一.實驗目的
1.加深對理論的理解，理論聯(lián)系實際。
2.掌握實驗的基本方法和技能。
3.培養(yǎng)嚴謹?shù)目茖W態(tài)度和作風。
二.實驗室規(guī)則
1.實驗前需預習實驗指導和有關理論，明確實驗目的、原理、預期的結(jié)果、操作關鍵步驟及注意事項。
2.實驗要嚴肅認真地按照操作規(guī)程進行，注意觀察實驗中出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果，并把實驗數(shù)據(jù)和結(jié)果及時如實記錄在實驗記錄本上，課后根據(jù)實驗結(jié)果進行科學分析。
3.實驗室和實驗臺應保持整潔。公用試劑用畢，立即蓋嚴并還原。實驗完畢，儀器洗凈放好。
4.注意節(jié)約藥品、試劑和各種物品，愛護儀器，按規(guī)程操作儀器，以免損壞。如果損壞儀器照章賠償。
5.實驗結(jié)束離開實驗室之前，關好窗戶，切斷電源，水源，確保安全。
三.實驗課考核標準和考核方法
考核標準：實驗課成績占生化課總成績的20％，共12次實驗。每次實驗為2分，缺課一次減2分，缺課1/3以上者，取消生化課考試資格。
考核方法：分實驗過程考核和實驗報告考核。
實驗過程考核占1分，包括操作方法及實驗結(jié)果評分。實驗結(jié)果占0.4分（結(jié)果的正確度），實驗操作占0.6分（包括分光光度法測試，離心機使用，層析法，電泳法等基本操作）。
實驗報告考核占1分。要求書寫規(guī)范，字跡清晰，結(jié)果分析合理，不允許抄襲。
實驗一 基本操作
一.目的
1.熟悉實驗室規(guī)則及常用生化儀器。
2.掌握各種儀器的正規(guī)操作。
3.清點洗刷實驗用具。
一、 實驗內(nèi)容
（一） 常用生化儀器
量器：量筒、離心管、吸量管、容量瓶
玻璃儀器
容器：燒杯、試管、錐形瓶、滴管
儀器：離心機、水浴箱、電泳儀、分光光度計等
（二） 玻璃儀器的洗滌
1、初用的玻璃儀器的清洗：表面附有堿性物質(zhì)，先用去污粉洗，再用自來水沖洗干凈，然后浸于鹽酸溶液浸泡過夜，再用自來水反復沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗1－2次，80℃烤干備用。
2、使用過的玻璃儀器洗滌
（1）一般非計量玻璃儀器或粗容量儀器，如燒杯、試管、量筒等先用肥皂水刷洗，再用自來水沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗1－2次，倒置晾干。
（2）量器，如滴定管、容量瓶等先用自來水沖洗，直至不掛水珠，再用蒸餾水沖洗1－2次，分干備用。若沖洗后仍掛水珠，則將其晾干后浸于鉻酸洗液浸泡數(shù)小時。然后用自來水反復沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗1－2次，干燥備用。
（三）吸量管和微量移液器的使用
1.吸量管的使用（注意標簽、選擇容量大小合適的吸量管）
（1）正確拿法 中指和拇指拿住吸管上端，食指頂住吸量管頂端
（2）取液 用橡皮球吸液體至刻度上，眼睛看著液面上升；吸完后用食指頂住吸量管上端。
（3）調(diào)刻度 吸量管與地面保持垂直，下口與試劑瓶接觸，并成一角度；用食指控制液體下降至最上一刻度處；液體凹面、刻度和視線應在一水平面上。
（4）放液 吸量管移入準備接受溶液的容器中，仍使其出口尖端接觸器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放開食指，使液體自動流出。奧氏吸量管和刻度到底的吸量管應吹出尖端殘留的液體。移液管應最后靠壁15秒。
2.微量移液器的使用
調(diào)節(jié)體積選取鈕至所需值，套上吸頭，旋緊。垂直持握移液器，用大拇指按下液體吸放鈕至第1檔，將吸頭插入待吸溶液，松開大拇指使吸放鈕回復原位。將移液器移入準備接受液體的儀器，用大拇指再次按下液體吸放鈕，至第1檔后繼續(xù)至第2檔以排空液體。
3.練習吸量管的使用
取50ml錐形瓶加入未知酸5ml ,酚酞指示劑1滴，搖勻，用0.01mol/LNaOH滴定，記錄結(jié)果。（無色酚酞遇酸不變色，遇堿變紅。）滴定時邊滴邊搖動錐形瓶。
(四)離心機的使用方法
離心機是利用離心力將懸浮液中的微粒從溶液中分離出來的一種儀器。根據(jù)最高離心轉(zhuǎn)速的不同可將離心機分為三種類型：普通離心機，其最高轉(zhuǎn)速一般在4000轉(zhuǎn)/分至6000轉(zhuǎn)/分；高速離心機，轉(zhuǎn)速可達10000轉(zhuǎn)/分至25000轉(zhuǎn)/分；超速離心機，轉(zhuǎn)速可超過50000轉(zhuǎn)/分以上。生化實驗室常使用普通離心機。
普通離心機的使用方法：
1．使用前先檢查變速旋鈕是否在“0”位，外套管是否完整無損和墊有橡皮墊。
2．離心時先將待離心的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到大小合適的離心管內(nèi)，盛量不宜過多,占管的2/3體積為宜,以免溢出。將此離心管放入外套管，再在離心管與外套管間加入緩沖用水。
3．將一對裝有離心管的外套管在臺稱上平衡。如不平衡可調(diào)整緩沖用水或離心物質(zhì)的量。
4．將平衡好的套管，按對稱方位放到離心機插孔中。把不用的離心套管取出，蓋嚴離心機蓋。
5．接通電源，開啟開關，平穩(wěn)、緩慢移動調(diào)速手柄，至所需轉(zhuǎn)速。計時。
6．當達到離心所需時間后，將調(diào)速柄慢慢調(diào)回零位，關閉開關。待離心機自動停止轉(zhuǎn)動后，再打開離心機蓋取出樣品。
7．用完后，取出套管中橡皮墊洗凈，沖洗外套管，倒置干燥。
實驗三 凝膠層析法分離蛋白質(zhì)
一．目的
1．了解層析技術的基本原理；
2．初步掌握分子篩層析的原理和操作方法。
二．原理
介紹層析的概念
