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為探究小鼠胚胎期發(fā)育過程中從前體細(xì)胞至形成特定體感神經(jīng)元亞型的這一分化過程，本文利用了基于Smart-seq2方法的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，對(duì)來自小鼠E9.5、E10.5、E11.5及E12.5期DRG（背根神經(jīng)節(jié)）中的神經(jīng)元前體細(xì)胞及不同亞型的早期神經(jīng)元進(jìn)行分析。

圖1：體感系統(tǒng)發(fā)育過程的單細(xì)胞測(cè)序及擬時(shí)分析

結(jié)果展現(xiàn)出發(fā)育中的時(shí)間軌跡以及從前體細(xì)胞至特定類型神經(jīng)元的過程。RNA豐度、擬時(shí)分析等揭示了從NCCs（神經(jīng)嵴細(xì)胞）起始的分化方向，展現(xiàn)了分化過程中主要的分支點(diǎn)，將整個(gè)發(fā)育過程分為兩個(gè)主要的分支：分支A，分支B，并將發(fā)育過程按照是否處于細(xì)胞周期中分為兩個(gè)階段，且與是否為神經(jīng)元的分類標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果一致。隨后又通過發(fā)育軌跡中不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄因子及受體標(biāo)志物繪制了發(fā)育不同節(jié)點(diǎn)基因表達(dá)特征的分支圖，展現(xiàn)了早期體感神經(jīng)元的主要類型。

為解決神經(jīng)發(fā)生過程中，細(xì)胞是如何從一個(gè)階段過渡到另一個(gè)階段的，以及在神經(jīng)元發(fā)生的兩個(gè)主要波浪中，基因表達(dá)程序是如何介導(dǎo)細(xì)胞分化為特定亞型的問題，作者將所有發(fā)育軌跡中的細(xì)胞分為了不同的細(xì)胞簇，并首先針對(duì)神經(jīng)發(fā)生初期的細(xì)胞簇，研究了不同簇間發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)改變情況，如神經(jīng)板邊緣基因（Zic, Msx）、NCCs特異性基因（Sox9, Foxd3, Ets1）、BCCs（boundary cap cells）特異性基因（Egr2, Ntn5, Prss56, Hey2, Wif1）等。并最終將1-3簇細(xì)胞分別定義為早期NCCs（分支A）、晚期NCCs（lNCCs）以及lNCCs/BCCs（分支B）。

圖2：神經(jīng)嵴細(xì)胞群體及感覺神經(jīng)元發(fā)生波浪

分析表明，當(dāng)來自lNCCs/BCCs的神經(jīng)前體細(xì)胞只表達(dá)Neurog1時(shí)，不能根據(jù)其特定的NGN表達(dá)情況來區(qū)分兩個(gè)主要的神經(jīng)發(fā)生軌跡（分支A，分支B）。以及在這兩個(gè)分支中，前體細(xì)胞從Neurog2⁺過渡至Neurog1⁺狀態(tài)，并且大量細(xì)胞同時(shí)表達(dá)這兩種轉(zhuǎn)錄物。

為驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，作者又利用相應(yīng)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明，大多數(shù)體感神經(jīng)元前體細(xì)胞依次表達(dá)Neurog2和Neurog1，并且存在兩個(gè)基因共同表達(dá)的中間狀態(tài)，表明在產(chǎn)生第一波或第二波神經(jīng)發(fā)生的神經(jīng)元前體細(xì)胞中，神經(jīng)元分化適時(shí)地傾向于需要NGN2或NGN1。

為探究有髓鞘及無髓鞘的神經(jīng)發(fā)生過程中關(guān)鍵分子決定物差異，作者對(duì)A、B兩分支間的神經(jīng)發(fā)生軌跡做了比較，發(fā)現(xiàn)了這兩條軌跡間存在著的多種相同或不同的共表達(dá)基因簇，并找到了與細(xì)胞命運(yùn)決定相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(TFs)。

圖3：神經(jīng)嵴細(xì)胞群體及感覺神經(jīng)元發(fā)生波浪

研究發(fā)現(xiàn)，在Sox10表達(dá)后，Neurog1在Neurog2后表達(dá)，隨后是Neurod4、Pou4f1(BRN3A)、Neurod1、Isl1。在這兩種主要軌跡間表達(dá)一致的基因則代表了感覺神經(jīng)元分化的基因表達(dá)程序。同時(shí)A、B兩分支的特異性表達(dá)基因也代表了有髓鞘與無髓鞘進(jìn)程中的差異，如在B分支中的Nfia、Gli2、Neurod2，表明A、B分支間不同的TFs。

