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Prostaglandin E2 isessential for efficacious skeletal muscle stem-cell function, augmenting regenerationand strength

【文獻來源】Atv H, Palla A R, Blake M R, et al. Prostaglandin E2 is essential for efficacious skeletal muscle stem-cell function, augmenting regeneration and strength. Proc Natl Acad Sci U S A, 2017, 114(26):201705420.

肌肉損傷時PGE2的劇增加速MuSCs增殖

       由于細胞損傷和再生過程是一個復(fù)雜的炎癥反應(yīng)過程，因此作者推測可能存在著某個炎性因子在肌肉再生中扮演重要作用。首先作者檢測了從未受傷的肌肉組織中分離MuSCs（Fresh MuSCs），分離培養(yǎng)2d的（Cultured MuSCs）以及原代肌成纖維細胞（Myoblasts GM）和分化的肌纖維細胞（Myoblasts DM）中PGE2的受體Ptger4 (EP4)表達水平（圖1A，肌肉干細胞MuSCs可發(fā)育分化為成肌細胞(myoblasts)，后者可互相融合成為多核的肌纖維，形成骨骼肌最基本的結(jié)構(gòu)。這個結(jié)果告訴了我們細胞分化程度越高對PGE2受體表達水平越低，也就是說對PGE2敏感性越差，這就奠定了PGE2可能在肌肉是損傷時候其目的作用細胞主要是MuSCs，因此本文也就圍繞MuSCs展開研究，隨后作者通過在虎蛇毒素（notexin）或低溫損傷肌肉后3d檢測到PGE2及其合成酶Ptges和 Ptges2的高表達（1B,C,D）。由于PGE2產(chǎn)生可能不僅僅只在MuSCs，作者檢測還有肌成纖維細胞也表達,使用非甾體抗炎藥NSAIDS（背景知識：（COX-2為同工酶，是誘生型酶。COX-2在正常組織細胞內(nèi)的活性極低，當細胞受到炎癥等刺激時，其在炎癥細胞中的表達水平可升高至正常水平的10-80倍，引起炎癥部位PEG2、PGI2和PGE1含量的增加，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和組織損傷。非甾體抗炎藥NSAIDS是通過抑制COX，阻斷花生四烯酸轉(zhuǎn)化為PGs，從而發(fā)揮其抗炎、止痛和解熱作用）吲哚美辛抑制PGE2表達（1E，因為雖然在肌肉損傷時候可能成纖維細胞也參與但是基于前面的結(jié)果，作者排除掉了成纖維而選擇MuSCs來研究，此處作為一個補充說明）。同時作者還發(fā)現(xiàn)PGE2表達峰值在短時間內(nèi)是和肌肉損傷后MuSCs的延伸和促炎因子表達密切相關(guān)。（這些實驗只為證實：肌肉損傷=局部炎癥反應(yīng)=PGE2高表達）

       為了探討PGE2是否對MuSCs有直接促進增殖作用，作者發(fā)現(xiàn)，PGE2能夠顯著促進增殖（1F），為了進一步證實，隨后血清中去除PGE2后增殖效果消失，加上后又回復(fù)這種增殖效果（這就是本文反復(fù)提到的gain- or loss-of-functionexperiments，體現(xiàn)實驗嚴謹?shù)牡胤剑?。隨后，為了進一步支撐這個結(jié)果，作者進行了下面一系列實驗：1采用延時顯微成像系統(tǒng)記錄了單個MuSCs在PGE2干預(yù)下的行蹤（1G-1K），發(fā)現(xiàn)PGE2使得細胞更加活躍了；2 Clonalassays（具體沒去查是個什么實驗，但是可以看出這也是一個測增殖的實驗）顯示PGE2加速MuscS的更替（也就是說細胞生長更快的意思），而這一切是通過加快MuSCs有絲分裂，從而促進延伸（1G,1H）；3.PGE2處理組細胞的尺寸更大（1K）。

        這么多實驗就是證實一件事：PGE2促進增殖，（注意：本文增殖實驗有哪些實驗方法?。?/strong>

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PGE2促進MuSCs細胞再生

        這部分是體內(nèi)實驗，用來支撐結(jié)果1的結(jié)論的。作者從轉(zhuǎn)基因小鼠上分離自帶熒光片段和熒光素梅的MuSCs（GFP/luc），隨后將這些細胞交聯(lián)PGE2注射到損傷的脛骨前肌中（TA）；結(jié)果顯示當然有效（感興趣的可以了解下BLI ASSAY具體是個什么評估實驗）：具體：把分離的帶熒光標記的MuSCs注射后觀察是否在損傷處穩(wěn)定表達，隨后進行2次損傷（黑蛇毒素和冷凍損傷）檢測MuSCs體內(nèi)熒光表達，他的多少可以反映MuSCs在體內(nèi)的數(shù)量，也就是說PGE2處理后的在體內(nèi)熒光值多些，意味著PGE2處理的MuSCs在損傷時候增殖更快，更有利于再生（2A）。同樣，直接注射PGE2也顯著促進損傷區(qū)域MuSCs的增殖（2B）（背景知識：作者選擇PAX7來標記增殖的MuSCs，通過檢測PAX7來定量）