所謂層析，就是利用樣品中各組成成分的理化性質(zhì)的差異，使各組分以不同程度分布在固定相和流動相兩相中，由于各組分隨流動相前進的速率不同，從而把它們分離開來的技術。這些物理特性包括分子的大小、形狀、所帶電荷、揮發(fā)性、溶解性及吸附性質(zhì)等。層析系統(tǒng)的必要組分有：
a. 固定相，可以是一種固體、凝膠或固定化的液體
b. 層析床，把固定相填入一個玻璃或金屬柱中，或者薄薄涂布一層于玻璃或塑料片上或者吸附在醋酸纖維紙上。
c. 流動相，起溶劑作用的液體或氣體
d. 運送系統(tǒng)，用來促使流動相通過層析床。
e. 檢測系統(tǒng)，用于檢測試管中的物質(zhì)。
由于不同物質(zhì)固定相相互作用的強弱不同，從而使得分離目的得以實現(xiàn)。
要點：層析系統(tǒng)中，與固定相作用強的物質(zhì)受到的阻力最大，而作用弱的物質(zhì)受到的阻力很小，因而不同物質(zhì)在層析過程中的遷移距離和洗脫時間不同。
介紹凝膠層析的概念。凝膠層析又稱分子篩層析，主要根據(jù)混合物中分子的大小和形狀不同，在通過凝膠時，分子的擴散速率各異而達到分離的目的。凝膠顆粒具有多孔性網(wǎng)狀結(jié)構，小分子易進入凝膠網(wǎng)孔，流程長而移動速度慢，而大分子物質(zhì)不能進入凝膠網(wǎng)孔，沿凝膠顆粒間隙流動，流程短移動快。這種現(xiàn)象稱為分子篩效應。
在凝膠層析中常用的凝膠有葡聚糖凝膠(商品名Sephadex)、聚丙烯酰胺凝膠(Bio-Gel-P)和瓊脂糖凝膠(Agarose)。葡聚糖凝膠是由細菌葡聚糖(又稱右旋糖苷)在糖的長鏈間用交聯(lián)劑1-氯-2，3-環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成。在合成時，調(diào)節(jié)葡聚糖和交聯(lián)劑的比例，可以獲得具有網(wǎng)孔大小不同的凝膠。G值表示交聯(lián)度，G值愈大，交聯(lián)度愈小，網(wǎng)孔和吸水量越大。
本實驗通過SephadexG50層析柱，以蒸餾水為洗脫劑，分離血紅蛋白(紅色，分子量約64500)與硫酸銅(藍色，分子量249.5)的混合物，從顏色的不同可觀察到血紅蛋白洗脫快，硫酸銅洗脫較慢。
三．材料
1．儀器 層析柱(直徑0.8-1.5cm，長10-20cm)；吸管；玻璃棒；小燒杯；25ml量筒；試管。
2．試劑 Sephadex G-50；抗凝血； 0.9%NaCI溶液；硫酸銅溶液
四．方法
（一）凝膠的準備。由準備室制備。
（二）樣品制備
1．血紅蛋白(Hb)溶液的制備 取抗凝血液約0.5ml于離心管中，離心5分鐘(2500rpm)，棄去上層血漿，用0.9%NaCI溶液3ml洗血細胞二次，將血細胞用1.5ml蒸餾水稀釋，即為Hb稀釋液，備用。
3．取Hb稀釋液與CuSO4溶液各0.5ml，充分混勻，此混合液作為樣品。
（三）裝柱 取層析柱(直徑0.8-1.5cm，長度20cm)一支，將層析柱燒結(jié)板下端的死區(qū)用蒸餾水充滿，不得留有氣泡，然后關閉層析柱的出口。將已溶脹的凝膠懸液沿玻棒小心地徐徐灌入柱中，待底部凝膠沉積1-2cm時，再打開出口，繼續(xù)加入凝膠懸液至凝膠層積集至約15cm高度即可。凝膠懸液盡量一次加完，以免出現(xiàn)不均勻或分層的凝膠帶。如表層凝膠凸凹不平時，可用玻棒輕輕攪動，讓凝膠自然沉降，使表面平整。
（四）加樣與洗脫：加樣時先將柱的出口打開，讓蒸餾水逐漸流出，待床面上只留下極薄的一層蒸餾水時，關閉出口。用滴管將樣品(約0.4ml)小心地加到凝膠床的表面上。注意加樣時不要將床面沖起，亦不要沿柱壁加入。然后，打開出口，使樣品恰好進入床面(不要讓空氣進入床內(nèi))，用上法滴加1-2倍樣品體積的蒸餾水，待完全流進床內(nèi)后，再加蒸餾水進行擴展洗脫，直至兩條區(qū)帶分開為止。
注意事項：洗脫的過程中，應不斷滴加蒸餾水，使始終凝膠床的上表面保留約2cm左右的蒸餾水
思考題
1. 凝膠層析法的基本原理是什么？假如分離幾種分子量大于20000的蛋白質(zhì)，應選用什么型的交聯(lián)葡聚糖凝膠？
2. 應用本法分離血紅蛋白與硫酸銅，怎樣才能得到較好的分離效果？
實驗四 影響酶活性的因素
（一）pH對酶活性的影響
一．目的
1．了解pH值對酶促反應速度影響。
2．掌握測定唾液淀粉酶活性的原理及定性方法。
二．原理
復習：1．酶：由活細胞產(chǎn)生的，對其特異底物起高效催化作用的蛋白質(zhì)。
2．酶促反應：酶所催化的化學反應。
3．影響酶促反應速度的因素：[S]、[E]、pH、溫度、激動劑與抑制劑
過酸過堿都能使酶蛋白變性而使其喪失活性。在不致使變性的pH值范圍內(nèi)，酶的活性會因pH值不同而不同。由于酶是一種蛋白質(zhì)，在不同氫離子濃度下，其解離的情況不同，但往往只有一種情況下才是該酶的最高活力，此時pH值稱為酶的最適pH值。倘若其作用條件偏離最適pH值任何方面，都將引起酶活性的降低，減慢酶促反應速度。
唾液淀粉酶能使淀粉水解成一系列比較簡單的化合物，最終產(chǎn)物為麥芽糖，利用其與碘液的不同呈色反應，即可推知淀粉酶水解淀粉的程度和pH對唾液淀粉酶的活性影響，并可指出唾液粉酶的最適pH。
pH
v
最適pH
淀粉 紫色糊精 紅色糊精 麥芽糖
(遇碘呈藍色、遇碘呈紫色、遇碘呈紅色、遇碘呈淡黃色)
三．操作方法
制備唾液：將放一薄層棉花的漏斗置于10ml量筒頂端，5名以上的學生吐1ml唾液，倒入100ml量筒中，用蒸餾水將小量筒沖洗倒入大量筒中，加蒸餾水至100ml，用吸量管混勻唾液。
取試管3支，編號，按表加各種試劑。
編號
0.5%淀粉液(ml)
pH5.0緩沖液(ml)
pH6.8緩沖液(ml)
pH8.0緩沖液(ml)
唾液(ml)
1
1
2
1
2
1
2
1
3
1
2
1
搖勻放入37℃水浴中保溫3分鐘，用滴管吸取pH6.8管內(nèi)液體一滴，在白瓷盤中用碘液檢查是否水解完全，然后向各管加碘液3滴，觀察結(jié)果解釋之。