總的來說，有髓與無髓神經(jīng)元的分化是通過TFs、染色質(zhì)修飾物（如Prdm12和Prdm8）和信號(hào)分子所調(diào)控的不同中間狀態(tài)產(chǎn)生的，并推測(cè)局部的動(dòng)態(tài)信號(hào)變化可能會(huì)影響并使神經(jīng)前體細(xì)胞偏向于分支A或分支b。對(duì)于這些基因的GO分析也表明，神經(jīng)元的發(fā)生波浪是由神經(jīng)元前體細(xì)胞內(nèi)的成分改變與重組造成的。

這一部分中，作者對(duì)主要神經(jīng)元亞型的出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄組水平上的體現(xiàn)進(jìn)行了研究，重點(diǎn)分析了分支A中最下游的三個(gè)分支，探索可能驅(qū)動(dòng)細(xì)胞命運(yùn)選擇和命運(yùn)偏向的早期基因。分支A可產(chǎn)生三種機(jī)械敏感性細(xì)胞類型，即RUNX3/TRKC本體感受器以及TRKB/RET、TRKB兩種機(jī)械刺激感受器亞群。分叉點(diǎn)前和分叉后階段分別揭示了導(dǎo)致命運(yùn)選擇及其維持的轉(zhuǎn)錄變化動(dòng)態(tài)。研究確定了表征分叉點(diǎn)前后階段的基因模塊，對(duì)應(yīng)命運(yùn)選擇和命運(yùn)決定過程。擬時(shí)分析結(jié)果顯示，兩個(gè)基因模塊最初在單個(gè)細(xì)胞中共同表達(dá)，然后逐漸相互排斥，走向與命運(yùn)選擇偏好相關(guān)的分叉點(diǎn)。

圖4：分化軌跡中基因模塊表達(dá)對(duì)細(xì)胞命運(yùn)選擇的決定性作用

圖5：早期的命運(yùn)決定基因或模塊在細(xì)胞命運(yùn)選擇過程中表現(xiàn)出的模塊內(nèi)協(xié)同或競爭

GO分析表明，有絲分裂后未成熟神經(jīng)元的重構(gòu)可能影響細(xì)胞外部部分的蛋白質(zhì)組成，推測(cè)是由于與環(huán)境的不同相互作用。針對(duì)TFs活性的研究發(fā)現(xiàn)，TFs在兩種命運(yùn)中都有差異表達(dá)，且RUNX3在細(xì)胞命運(yùn)選擇調(diào)控中的作用早于本體感受器和機(jī)械感受器神經(jīng)元之間的分叉點(diǎn)，并表明在命運(yùn)決定之前競爭程序存在共同激活。對(duì)Ntrk2和Ntrk2/Ret之間的命運(yùn)選擇過程中早期和晚期的基因模塊進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它們的命運(yùn)偏向于Ntrk2或Ntrk2/Ret群體。

總的來說，通過擬時(shí)軌跡，作者發(fā)現(xiàn)了特異性和一致性基因模塊的表達(dá)爆發(fā)。這些數(shù)據(jù)表明，有髓鞘細(xì)胞譜系早期細(xì)胞內(nèi)的這些早期模塊之間存在競爭，這可能導(dǎo)致在實(shí)際分裂發(fā)生之前，細(xì)胞將來的命運(yùn)就已經(jīng)偏向于機(jī)械感受器或本體感受器等不同亞群，且在命運(yùn)決定之前競爭偏倚程序可共同激活。因此，保留下來的程序?qū)⑴c細(xì)胞命運(yùn)的后續(xù)過程。

為研究早期基因模塊中的TFs如何影響體內(nèi)的命運(yùn)選擇，作者重點(diǎn)研究了RUNX3的作用，并發(fā)現(xiàn)RUNX3在本體感受器/機(jī)械刺激感受器軌跡分叉點(diǎn)前階段的部分感覺神經(jīng)元和分叉后的所有本體感受器中均有表達(dá)。

圖6：早期分支特異性基因RUNX3對(duì)于細(xì)胞分離前命運(yùn)偏向的關(guān)鍵作用

研究結(jié)果表明，在RUNX3缺失的情況下，細(xì)胞命運(yùn)向機(jī)械刺激感受器的方向轉(zhuǎn)變。為了進(jìn)一步研究潛在的細(xì)胞命運(yùn)變化，作者構(gòu)建了可用于追蹤和具體分析RUNX3譜系神經(jīng)元的小鼠模型，并發(fā)現(xiàn)在缺乏Runx3的GFP+細(xì)胞中，大量與促進(jìn)細(xì)胞命運(yùn)確定為本體感受器方向相關(guān)的基因顯著下調(diào)（即Runx3、Fam19a4、Cntnap2、SHIA6、Anxa2），而一些與細(xì)胞命運(yùn)確定為機(jī)械刺激感受器相關(guān)的基因則顯著上調(diào)（即Ntrk2、Gfra2、Pou6f2、Gpm6a、Plxna2），提示在感覺神經(jīng)元多樣化過程中，在細(xì)胞命運(yùn)決定之前存在競爭性的遺傳程序。

