對(duì)血栓癥的分子靶向藥物開(kāi)發(fā)至關(guān)重要的凝血素和纖維蛋白原相互作用抑制
日本東京大學(xué)于8月8日宣布，成功開(kāi)發(fā)出了一種通過(guò)添加互補(bǔ)鏈DNA等實(shí)現(xiàn)藥效中和的核酸適體，其藥效大大超過(guò)了血栓癥現(xiàn)有的低分子治療藥物。
該研究是由該大學(xué)大學(xué)院綜合文化研究科的吉本敬太郎準(zhǔn)教授、奈良縣立醫(yī)科大學(xué)血栓止血醫(yī)藥生物學(xué)共同研究講座的坂田飛鳥(niǎo)特任助教等人組成的研究小組進(jìn)行的。研究成果發(fā)表在《Molecular Therapy - Nucleic Acids》上。
血液凝固反應(yīng)在血管內(nèi)失控的話會(huì)增加血栓的風(fēng)險(xiǎn)。凝血因子之一的凝血素與基質(zhì)纖維蛋白原反應(yīng)，引起血液凝固。血栓癥是血管內(nèi)血液凝固引起的疾病，一旦發(fā)生血栓，血流停止，就會(huì)引起嚴(yán)重的癥狀。預(yù)防和治療血栓癥時(shí)使用的藥物被稱為抗凝藥，它與生物體內(nèi)的凝血因子結(jié)合，抑制凝血。與凝血酶結(jié)合，阻礙凝血酶和纖維蛋白之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的分子具有抑制血液凝固的分子靶向藥物的巨大潛力。
HIT藥物Argatroban面臨安全性挑戰(zhàn)
另外，肝素誘發(fā)血小板減少癥（HIT）是一種使用肝素（一種抗凝劑）而引起的血栓癥治療并發(fā)癥，是一種與血小板減少一起引起血栓栓塞癥的疾病。由于最近新型冠狀病毒感染的大流行，肝素的使用量增加了HIT患者的數(shù)量。不幸的是，目前作為HIT治療藥物使用的低分子凝血素抑制劑Argatroban，由于沒(méi)有中和劑來(lái)停止嚴(yán)重的出血，這是一種副作用，而且它具有胎盤(pán)通過(guò)性，所以對(duì)孕婦來(lái)說(shuō)不推薦使用，在安全性方面留下了課題。
著眼于通過(guò)互補(bǔ)鏈實(shí)現(xiàn)藥效停止和連接的“核酸適體”
在這樣的背景下，研究小組致力于開(kāi)發(fā)研究可用于血栓癥預(yù)防和治療藥物的安全性高的核酸適體。核酸適體是中分子型分子靶向藥物之一，是具有分子識(shí)別功能的單鏈核酸，包含（1）制造成本低廉，（2）運(yùn)輸、保管時(shí)不用低溫管理，（3）可以通過(guò)互補(bǔ)鏈停止藥效（中和），（4）容易連接多個(gè)適體（雙重特異性化）等特點(diǎn)。特別是（3），核酸適體特有的核酸適體可以降低使用抗凝藥時(shí)擔(dān)心的出血風(fēng)險(xiǎn)，從而開(kāi)發(fā)安全性高的血栓癥治療。而且，中分子藥物核酸的胎盤(pán)通過(guò)性極低。
具有高抗凝血活性的“M08s-1”
結(jié)合作為血液凝固因子的凝血酶原的DNA適體，自1992年首次通過(guò)SELEX法發(fā)現(xiàn)由被稱為HD1的15個(gè)堿基序列構(gòu)成的凝血酶原結(jié)合性DNA適體（TBA15）以來(lái)，獲得并報(bào)告了各種序列的適體。研究小組以前用自行研制的MACE（R）-SELEX方法獲得了10個(gè)針對(duì)凝血酶的DNA適體組“M系列”，其中發(fā)現(xiàn)了DNA適體史上具有最高抗凝作用的M08及其短鏈序列M08s-1。
M08s-1引入雙重特異性，制備4種適體，結(jié)合親和性提高約100倍