（二）溫度對酶活性的影響
一．目的
了解溫度對酶活性的影響。
二．原理
在低溫時酶的催化反應速度一般很低，溫度升高催化反應速度也隨之升高，但酶是一種蛋白質(zhì)，升高溫度可以引起蛋白質(zhì)的變性，使酶的活性降低。所以溫度對酶的活性有二種相反的影響，一般在比較低溫范圍內(nèi)(例如0-40℃)，溫度對酶蛋白變性影響不大，活性隨溫度升高而增高。各種酶都有它的最適溫度，此時酶表現(xiàn)最高的活力。機體大多數(shù)酶的最適溫度在37℃—40℃。本實驗利用碘與淀粉的反應，來比較唾液淀粉酶在不同溫度對淀粉的水解速度。
溫度
v
最適溫度
三．操作方法
取試管4支，標號。在各管中均加入0.2%淀粉液2ml和pH6.8緩沖液1ml。然后，把第一試管置于40℃的水浴中，第二試管放在室溫下，第三放在冰水中，約2分鐘后，向第一、第二、第三試管再加稀釋唾液1ml，第四試管加入煮沸的唾液1ml，搖勻。隔2分鐘左右以第一試管取出幾滴反應液至白瓷盤內(nèi)，檢查完全水解后，取出各管，分別加碘液1滴，觀察顏色變化并解釋之。
（三）激動劑與抑制劑對酶活性的影響
一．目的
了解激動劑與抑制劑對酶活性的影響。
二．原理
酶活性常受一些物質(zhì)影響。在酶反應體系中加入某些物質(zhì)能增高酶活性，亦即加速酶促反應的進行，而另外某些物質(zhì)能降低酶的活性，即減緩甚至完全停止酶促反應的進行。前者稱為激動劑，后者稱為抑制劑。許多電解質(zhì)是酶的激動劑，某些重金屬鹽則是酶的抑制劑。激動劑與抑制劑影響酶活性的需要量是很小的，并常具有特異性。本實驗用氯離子和銅離子，說明對唾液淀粉酶的激動和抑制。
三．操作方法
取試管4支，編號，按表分別加入試劑，搖勻，迅速置于37℃的水浴中，15分鐘后取出，冷卻后分別加入碘液3滴，觀察其顏色變化，并解釋之。
編號
0.25%淀粉液(ml)
pH6.8緩沖液(ml)
H2O(ml)
0.3%Nacl
(ml)
1%CuSO4
(ml)
唾液
(ml)
1
3
1
2
—
—
—
2
3
1
1
—
―
1
3
3
1
—
1
―
1
4
3
1
—
—
1
1
四.注意事項：
1.制備混合唾液，并將唾液混勻。
2.試管正確編號。
3.三種濃度淀粉不要加錯，淀粉用之前混勻。
4.最后加唾液，加完淀粉、唾液后將二者充分混勻，混勻時間不超過一分鐘。
五.思考題：
1. 影響酶促反應的主要因素有哪些？
2. 出現(xiàn)何種結(jié)果，說明酶活性最高；出現(xiàn)何種結(jié)果，說明酶活性最低？
蛋白質(zhì)定量（雙縮脲法）
[復 習]
1. 組成蛋白質(zhì)的基本單位及肽鍵的形成；
2. 雙縮脲及雙縮脲反應；
3. 利用分光光度法測定樣品濃度的方法（標準比較法、標準曲線法、回歸分析法）
[實驗目的]
1. 掌握雙縮脲法測定蛋白質(zhì)的操作方法和原理；
2. 學會制作標準曲線；
3. 正確使用721分光光度計。
[實驗原理]
蛋白質(zhì)分子具有兩個以上的肽鍵，因此在鹼性溶液中能與Cu2+形成紫紅色的配合物，該配合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度呈正比。在相同的實驗條件下配制標準蛋白溶液和樣品液并于540 nm波長下比色，通過標準蛋白液的標準曲線可求出樣品液的蛋白質(zhì)濃度。
[器材與試劑]
一、 器材
1. 試管及試管架； 2. 刻度吸量管； 3. 721分光光度計。
二、 試劑
1. 標準酪蛋白溶液（5mg/ml）
2. 雙縮脲試劑；
3. 樣品液（稀釋10倍的血清）
[步驟與方法]
試劑（ml）/管號
1
2
3
4
5
6
標準酪蛋白溶液
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
蒸餾水
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0
雙縮脲試劑
4
4
4
4
4
4
一、繪制標準曲線： 按下表加試劑
充分混勻后室溫放置30分鐘，觀察各管顏色并以1號管作空白對照，在540nm 波長下進行比色，記錄各管OD值，然后以OD值為縱坐標，酪蛋白含量為橫坐標，繪制標準曲線圖。
二、樣品液的測定：按下表加入試劑
試劑（ml/管號）
1
2
3
樣品液
1
1
0
蒸餾水
1
1
2
雙縮脲試劑
4
4
4
充分混勻后在室溫放置30分鐘，在560nm波長下比色，以3號管為空白對照，測定并記錄兩管OD值，計算平均值，以平均值從標準曲線上查出樣品液中蛋白質(zhì)的含量。
[注意事項]
1. 注意吸量管的正確使用，加樣量一定要準確；
2. 充分混勻各管溶液，以免顯色不均。
3. 樣品液中蛋白質(zhì)含量以質(zhì)量濃度表示（g/升）。
[思考題] 1. 為什么測定未知樣品時要用兩個相同的測定管？
2.不用標準曲線如何測定未知樣品液中的蛋白質(zhì)濃度？
聚丙烯酰胺凝膠電泳
復習電泳的概念、影響電泳的因素。
一、 目的
1：學習聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理
2：掌握聚丙烯酰胺凝膠不連續(xù)圓盤電泳分離血清蛋白質(zhì)的方法。
二、原理
聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠為載體的一種區(qū)帶電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，簡稱Bis)在加速劑N，N，N¢，N¢—四甲基乙二胺(N，N，N¢，N¢—tetramethyl ethylenedia mine，簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，簡稱AP)或核黃素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE)。采用不同濃度的Acr、Bis，產(chǎn)生不同孔徑的凝膠。因此可按分離物質(zhì)的大小，形狀來選擇凝膠濃度。大多數(shù)蛋白質(zhì)在7.5﹪凝膠中能得到滿意的結(jié)果。根據(jù)凝膠系統(tǒng)的均勻性，可分為連續(xù)性凝膠電泳和不連續(xù)凝膠電泳；按凝膠形狀可分為圓盤狀電泳和平板電泳；根據(jù)分離的蛋白質(zhì)是否變性可分為非變性、變性（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）。