有趣的是，這些分化程序不僅激活特定的一個(gè)細(xì)胞命運(yùn)相關(guān)基因，而且還抑制另一個(gè)命運(yùn)的基因程序表達(dá)。研究數(shù)據(jù)說明了基因表達(dá)動(dòng)態(tài)在本體感受器和機(jī)械刺激感受器命運(yùn)選擇分叉點(diǎn)之前和分叉點(diǎn)處的重要作用，不同命運(yùn)決定因素之間的競爭程序可在促進(jìn)細(xì)胞命運(yùn)向某一方向進(jìn)行的同時(shí)抑制另一個(gè)方向的表達(dá)進(jìn)程。

本文最后一項(xiàng)研究是定義分化程度最高的細(xì)胞簇的具體特征，即軌跡的端點(diǎn)。基于端點(diǎn)各細(xì)胞簇表達(dá)的共同基因，文章揭示了可能存在的一個(gè)定義感覺譜系的感覺神經(jīng)元模塊，該模塊將由祖細(xì)胞傳遞給所有子細(xì)胞。

研究數(shù)據(jù)顯示，端點(diǎn)神經(jīng)元類型之間的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性相對(duì)較少且GO類別的重疊度高，這表明雖然分化軌跡顯示出不同的中間路徑，但當(dāng)它們成熟為不同的神經(jīng)元類型時(shí)，它們似乎又在轉(zhuǎn)錄水平上重新聚合。作者在分支A和分支B的軌跡終點(diǎn)的簇之間識(shí)別了大約120-180個(gè)差異表達(dá)的基因，且這些基因中的一些是在發(fā)育后期發(fā)現(xiàn)的亞群特異性標(biāo)記，并發(fā)現(xiàn)可在中間細(xì)胞狀態(tài)下抑制特定基因，從而產(chǎn)生具有特定功能特性的神經(jīng)元類型。

圖7：不同發(fā)育節(jié)點(diǎn)主要類型神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄組特性

為證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)，作者研究了在E12.5時(shí)是否可以檢測(cè)到共同的模塊基因，以及它們是否可以在早期發(fā)育階段被發(fā)現(xiàn)并在整個(gè)生命周期中被保存。在E12.5，作者發(fā)現(xiàn)44個(gè)基因從有絲分裂的神經(jīng)元祖細(xì)胞傳遞到所有有絲分裂后的感覺神經(jīng)元，這些基因編碼決定神經(jīng)傳遞表型和神經(jīng)元特有的形態(tài)學(xué)特征。

重要的是，這些基因在多樣性分支的各個(gè)層次上都得到了保留，并且在成體感覺神經(jīng)元中仍然可以發(fā)現(xiàn)。因此，作者發(fā)現(xiàn)了一組可以定義從感覺神經(jīng)元祖細(xì)胞到成體感覺神經(jīng)元的整個(gè)感覺譜系的基因。

圖8：文章主要發(fā)現(xiàn)總結(jié)

這篇文章提供了一個(gè)神經(jīng)發(fā)生和感覺神經(jīng)元發(fā)育的詳細(xì)轉(zhuǎn)錄路線圖，捕捉了參與細(xì)胞命運(yùn)選擇的分子事件的動(dòng)態(tài)，并通過感覺神經(jīng)元的分叉和譜系進(jìn)行了擴(kuò)展。并確定了基因模塊表達(dá)的動(dòng)態(tài)爆發(fā)導(dǎo)致了譜系內(nèi)分支點(diǎn)的產(chǎn)生。

識(shí)別使感覺神經(jīng)元產(chǎn)生特定命運(yùn)的基因模塊可能有助于培養(yǎng)多能干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞技術(shù)，并提高針對(duì)特定神經(jīng)元群體進(jìn)行的研究，以推進(jìn)基礎(chǔ)研究、組織再生或篩選抗神經(jīng)退行性變或神經(jīng)變性藥物疼痛障礙的發(fā)展。

此外，這可能有助于破譯TFs的組合密碼，并在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)喪失的情況下操縱，使細(xì)胞再次恢復(fù)到健康狀態(tài)。

Faure, L., Wang, Y., Kastriti, M.E. et al. Single cell RNA sequencing identifies early diversity of sensory neurons forming via bi-potential intermediates. Nat Commun 11, 4175 (2020).

https://doi.org/10.1038/s41467-020-17929-4

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