該研究小組通過(guò)充分利用核酸適體的特點(diǎn)——多個(gè)適體的連接（雙重特異性化），設(shè)計(jì)了基于M08s-1的雙特異性適體。Antithrombin適體已經(jīng)被報(bào)道過(guò)，它是通過(guò)柔軟的單鏈DNA將抗凝血活性較低的TBA15和TBA29結(jié)合在凝血酶外細(xì)胞1上，TBA29結(jié)合在外細(xì)胞2上。大部分是由單鏈或剛直的雙鏈型DNA連接的。
通過(guò)改變接頭種類（連接2個(gè)適體的單鏈核酸或雙鏈核酸）和適體的組合，對(duì)含有M08s-1的4種雙間隔適體進(jìn)行了新的設(shè)計(jì)和制作，并進(jìn)行了評(píng)價(jià)。首先，對(duì)凝血酶的結(jié)合親和性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，對(duì)人凝血酶和鼠凝血酶的結(jié)合親和性，4種全部比單體適體 M08s-1提高約100倍。
在小鼠中表現(xiàn)出高7～10倍的抗凝活性和5倍的血中半衰期
用老鼠做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，HIT的批準(zhǔn)藥Argatroban，單體適體，BsAb適體等摩爾量的老鼠靜脈注射后，用回收的血漿比較抗凝活性。BsAb適體明顯高于Argatroban和已有臨床候選適體 NU172的抗凝活性，其中Lin08-08和Pse08-29的抗凝活性比M08s-1高7到10倍。在老鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象。有趣的是，兩種單體適體 NU172和M08s-1在3分鐘后的分布階段血液濃度迅速下降，而在二聚體中并沒(méi)有迅速下降。抗凝活性最高的是Pse08-29，而血中半衰期最長(zhǎng)的是Lin08-08，大約是單體適體血中半衰期的5倍。Pse08-29在老鼠體內(nèi)表現(xiàn)出比其他三種雙聚體aptmer更強(qiáng)的抗凝活性，具體的機(jī)制目前還不清楚，不過(guò)利用了獨(dú)自發(fā)現(xiàn)的M08s-1，二聚體化的作用很大。這很有可能與提高的目標(biāo)分子的結(jié)合親和性有關(guān)。
可以用短的互補(bǔ)鏈序列和硫酸蛋白來(lái)中和活性
用于HIT治療的Argatroban和Bivalirudin沒(méi)有中和劑，因此治療時(shí)的出血風(fēng)險(xiǎn)較高。另一方面，由于補(bǔ)充鏈的添加，使高階結(jié)構(gòu)強(qiáng)制轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈成為可能，因此可以利用補(bǔ)充鏈作為中止藥效的中和劑。使用短互補(bǔ)鏈序列[M08sG2]c進(jìn)行人血漿中作為中和劑的功能評(píng)價(jià)時(shí)，雖然不能完全中和抗凝效果，但成功地將目標(biāo)aPTT值降低到30以下。此外，他們還發(fā)現(xiàn)，使用已經(jīng)在臨床上被批準(zhǔn)的硫酸丙胺，可以幾乎完全抑制Pse08-29的高抗凝活性。
此次研究成功開(kāi)發(fā)出了天然型雙重特異性DNA適體（雙特異性DNA適體），其藥效大大超過(guò)了現(xiàn)有血栓癥治療藥物的藥效，可以通過(guò)添加互補(bǔ)鏈DNA等來(lái)中和藥效。
研究小組表示：“此次獲得的研究成果，有助于開(kāi)發(fā)安全性高的HIT治療和血栓癥治療藥物，同時(shí)，在以血液凝固因子為目標(biāo)的天然核酸治療藥物的開(kāi)發(fā)中，不引入化學(xué)修飾和人工核酸的獨(dú)特分子設(shè)計(jì)提供指南?！?/p>
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