聚丙烯酰胺凝膠不連續(xù)圓盤電泳示意圖
（A為正面 B為剖面）
1樣品膠pH6.7
2濃縮膠：是大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1
3分離膠；是小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HC1
4電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液
可見電泳系統(tǒng)是不連續(xù)的。進行電泳時，樣品物質(zhì)被分成狹窄的圓盤狀區(qū)帶，故稱為不連續(xù)圓盤電泳?？筛鶕?jù)三種效應將樣品進行分離：濃縮效應、電荷效應、分子篩效應。
濃縮效應：
⑴：被分離的蛋白質(zhì)分子在濃縮膠（大孔膠）中受到阻力小移動速度快，當走到分離膠（小孔膠）處時，阻力突然加大，移動速度急劇減慢，樣品的分離區(qū)帶變窄，濃度升高。
⑵：通電后，電極槽緩沖液中的甘氨酸進入濃縮膠，遇到pH6.7的凝膠緩沖液，甘氨酸解離度明顯降低，負電荷減少，向正極移動速度變慢，稱為尾隨離子或慢離子；C1-在任何pH下都處于解離狀態(tài)，所以泳動速度最快，稱為前導離子或快離子；而蛋白質(zhì)在pH6.7條件下，大部分以負離子形式存在，帶較多的負電荷，泳動速度居于上述兩者之間。結(jié)果在濃縮膠中，3種離子的泳動速度為C1-＞蛋白質(zhì)離子＞甘氨酸離子。C1-迅速向前移動，在它后面形成一個低離子濃度的低電導區(qū)域，電導與電勢梯度成反比，所以低電導區(qū)就有較高的電勢梯度。這種高電勢梯度迫使蛋白質(zhì)離子和甘氨酸離子在此區(qū)域內(nèi)加速前進，追趕快離子，夾在快慢離子中間的蛋白質(zhì)就在這種追趕過程中被逐漸壓縮成一條狹窄的區(qū)帶。
當樣品進入分離膠后，pH由6.7變?yōu)?.9，甘氨酸的解離度增加，負電荷增多，泳動加快，超過蛋白質(zhì)的泳動速度，此時凝膠中高電勢梯度區(qū)域消失，蛋白質(zhì)樣品在均一的電勢梯度和均一pH條件下，在分離膠中按分子篩效應和電荷效應進行分離。
分子篩效應：蛋白質(zhì)分子越大，阻力越大，移動的速度越慢：蛋白質(zhì)分子越小，阻力越小，移動的速度越快。
電荷效應：蛋白質(zhì)的pI越小，所帶負電荷越多，電泳速度越快；蛋白質(zhì)的pI越大，所帶負電荷越少，電泳速度越慢。
三、儀器與試劑
（一）主要的儀器：電泳儀
圓盤電泳槽
電泳玻璃管
微量注射器
日光燈
（二）試劑
（1）凝膠儲備液
A儲備液：分離膠緩沖液 pH8.9 Tris-HCl緩沖液：
B儲備液：濃縮膠緩沖液 pH6.7 Tris~HCl緩沖液：
C儲備液：分離膠儲備液
D儲備液：濃縮膠儲備液
Ｅ儲備液4% Ap（W/V）
Ｆ儲備液40%蔗糖
G儲備液 核黃素4mg定容到100ml
（2）電泳緩沖液：
pH8.3 Tris-甘氨酸
（3）染色液：考馬斯亮藍溶液
（4）脫色劑：7%冰乙酸
四、方法
1.分離膠（小孔膠）的制備：
將電泳用的玻璃管，洗凈烘干；同時將需要的凝膠儲備液從冰箱中取出，放至室溫備用。
(1)電泳玻璃管的準備：
取一根潔凈的電泳玻璃管，垂直放在青霉素瓶蓋的凹穴中，并用橡皮泥固定在日光燈下，用40%蔗糖溶液密封。
(2) 分離膠的制備：
取一小燒杯，按表1的比例混合，用微量移液器取一定量膠液小心加入
到玻璃管內(nèi)，在加的過程中注意不要混進空氣，當加到液面距離電泳玻璃管上口2cm時停止。加水覆蓋液面，勿使加入的蒸餾水與膠液混合。剛加入水層時在水層和膠面的交界處可見一明顯的折光面，此折光面會逐漸消失，等再次出現(xiàn)時標志分離膠聚合已經(jīng)開始，聚合60分鐘后用濾紙小心吸去表面的水層，切勿破壞膠面的完整性。
2.濃縮膠 (大孔膠)的制備
另取小燒杯，按表2的比例混合，用微量移液器取一定量膠液小心加入到玻璃管至管口約0.5cm處，表面也覆蓋一層蒸餾水。剛加入水層時在水層和膠面的交接處可見一明顯的折光面，此折光面會逐漸消失，等再次出現(xiàn)時標志濃縮膠聚合已經(jīng)開始，聚合30分鐘后除去上面的水層，同樣不要破壞膠面的完整性。吸去水層后用電泳緩沖液漂洗膠面，再用電泳緩沖液注滿至管口，在室溫下放置30分鐘，備用。
3.待分離樣品的制備：
40%蔗糖100μl，血清100μl，溴酚藍200μl混勻備用。
4.加樣：
將制好的膠管裝入電泳槽中調(diào)節(jié)高度并塞緊，防止電泳中產(chǎn)生漏液。然后
分別在電泳槽的上下槽體內(nèi)注入電泳緩沖液，下槽的液面應沒過玻璃管的下管口（注意不要有氣泡存在）和電極絲；上槽的液面應沒過玻璃管口0.5cm。用微量注射器吸取20μl的樣品，小心的加入電泳玻璃管內(nèi)，注意不要讓樣品溢出管口。
5.電泳
將電泳儀和電泳槽連接，負極在上，正極在下，開通電源。開始時電流為1m A/管，待樣品（溴酚藍）進入分離膠后，電流可調(diào)節(jié)到3mA/管，當溴酚藍到凝膠泳出管口時電泳結(jié)束。
6.剝膠
電泳結(jié)束后，取下玻璃管，用帶長針頭的注射器從濃縮膠一端緊貼玻璃管壁緩慢插入針頭，一面注入蒸餾水一面緩慢旋轉(zhuǎn)玻璃管同時推針前進?？克鞯膲毫肆蜐櫥饔檬鼓z和玻璃管的內(nèi)壁分開，待水流從另一端流出時，再慢慢將針頭退出。注意操作中不要把膠條攪碎。退出針頭后將針頭去掉，用注射器向玻璃管中快速注水，將膠條從玻璃管中那個壓出。
7.固定染色
