近日，加拿大渥太華大學(xué)的研究人員在Nature Biomedical Engineering雜志（影響因子17.135）上發(fā)表文章，通過將小干擾RNA與高度富集的pre-microRNA的骨架整合內(nèi)源性表達(dá)，并將其包裝到細(xì)胞外囊泡中，可以降低小干擾RNA的治療用劑量；有望提高EVs作為載體遞送siRNA治療疾病的效果，并減少副作用。pre-microRNAs（pre-miRNAs）是60-120個核苷酸（nt）的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，被核糖核酸酶（RNase）III酶Dicer切割成短的，約21 nt的雙鏈（ds）RNAs。該21 nt dsRNA復(fù)合物與microRNA效應(yīng)子Argonaute（Ago）結(jié)合。去除一條RNA鏈后，Ago-miRNA復(fù)合體通過翻譯抑制和mRNA降解抑制目標(biāo)基因的翻譯。 siRNA被設(shè)計成模仿Dicer處理的結(jié)合Ago的dsRNA，并用于治療。當(dāng)siRNA與mRNA靶標(biāo)完美互補時，Ago2可以酶切靶標(biāo)mRNA，從而賦予這些藥物非凡的效能和特異性。
對于治療應(yīng)用而言，將siRNA遞送到細(xì)胞質(zhì)是一項長期的挑戰(zhàn)。定量分析表明，在每個細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中需要300-2,000個可催化切割mRNA的siRNA拷貝才能沉默目標(biāo)mRNAs。例如，將siRNA直接顯微注射到細(xì)胞質(zhì)中時，每個細(xì)胞需要300份siRNA才能使靶標(biāo)表達(dá)沉默50％?；蛘撸枰?00份siRNA加載到Ago2中才能有效地沉默肝臟中的靶mRNA。在培養(yǎng)的細(xì)胞或小鼠肝臟中進(jìn)行測量，目前的轉(zhuǎn)運載體（如脂質(zhì)納米顆粒）只能使0.05％到1％的siRNA進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。因此，需要高劑量的siRNA及其遞送載體才能達(dá)到患者的治療劑量。但這樣可能會導(dǎo)致毒性，從而終止了沉默RNAs的多項臨床試驗。脂質(zhì)納米顆粒和siRNA主要在肝臟中積累。因此，大多數(shù)siRNA治療藥物靶向在肝臟中表達(dá)的蛋白質(zhì)。用脂質(zhì)納米顆粒將siRNA輸送至肝臟可在6個月內(nèi)以單劑量將患者的靶基因表達(dá)降低80％以上，并且最近被批準(zhǔn)用于運甲狀腺素蛋白淀粉樣變性病的治療。siRNA傳遞到其他器官仍然是一個重大挑戰(zhàn)。已有很多研究提出細(xì)胞外囊泡，特別是小的細(xì)胞外囊泡作為siRNA的遞送載體。小細(xì)胞外囊泡（sEVs）可以通過從質(zhì)膜出芽或?qū)?0-120 nm囊泡在晚期內(nèi)體中出芽產(chǎn)生。這些晚期的內(nèi)體可隨后與質(zhì)膜融合，將其內(nèi)部的sEV釋放到細(xì)胞外空間。研究表明，細(xì)胞外囊泡和sEVs含有miRNA，可以將miRNA的活性轉(zhuǎn)移到其他細(xì)胞中。人們提出了一種假設(shè)，即EVs具有的在細(xì)胞之間傳遞小RNA或其他分子的能力，并且可以利用這種能力進(jìn)行有效的藥物傳遞。但是，在某些情況下，無論將siRNA電穿孔進(jìn)入sEV還是直接注射入小鼠，都無法達(dá)到有效的靶基因沉默。如果將siRNA用sEV電穿孔或涂在sEV表面，則敲低靶基因表達(dá)所需的siRNA劑量明顯超過脂質(zhì)納米顆粒中siRNA所需的劑量。這表明，sEV實際上可能幾乎沒有傳遞RNA的固有能力。模式圖：將miRNA和siRNA分選進(jìn)細(xì)胞外小泡迄今為止，關(guān)于使用sEV進(jìn)行siRNA遞送的研究可能尚未測試sEV的實際遞送效率。如果sEV與靶細(xì)胞融合，則sEV外部的siRNA不會進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，而是會留在內(nèi)體或細(xì)胞外部，從而失活。同樣，用siRNA電穿孔sEV可能實際上不會將siRNA引入sEV中，而是使siRNA沉淀，然后與sEV共純化。電穿孔或以其他方式改變sEV表面也可能干擾與靶細(xì)胞膜融合所需的sEV的膜結(jié)構(gòu)。因此，sEV的實際遞送效率仍然需要測試。miRNA在sEV中稀少，其絕對拷貝數(shù)范圍從每106個sEV一份特定miRNA拷貝到每個sEV一份拷貝。這強調(diào)了任何使用sEV進(jìn)行RNA治療的嘗試都可能需要將更多RNA包裝到sEV中的方法。然而，sEVs裝載了來自產(chǎn)生它們的細(xì)胞的高選擇性RNA子集。例如，在sEVs中發(fā)現(xiàn)了在細(xì)胞中類似富集的特定miRNA，其相對量范圍為106。這表明，僅僅過度表達(dá)miRNA可能無法使其包裝到sEV中。序列基序可能不是最佳的解決方案，因為它們在sEVs中的富集不高，并且難以將siRNA插入。Pre-miR-451是經(jīng)典的pre-miRNA生物發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)的一個例外。經(jīng)Drosha處理后，pre-miR-451的莖環(huán)只有42 nt長，太短而無法被Dicer結(jié)合和切割。相反，pre-miR-451直接綁定到Ago2。Ago2裂解pre-miR-451莖環(huán)的遠(yuǎn)端鏈。這產(chǎn)生了一個34 nt的產(chǎn)物，該產(chǎn)物被核酸外切酶逐漸修飾，產(chǎn)生了大約21 nt的miRNA。值得注意的是，如果保留了pre-miR-451莖環(huán)的結(jié)構(gòu)，則可以與其他miRNA序列重新編程，將通過相同的Dicer依賴性，Ago2依賴性途徑將其加工成成熟的有效miRNA。該研究證明了將siRNA整合到源自pre-miR-451的RNA主鏈中，而不是常規(guī)的pre-miRNA，可以將其牢固地包裝到sEV中。以此方式包裝有siRNA的sEV可以有效地減少培養(yǎng)物中以及小鼠中靶基因的表達(dá)。封裝有siRNA的sEV可以以脂質(zhì)納米顆粒包裝siRNA的十分之一的量敲低靶基因，這表明sEV是高效的運載工具。通過pre-miRNA-451骨架加載到EV中的siRNA進(jìn)行體內(nèi)敲除
參考文獻(xiàn)：
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vanEijndhoven MAJ, Baglio SR, Pegtel DM. Packaging RNA drugs into extracellularvesicles. Nature Biomedical Engineering. 2020 Jan;4(1):6-8. doi: 10.1038/s41551-019-0514-0.
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