可以用于泛素化和SUMO化通路之間的分子對話。 預(yù)期實(shí)驗(yàn)效果在體內(nèi)研究已經(jīng)確定HSP27蛋白發(fā)送SUMO化，然而體外并未確定其修飾情況。在進(jìn)行質(zhì)譜分析之前，我們通過Western Blot研究了HSP27的修飾狀態(tài)，雖然并未檢測出該蛋白發(fā)生SUMO化修飾條帶，但是在發(fā)生SUMO反應(yīng)之后，未修飾的底物明顯減少。我們據(jù)此推斷底物可能發(fā)生了SUMO化修飾，但是不能被抗體所識(shí)別，可能是因?yàn)槠淇乖瓫Q定簇被臨近的SUMO分子所阻斷。為了驗(yàn)證此發(fā)現(xiàn)，我們使用了HSP27作為底物進(jìn)行了體外SUMO化實(shí)驗(yàn)。正如預(yù)期的那樣，檢測到+MgATP組中出現(xiàn)特異峰（Table2），說明HSP27蛋白在Lys-188位點(diǎn)上發(fā)生SUMO化修飾。
5Table 2 | MaxQuant SUMO3(NQTGG) diagnostic peaks.
圖6是體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)所鑒定到的SUMO化位點(diǎn)的情況分析，通過體外程序在底物蛋白上發(fā)現(xiàn)的所有SUMO化修飾位點(diǎn)都與之前報(bào)道的HEK293細(xì)胞中構(gòu)建的SUMO3蛋白的體內(nèi)手段所得到的位點(diǎn)相同，這些蛋白包括RanGAP、UBE2K、HSP27、CD73、HSF2、PCNA、CBX1、Ubc9和SUMO3。
圖6
因?yàn)镾UMO3這種修飾在體內(nèi)研究比較多，因此在進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)時(shí)候也選擇了SUMO3作為研究對象，可對兩種不同的方法所發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)進(jìn)行比較。 方法學(xué)的一些限制對于大多數(shù)SUMO體外分析，實(shí)驗(yàn)步驟中沒有添加E3連接酶這一步，在某些情況下，特定的蛋白質(zhì)可能在體外實(shí)驗(yàn)中不能發(fā)生SUMO化修飾，它們可能需要適當(dāng)?shù)腅3連接酶模擬體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，完成SUMO化修飾。在已知E3連接酶體系中，可以在E3連接酶的存在下進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，而無需對實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行任何的修改。但是由于SUMO化修飾的機(jī)制簡單，只需要E1和E2兩種酶，因此實(shí)驗(yàn)方法僅僅限于進(jìn)行SUMO化分析，如果想將此方法應(yīng)用在泛素化修飾分析，那么需要知道每個(gè)底物的E1，E2和E3的不同組合情況，這也會(huì)使整個(gè)工作變得更加瑣碎。 此篇主要講述了SUMO化修飾位點(diǎn)分析的一種思路，大部分主流實(shí)驗(yàn)室還苦于通過用傳統(tǒng)WB方法分析SUMO化修飾，如今質(zhì)譜的快速發(fā)展給分析蛋白SUMO化修飾提供了種種可能，希望此篇能拋磚引玉給大家?guī)韱l(fā)。
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