將取下的膠條放入染色液中，室溫固定染色1～2小時 （根據(jù)季節(jié)的變化，調(diào)整染色時間）
8.洗脫
將染色完畢的膠條用脫色液浸泡，中間更換1～2次脫色液并浸泡過夜，
將浮色脫去進行觀察染好色的蛋白帶，膠條可以制成干膠長期保存。
表1：分離膠配方表
凝膠濃度（%）
7.2
雙蒸水（ml）
2
Ａ儲備液（ml）
2
Ｃ儲備液（ml）
4
Ｅ儲備液（μl）
8
總體積（ml）
16
表2：濃縮膠配方表：
膠液濃度（%）
3.1
Ｂ儲備液（ml）
0.5
Ｄ儲備液（ml）
1
G儲備液（μl）
0.5
Ｆ儲備液（ml）
2
總體積
4
五、注意事項
1：Acr和Bis均為神經(jīng)毒劑，對皮膚有刺激作用，操作時應戴手套和口罩
2：玻璃管表面應光滑潔凈，蔗糖溶液封住管底，否則會造成凝膠與玻璃管之間產(chǎn)生氣泡
3：盡量不要破壞膠面，否則樣品區(qū)帶不平整。
六：思考題
1：樣品為什么會在濃縮膠內(nèi)被壓縮成狹窄的一條帶？
2：為什么聚丙烯酰胺凝膠電泳有較高的分辨率？
3：為什么在分離膠和濃縮膠內(nèi)使用不同的催化劑？
應用PCR技術擴增Hbβ基因
PCR(Polymerase Chain Reaction )是一種在體外特異的擴增基因的技術。由Kary.Mullis發(fā)明，該技術大大推動了分子生物學的發(fā)展，被認為是分子生物學發(fā)展的里程碑。Kary.Mullis分享了1993年諾貝爾化學獎。
復習細胞內(nèi)DNA復制條件和過程。
一、目的
1：學習PCR技術的基本原理
2：掌握從全血中制備DNA的方法‘
3：掌握應用PCR擴增Hbβ基因的基本操作
4：熟悉Hb基因結(jié)構
二、原理
1：PCR擴增的原理
聚合酶鏈反應—PCR是一種體外基因擴增技術，是在引物和四種脫氧核苷三磷酸存在下，利用DNA 聚合酶反復作用，使微量的特定片段得以大量擴增的反應過程。
PCR所需的條件：模板
引物：決定擴增產(chǎn)物的特異性
dNTPs
Taq聚合酶
Mg2+
PCR反應過程
變性
94?C
延伸
72?C
退火
Tm-5
每三步為一個循環(huán)，每循環(huán)一次，使模板DNA拷貝數(shù)增加1倍，理論上講，30個循環(huán)后，擴增產(chǎn)物為230拷貝
16 p12
z2 z1 j a a2 a1
2：Hb基因結(jié)構
jb2 e Gg Ag jb1 d b
11p12
本實驗應用PCR技術擴增Hbβ基因上400bp片段
引物序列為 A：5′-AAG GAG ACC AAT AGA AAC TGG GC- 3′
B：5′-TCT CCC CTT CCT ATG ACA TGA AC- 3′
3：PCR產(chǎn)物的鑒定
含溴乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳
DNA在pH8.0電泳緩沖液環(huán)境下帶負電荷，向陽極移動。DNA分子量大小及形狀不同，電泳速度不同。在分子形狀相同的條件下，分子量（bp數(shù)）越大，電泳速度越慢；分子量（bp數(shù)）越小，電泳速度越快；分子量（bp數(shù)）相同，電泳速度相同。所以PCR擴增產(chǎn)物可以根據(jù)分子量（bp數(shù)）的大小進行分離。bp數(shù)相同的DNA集中在同一位置上，與EB結(jié)合成復合物，在紫外燈激發(fā)下，發(fā)出桔紅色的熒光，而形成桔紅色的區(qū)帶，根據(jù)Maker判斷擴增產(chǎn)物的長度。
三、儀器與試劑
（一）主要儀器：PCR儀 潛水式電泳儀 微量移液器 臺式高速離心機
（二） 試劑：裂解液（Tris-HCl TritonX-100） 生理鹽水 雙蒸水
PCR反應液 液體石蠟 載樣緩沖液 電泳緩沖液
四、方法
（一）模板的制備
裂解細胞膜 1：用刻度離心管取全血0.5ml，加裂解液至3ml，顛倒混勻，振蕩60～80次。3,000rpm離心10分鐘。
去血紅素 2：棄上清，加生理鹽水至3ml，振蕩直至沉淀成線狀，3,000rpm離心10分鐘。
3：重復步驟2一次
破壞細胞核膜 4：棄上清，離心管倒置在濾紙上控干，加ddH2O 50μl,用槍頭攪動沉淀，直至沉淀完全溶解。
去除蛋白質(zhì) 5：全部轉(zhuǎn)移至1.5ml 離心 管，沸水鍋中煮沸10分鐘，12,000rpm離心5分鐘，上清液即含有模板DNA。
（二）PCR擴增
反應體系：總體積：25 μl
模板液 5.0μl
緩沖液（含Mg2+） 2.0μl
dNTPs（2.5mM） 1.6μl
引物(10μm) 各0.8μl
Taq DNA聚合酶(2.5U/ml) 0.8μl
ddH2O 14.0μl
循環(huán)參數(shù)：預變性94℃ 2分鐘
變性94℃ 30秒
退火55℃ 30秒
延伸72℃ 45秒
最后延伸72℃ 10分鐘 共35個循環(huán)。
（三）擴增產(chǎn)物的鑒定：
1：制膠 將凝膠托架兩端封閉并水平放置在工作臺上，放上梳子，用1
×TBE緩沖溶液配制2﹪瓊脂糖凝膠液,加熱溶解.注到托架上,待凝固
后撤去兩端封閉插片.
2:加樣 將托架放入電泳槽中,加入1×TBE緩沖溶液使之沒過膠面2
㎜，拔出梳子,向PCR產(chǎn)物中加入載樣緩沖液,混合.將15μl混合物加入
凝膠樣品孔中.載樣緩沖液中有蔗糖和溴酚蘭，可以增加樣品比重,同時
有顏色指示劑的作用。
3:電泳 加樣端接負極,蓋上電泳槽,接通電源,以100V電壓電泳25分鐘.
4:觀察結(jié)果 在紫外燈下觀察電泳結(jié)果.與maker400bp相對應的區(qū)帶為
Hbβ基因400bp片段.
五、注意事項
1：操作的整個過程中避免污染,因為PCR可以將微量的DNA進行擴增而造成假陽性
2：血紅素是酶的抑制劑,必須去除干凈，但在去除過程中注意勿丟失DNA。
3：加ddH2O破壞細胞核膜是關系到本實驗結(jié)果好壞關鍵的一步,一定使核膜破壞充分,充分使DNA釋放。
.