背景知識：   Pax7 是在衛(wèi)星細胞中表達的標志性基因，肌肉衛(wèi)星細胞，又稱為肌肉干細胞，決定著骨骼肌的生長和再生。Pax7 和 MRFs （生肌決定因子）家族成員相互作用共同參與肌肉的生成和分化過程。其中，肌纖維形成過程主要包括活化、分化和融合三個階段。

C,D結(jié)果說明PGE2使得再生增強，E:PGE2使得細胞尺寸變大，F(xiàn),G是作者為了排除內(nèi)源性的MuSCs干擾，采用PAX7基因敲除鼠，在TAM（他莫昔芬）注射后，即條件性敲除PAX7也就是把內(nèi)源性的MUSCs排除，再外源注射MUSCS，再BLIassay評估（G），發(fā)現(xiàn)，熒光值還是增強。上述結(jié)果進一步證實，PGE2確實可以通過促進MUSCS增強肌肉組織再生能力。

PEG2是通過EP4受體介導(dǎo)的信號來促進MUSCS增殖和融合

        結(jié)果1和結(jié)果2是給足了證據(jù)證實PGE2可以促進再生，那么接下來就是討論背后機制了。首先肯定是檢測受體了，也就是作者發(fā)現(xiàn)作用后4個受體中EP4表達最高（3A），并且下游cAMP水平也升高（3B）。隨后便是圍繞EP4進行一個gain- or loss-of-functionexperiments，即，在PGE2的干預(yù)下抑制或者恢復(fù)EP4受體，檢測對MuSCs增殖影響(3C),接下來在EP4基因敲除鼠上進一步驗證MuSCs在損傷處的增殖（3D）和移植（3E）。

這一部分實驗好理解，就是體內(nèi)體外證實PGE2是通過EP4受體來發(fā)揮作用。實驗很嚴謹，體內(nèi)外結(jié)合，無可挑剔。作者引入cAMP，已知的EP4下游分子，間接也證實了PGE2-EP4-cAMP。后續(xù)可以通過觀察cAMP水平也可以反映EP4或PGE2的處理變化（慢慢意會）。

轉(zhuǎn)錄因子NURR1是PGE2/EP4信號通路下游mediator

       作者找出了PGE2-EP4了，畢竟這個點還太淺，與本身的受體結(jié)合這個誰都可以想得到，做的并不深入，隨后找出下游的作用分子，作者通過RNA-seq技術(shù)進行篩選（4A）。結(jié)合已知報道的與PGE2-cAMP有關(guān)的，最終篩選出NURR1分子。接下來就是證實NURR1這個分子在PGE2處理的變化了（常規(guī)思路：先qPCR檢測確認PGE2處理后NURR1變化，隨后，干擾NURR1后在PGE2干預(yù)下細胞的增殖變化等等）。4B: （體內(nèi)）虎蛇毒素損傷后肌肉組織中NURR1的變化（和前面PGE2的一致），4C: （體外）MuSCs在PGE2處理下NURR1在mRNA（4C）和蛋白水平（4D）均升高。干擾NURR1后，PGE2的促增殖效果消失（E）.為了進一步確認NURR1是EP4下游分子，隨后條件性敲除EP4小鼠上得到驗證。（F,G）

結(jié)論： These data implicate thetranscription factor NURR1 as a mediator of PGE2/EP4 signaling that triggersMuSC expansion.

PGE2信號的確實影響組織再生

       已經(jīng)驗證了EP4是PGE2中間環(huán)節(jié)，那么敲除EP4也就是可以阻斷PGE2信號傳遞了。A:敲除效率驗證；B：敲除后eMyHC（eMyHC：未成熟纖維的標記，大量存在即可以理解為“夭折”）表達升高。D，E均是EP4敲除后，eMyHC的表達均上升（提示：Pax7 CreERT2: EP4 f/f 這個基因敲出鼠，意思是定點敲出MuSCs上EP4）。

然后接下來就是證實通過敲出EP4來阻斷PGE2信號檢測對肌肉強度的影響了，這里作者選了2個指標G和H：抽搐和破傷風(fēng)力量（此處翻譯可能不當：原文：twitch and tetanusforce）；后續(xù)實驗也就是圍繞這倆指標展開，同前面一樣，只是不再使用基因敲除鼠了，采用的是NSAID非甾體抗炎藥來抑制PGE2的合成。

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總結(jié)

思路簡單；實驗嚴謹

1.體內(nèi)外驗證PGE2在損傷時候高表達，且與增值再生密切關(guān)聯(lián)----各路實驗解釋，反復(fù)證實

2.體內(nèi)外驗證機制---EP4—lose or gain function experiments

3.EP4下游機制----RNA-seq得出NURR1，驗證

4.終極體內(nèi)驗證：阻斷PGE2（EP4敲出和NSAID抑制合成）--觀察

5.得出結(jié)論

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