六、 PCR常見的問題及解決辦法
常見的問題
解決辦法
假陰性
模板
模板中蛋白質(zhì)沒有去除干凈
保證模板的數(shù)量及質(zhì)量
模板中含有Taq酶抑制劑
模板在制備過程中丟失過多
反應體系
酶的活性低
選擇高質(zhì)量的酶,盡量減少運輸時間
引物設計不合理及濃度過低
Mg2+濃度過低
合理設計引物,摸索出最佳的引物濃度和Mg2+濃度
循環(huán)參數(shù)設置
變性溫度過低,時間過短
退火溫度過高
提高變性溫度，延長變性時間，降低退火溫度
出現(xiàn)非特異性擴增帶
Mg2+濃度過高
降低Mg2+濃度
降底酶量
提高退火溫度
合理設計引物
引物設計不合理
退火溫度過低
酶量過多
出現(xiàn)片狀拖帶
模板量相對過少
增加摸板量
七、思考題
1：經(jīng)過30個循環(huán),PCR擴增產(chǎn)物是否是230拷貝?
2:體內(nèi)DNA復制過程與體外DNA擴增過程有何不同?
實驗九 轉(zhuǎn)氨基作用（紙層析法）
一．目的
了解動物組織的轉(zhuǎn)氨基作用，學習轉(zhuǎn)氨基反應產(chǎn)物的紙層析鑒定方法。
二．原理
復習：氨基酸在體內(nèi)分解代謝的主要方式是脫氨基作用。脫氨基作用的主要方式有氧化脫氨基、轉(zhuǎn)氨基、聯(lián)合脫氨基及非氧化脫氨基。轉(zhuǎn)氨基是指在轉(zhuǎn)氨酶的催化下，氨基酸的α-氨基與α-酮酸的α酮基的互換反應。轉(zhuǎn)氨酶廣泛分布于動物體的各器官組織中，各種轉(zhuǎn)氨基作用都有專一的轉(zhuǎn)氨酶催化。
本實驗將谷氨酸和丙酮酸與肝勻漿一起保溫，在肝細胞的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化下產(chǎn)生丙氨酸。利用紙層析法鑒定丙氨酸的存在，證明組織內(nèi)的轉(zhuǎn)氨基作用。為了防止底物丙酮酸被組織中其它酶所氧化或還原，可加碘乙酸（或溴乙酸）抑制糖的酵解作用和氧化作用。
設計思路：測定管 對照管
谷氨酸和丙酮酸 谷氨酸和丙酮酸
結(jié)果
丙氨酸和α酮戊二酸 沒有反應產(chǎn)物
用紙層析法鑒定轉(zhuǎn)氨基產(chǎn)物丙氨酸的存在與否。原理為：谷氨酸和丙氨酸是理化性質(zhì)不同的兩種氨基酸，前者為親水性氨基酸，后者為疏水性氨基酸，據(jù)此二者在固定相（水）與流動相（酚試劑）中的分配程度不同，因而流速不同。最后用茚三酮顯色。
三．材料
（一）儀器 試管；離心管；離心機；剪刀及鑷子；培養(yǎng)皿；表面皿；毛細管；噴霧器；吹風機。
（二）試劑
1．0.1%丙氨酸溶液
2．1%谷氨酸溶液
3．1%丙酮酸鈉溶液
4．0.25%碘乙酸溶液
5．0.01 mol/LpH7.4磷酸緩沖液
6．0.1%茚三酮乙醇溶液
7．層析溶劑（酚的飽和水溶液）
四．方法
（一）肝勻漿的制備 取新鮮動物肝臟1克，置研缽中剪碎，加細砂少許，5ml預冷的0.01 mol/LpH7.4磷酸緩沖液，研磨成勻漿。
(二)轉(zhuǎn)氨基反應
1．取小試管2支，分別標明測定和對照，各加肝勻漿10滴，將對照管立即置沸水浴中10分鐘，取出冷卻。
2．兩管各加1%谷氨酸10滴，1%丙酮酸鈉10滴，0.25%碘乙酸5滴，置40℃水浴中保溫30分鐘后取出。
3．兩管各加5%三氯醋酸2滴，置沸水浴中5分鐘（2000rpm），將上清液分別移入同樣編號的小試管中備用。
（三）層析驗證
1．取直徑13cm圓形濾紙一張，用鉛筆過圓心作兩條相互垂直的線，在每條線上距圓心1cm處打點作記，作為點樣處，并分別在其邊緣標上測、谷、對、丙字樣，見圖9。
2．用毛細玻璃管分別蘸取測定液、1%谷氨酸溶液、對照液、0.1%丙氨酸溶液各一小滴，在濾紙上相應點樣處點樣2μl，點樣斑點的直徑不超過3mm。
3．用大頭針在濾紙圓心扎一小孔（約1mm直徑），另取濾紙條（0.5×2.5cm），卷成筒狀，捻緊如燈芯，從濾紙上相應點樣背面插入小孔，突出濾紙面約1cm。
4．加約2.5ml層析溶劑于直徑為5cm的表面皿中，表面皿放在直徑為10cm培養(yǎng)皿正中，將濾紙平放在培養(yǎng)皿上，使濾紙芯浸入層溶劑，取另一同樣大小的培養(yǎng)皿反向蓋上。層析溶劑沿濾紙芯上升到濾紙，并向四周擴散，待溶劑前沿距濾紙邊緣1.5cm時，即可取出（層析時間約50分鐘）。用鉛筆劃出溶劑前沿后，用吹風機或電爐烘干。
5．顯色 將濾紙平放于培養(yǎng)皿上，噴霧0.1%茚三酮乙醇溶液，再用吹風機或電爐烘干。觀察層析出現(xiàn)的弧形紫色斑，并用鉛筆描出。計算各色斑的Rf值。
注意事項：操作中接觸濾紙前要洗手擦凈，并盡量避免手與濾紙中間部位接觸。
思考題
為什么對照管是一個色斑，而測定管是兩個色斑？這些色斑分別代表什么物質(zhì)？又是如何證明的？
實驗十 核酸的提取與鑒定——大白鼠肝DNA的提取與鑒定（8學時）
一、目的
掌握從動物組織中DNA基本原理和方法，了解利用電泳技術分離、鑒定核酸的原理和方法。
二、原理
真核生物DNA主要以核蛋白形式存在于細胞核中，因此制備DNA必須先粉碎組織，裂解細胞膜和核膜，使核蛋白釋放，在除去蛋白質(zhì)、脂類、糖類和RNA等物質(zhì)，得到純化的DNA。在本實驗的提取DNA反應體系中，SDS（十二烷基磺酸鈉）破壞細胞膜和核膜，并使蛋白質(zhì)變性，將核蛋白中的DNA與蛋白質(zhì)分開，EDTA及SDS抑制細胞中的DNA酶的活性。用酚、氯仿抽提的方法進一步除去蛋白質(zhì)，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀除凈小分子化合物。提取出的DNA制品進一步用含溴乙錠的瓊脂糖凝膠電泳加以鑒定。
三、材料
（一）儀器
研缽；研缽棒；刻度離心管；普通離心機；小試管；Ep管
（二）試劑
1、生理鹽水
2、裂解緩沖液
3、苯酚：氯仿混合液（1：1）
4、無水乙醇
5、70％乙醇
6、TE緩沖液
7、溴酚藍載樣液
8、溴乙錠溶液
9、TBE緩沖液
四、操作步驟：
1、處死大白鼠，迅速取出大白鼠肝臟，用生理鹽水洗去附著血液，用濾紙吸干血水后稱量0.5g肝實質(zhì)組織放于研缽中。
2、研缽中加入1ml裂解緩沖液、少量石英砂，研磨至勻漿，再加入2ml繼續(xù)研磨至勻漿。
3、取刻度離心管一支，加肝勻漿至1.0ml，再加入等體積苯酚：氯仿混合液抽提，每次抽提以中等大小的力來回振蕩5min，然后離心3000r/min，10min，水相吸入另一干凈的小試管中，抽提重復3次『注1』。
4、往乘有上水相的小試管中加入2.5倍體積的冷無水乙醇，輕輕混勻，此時可見有白色絮狀沉淀，此即DNA粗制品。
5、將試管中的上清液倒出，保留沉淀。用70％的乙醇洗滌沉淀2次，洗滌時動作要輕柔，同上法棄上清保留沉淀『注2』。
6、加入0.25mlTE緩沖液溶解沉淀。
7、取30ml沉淀溶解液放入Ep管中。
8、向Ep管中加入溴酚藍載樣液5ml，混勻后即為鑒定所用樣品。
9、取瓊脂糖0.3g，TBE緩沖液15ml加入錐形瓶中，加熱錐形瓶使瓊脂糖充分熔解后，加入10ml溴乙錠，混勻后將膠液倒入已放置樣孔梳的膠板上。
10、待膠板凝好后拔去樣孔梳，取15ml樣品液加入樣孔槽中。
11、將加好樣品液的膠板放入乘有TBE緩沖液的電泳槽中，樣孔槽位于陰極側(cè)，蓋好電泳槽蓋后通電，調(diào)節(jié)電壓100V電泳40-60min。
12、泳畢，拿出膠板，在紫外光燈下觀察結(jié)果。
『注1』吸水相時不要將界面上的變性蛋白質(zhì)混入，抽提3次后一般有機相和水相界面上的變性蛋白質(zhì)極少，肉眼基本看不見，若變性蛋白質(zhì)仍較多，可增加抽提次數(shù)。實驗中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短，并燒成鈍口。
『注2』最后一次棄上清時，盡可能去盡上清。
思考題：
1、DNA的定量可采用哪些方法？
實驗十一 醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)并定量
一、目的
1、了解分離純化蛋白質(zhì)，并進行蛋白質(zhì)定量的原理及方法
2、了解利用醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)并定量操作方法。
二、原理
血清中各種蛋白質(zhì)的等電點大都低于pH7.0，在pH8.6巴比妥緩沖液中，它們均電離成陰離子，在電場中向陰極泳動。由于各種蛋白質(zhì)在同一pH環(huán)境中所帶電荷多少及分子大小不同，所以在電場中的泳動速度不同。一般所來，蛋白質(zhì)分子量小而帶電荷多者，泳動速度快，分子量大而帶電荷少者泳動速度慢，因此可以利用其泳速不同將之分開。
血清中含有清蛋白、α－球蛋白、β－球蛋白、γ－球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組成、分子量、等電點及形狀不同，在電場中的遷移速度不同（見下表）。
人血清蛋白質(zhì)的分類，等電點，分子量及遷移率
血清蛋白質(zhì)
等 電 點
（PI）
分 子 量
（MW）
遷移率μ
（cm2/s.v）
白蛋白（A）
4.8
68500
5.9×10-5
α1球蛋白（α1-G）
5.06
>10萬
5.1×10-5
α2球蛋白（α2-G）
5.06
>10萬
4.1×10-5
β球蛋白（β-G）
5.12
>10萬
2.8×10-5
γ球蛋白（γ-G）
6.85-7.3
>10萬
1.0×10-5
本實驗用醋酸纖維素薄膜作為支持物進行電泳，分離各種血清蛋白。正常人血清在pH8.6的緩沖體系中電泳，染色后可顯示5條區(qū)帶，從陽極到陰極依次為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白。
醋酸纖維素素薄膜是由二乙酸纖維素加工制成，具有均一的泡沫結(jié)構，厚度僅120mm。醋酸纖維素素薄膜作為是電泳支持體有以下優(yōu)點：①電泳后區(qū)帶界限清晰；②通電時間較短（二十分鐘至一小時）；③它對各種蛋白質(zhì)（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都幾乎完全不吸附，因此拖尾現(xiàn)象；④對染料也沒有吸附，因此不結(jié)合的染料能完全洗掉，無樣品處幾乎完無色。它的電滲作用雖高但很均一，不影響樣品的分離效果，由于醋酸纖維素素薄膜水量較低，因此必需在密閉的容器中進行電泳，并使用較低有電流避免蒸發(fā)。
由于醋酸纖維素素薄膜作為支持物進行蛋白電泳，具有以上優(yōu)點。故本實驗最終采用此種方法分離血清蛋白質(zhì)并加以定量。
三、材料
（一）器材
醋酸纖維素薄膜（2×8cm），培養(yǎng)皿，點樣器，電泳儀，電泳槽，粗濾紙，鑷子
（二）材料
新鮮血清（未溶血）
（三）試劑
1、巴比妥緩沖液（pH 8.6，離子強度0.06）：巴比妥1.66g, 巴比妥鈉12.76g，加水至1000ml。置4℃冰箱保存，備用。
2、染色液：氨基黑10B 0.5g, 甲醇50ml, 冰醋酸10ml，蒸餾水40ml，混勻。
3、漂洗液：含95％乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸餾水50ml，混勻。
4、透明液：冰醋酸25ml，無水乙醇75ml，混勻。
四、方法
（一）準備電泳槽
電泳槽內(nèi)放入巴比妥緩沖液。電泳槽應密閉使蒸汽飽和，避免水分蒸發(fā)。將電泳槽與電泳儀接好。
（二）點樣
1、浸泡：用鑷子取醋酸纖維素薄膜『注1』1張（識別光澤面和無光澤面），無光澤面朝下小心平放在盛有緩沖液的培養(yǎng)皿中，浸泡30min左右（浸至無白斑）。
2．點樣『注2』：將浸透的薄膜從緩沖液取出（無光澤面朝上），用濾紙吸干多余的液體。點樣時，先在點樣器上均勻地沾上血清，在距陰極端1.5cm處將點樣器輕輕地印在薄膜上，使血清完全滲透至薄膜內(nèi)，形成一定寬度、粗細均勻的直線后迅速離開（見圖）。
醋酸纖維素素薄膜規(guī)格及點樣位置示意圖（虛線處為點樣位置）
（三）電泳：電泳槽架上分別用4層紗布連接電泳槽。將點樣后的薄膜條置于紗布上，點樣面朝下，點樣端置于負極側(cè)，薄膜條應平直，并與紗布緊貼。蓋好電泳槽蓋，靜止平衡5min后通電，調(diào)節(jié)電壓10-15V/cm，電流0.5mA/cm，電泳30-60min。
（四）染色與漂洗：
1、電泳完畢后將薄膜取下, 放在染色液中浸泡1-2min。
2、漂洗：將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數(shù)次，直至背景藍色脫凈。取出薄膜放在濾紙上，晾干。
圖4.7血清蛋白醋酸纖維素素薄膜電泳圖譜示意圖
（五）定量
1、洗脫比色：將各蛋白質(zhì)區(qū)帶仔細剪下，分置各試管中，另從空白背景剪塊平均大小的膜條置于空白管中。各管加入0．4mol／lNaOH4ml,于37℃水浴20分鐘(不時振蕩)，待顏色脫凈即用波長620nm比色，以空白管調(diào)零讀m各管吸光度。
2、計算：
吸光度總和(T)=A+α1+α2+β+γ(吸光度)
血清蛋白組分的相對百分數(shù)：
A % = A/T*100%
α1 % = α1/T*100%
α2 % = α2/T*100%
β % = β%/T*100%
γ % = γ%/T*100%
注意事項
『注1』 市售醋酸纖維素素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的關鍵之一。若飄浮于液面的薄膜在15－30s內(nèi)迅速潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用于電泳。
『注2』 點樣時，應將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免引起樣品擴散。但不宜太干，否則樣品不易進入膜內(nèi)，造成點樣起始點參差不起，影響分離效果。點樣時，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。
思考題
1、為什么需將血清樣品點在薄膜條的負極端？
2、如果是血漿，結(jié)果有何不同？
異常血紅蛋白篩查
[復 習]
1. 血紅蛋白及其組成；
2. 異常血紅蛋白；
3. 影響電泳速度的因素。
[實驗目的]
1. 學習血紅蛋白電泳分離方法；
2. 能辨認正常人和異常血紅蛋白的電泳圖譜；
[實驗原理]
血紅蛋白是一種結(jié)合蛋白質(zhì)，由血紅素和珠蛋白組成。正常人所含珠蛋白的多肽鏈有a、b、d 、e、g和z六種。這六種肽鏈的基因在人體發(fā)育的不同階段表達狀況不一。正常成人紅細胞中有三種血紅蛋白即HbA、 HbA2 和 HbF。HbA（a2b2）是正常成人紅細胞中的最主要的血紅蛋白，占紅細胞內(nèi)血紅蛋白總量的96%以上，PI=6.7。 HbA2(a2d2)是正常成人紅細胞中的次要成分，占2~3% 左右，其PI>6.7。 HbF(a2g2)為胎兒血紅蛋白，胎兒出生后六個月急劇持續(xù)下降至血紅蛋白總量的1%以下，其PI接近 6.7。各種血紅蛋白在pH8.5的緩沖液中均帶負電荷在電場中都向陽極移動，但因等電點不同所帶電荷數(shù)目不同而有不同的電泳速度。HbA因其所帶電荷最多故向陽極泳動速度最快，又因其含量最多區(qū)帶顏色最深。其后有一較淺的區(qū)帶為HbA2, HbF與HbA的等電點接近，通常與HbA分不開
異常血紅蛋白是指由于基因突變而導致結(jié)構異常的紅蛋白。異血紅蛋白具有與正常血紅蛋白不同的電泳行為，因此用電泳的方法可以將其檢出。例如HbS是一種由b-鏈第6位的谷氨酸被纈氨酸所替換而形成的異常血紅蛋白，此變異體比HbA少帶兩個負電荷，因此，向陽極移動的速度比HbA慢,出現(xiàn)于HbA與HbA2之間．
分析血紅蛋白的電泳方法有許多，如濾紙電泳.淀粉膠電泳及聚丙烯酰胺凝膠電泳等.但異常血紅蛋白篩查最常用的還是醋酸纖維薄膜電泳法.因為醋酸纖維薄膜做支持體電泳操作簡便,電泳速度快,分辨力強區(qū)帶集中而且對染料不吸附,容易定量.用醋酸纖維素薄膜電泳篩查異常血紅蛋白的檢出率為1~2%o.
[器材與試劑]
1. 器材 電泳儀 電泳槽 醋酸纖維素薄膜
2. 試劑
(1) 浸泡醋酸纖維膜TBE緩沖夜(pH8.5);
(2)電泳槽硼酸緩沖液(pH8.6);
(3)麗春紅染色液;
(4)漂洗液.
[步驟與方法]
1. 浸膜: 將醋酸纖維素薄膜(2´8cm)膜面向下放入浸膜液中,浸透后用眼科鑷子壓入液面底部
2. 采血:碘伏消毒耳垂部,用一次性采血針采血,并將血液吸在兩次對折的濾紙尖部;
3. 加樣: 將浸泡好的醋酸纖維素薄膜膜面向上放在濾紙上,用濾紙吸去多余的液體,在距一側(cè)1.5cm處用沾血的濾紙.涂圓點狀（直徑約0.2cm）或線狀;
4. 電泳: 將加好樣的醋酸纖維素薄膜膜面向下放入電泳槽中的緩沖液紗布上，加樣端放在負極,靜置2分鐘后開啟電源,調(diào)電壓200伏,電泳40分鐘.
5. 電泳結(jié)束后,關掉電源,觀察電泳圖譜,并記錄紅色區(qū)帶（幾條）及分布（位置）情況.
6. 染色: 將醋酸纖維素薄膜放入染色液中2分鐘,然后轉(zhuǎn)入漂洗液中洗至背底呈白色,再觀察結(jié)果.
（—）
（+）
[結(jié)果判斷] 正常人全血血紅蛋白電泳圖譜
1. 未染色電泳圖譜
HbA
HbA2
（—）
（+）
2. 染色后電泳圖譜
含異常血紅蛋白的樣品：應在未染色前觀察，除正常成分外，在任何位置出現(xiàn)的不經(jīng)染色的紅色區(qū)帶，均可記為有異常血紅蛋白存在。異常血紅蛋白常以HbA為標準，分為快泳血紅蛋白和慢泳血紅蛋白。
[注意事項]
1. 醋酸纖維素膜一定要浸透（無白色斑點），加樣前從浸膜液中取出，既要吸去多余的液體還不能使膜太干，否則都會影響電泳結(jié)果。
2. 加樣時注意要加在醋酸纖維素的膜面，電泳時也要膜面向下放到電泳槽中的緩沖液紗布上。
[思考題]
1. 正常成人紅細胞中的主要血紅蛋白是什么？
2. 為什么HbA的電泳速度比HbA2 快？
3. a-珠蛋白肽鏈第30位的谷氨酸被谷氨酰胺所替換，由此構成的血紅蛋白會在電泳圖譜中何處出現(xiàn)？
