ctDNA僅占cfDNA的0.1%~5%，且不同癌種、不同病程的腫瘤患者ctDNA在血漿中含量差異較大。因此，需要超敏感方法來檢測ctDNA攜帶的特征信息（包括突變、重排、拷貝數(shù)異常、甲基化等）。中篇將介紹ctDNA的各種分析方法。
5.ctDNA的分析方法
循環(huán)cfDNA主要由源自正常細胞的種系DNA組成，存在于癌癥患者中的ctDNA相對較少且高度可變。因此，傳統(tǒng)DNA分析方法(如Sanger測序，焦磷酸測序)的靈敏度不足以檢測癌癥患者血漿ctDNA中的體細胞突變。
目前ctDNA的分析方法主要有三種：以ARMS為代表的定量PCR技術；以ddPCR為代表的數(shù)字PCR技術；基于下一代測序(NGS)的高通量檢測技術。近年來也出現(xiàn)了核酸質譜技術和EFIRM技術。
5.1ARMS技術
ARMS全稱amplification refractory mutation system(擴增受阻突變體系)，又稱等位基因特異性擴增法，是一種在PCR基礎上發(fā)展起來用于檢測DNA中各種點突變的新方法。其基本原理是，如果引物的3′端堿基與模板堿基不互補，則用一般耐熱DNA聚合酶無法延伸。因此根據(jù)已知點突變設計引物，使3′端堿基分別與突變和正常的模板堿基互補，從而將有某種點突變的模板與正常模板區(qū)分開來。ARMS技術結合電泳或熒光定量PCR方法進行檢測，前者利用凝膠電泳技術檢測擴增帶，從而實現(xiàn)結果分析，后者指ARMS技術結合探針對擴增產(chǎn)物進行檢測，在熒光定量PCR平臺上實現(xiàn)對樣品DNA中稀有突變的檢測。目前采用電泳分析仍是主流，結合定量PCR的還較少。
四引物ARMS-PCR方法的示意圖（該方法基于具有兩組引物的PCR反應，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。一組內部引物對于對突變和野生型等位基因是特異性的，并且它們彼此相對設計，另一組外部引物用于在PCR反應中產(chǎn)生對照條帶。兩個外部引物和內部—外部引物可以相互反應并產(chǎn)生不同長度的產(chǎn)物，它們可以在凝膠電泳中分離。）
資料來源：Iran J Public Health 44(3):380-7, 2015，寬華投研團隊整理
ARMS技術具有成本低、簡便快速、特異性好、技術普及度高等特點，非常適合醫(yī)院廣泛開展。ARMS技術已成為目前歐盟及中國CFDA批準用于臨床的血液檢測方法，同時獲得專家共識的推薦。然而ARMS技術檢測靈敏度有限（檢測限度為1%），單次只能檢測單個基因且只能用于檢測已知突變，在一定程度上限制其應用。
艾德生物基于ARMS技術開發(fā)了升級版Super-ARMS，其保留了ARMS技術簡便快速，特異性好，技術普及度高等特點，非常適合醫(yī)院廣泛開展，同時進一步提高檢測靈敏度（0.01-0.2%），滿足血液ctDNA檢測的要求，更適合作為血液ctDNA檢測的臨床普及技術。
5.2數(shù)字PCR技術
qPCR通過熒光染料或熒光特異性探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時監(jiān)控反應過程。每擴增一條DNA鏈，就有熒光染料分子結合到雙鏈DNA上或有熒光分子從探針上釋放，實現(xiàn)熒光信號的累積。由于熒光積累與PCR產(chǎn)物形成完全同步，可通過軟件對熒光積累信息進行分析和計算，獲得待測樣品模板的初始濃度。但是，qPCR只能夠通過標準曲線和標準品進行相對定量，無法做到精準絕對定量。
qPCR示意圖（使用基因特異性引物，通過摻入雙鏈DNA特異性染料或通過聚合酶5'-3'外切核酸酶活性釋放TaqMan FRET（熒光共振能量轉移）探針檢測靶標的初始濃度。）
資料來源：Nat Rev Genet. 2016 May 17;17(6):333-51，寬華投研團隊整理
20世紀末，Vogelstein等提出數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)的概念，與qPCR不同的是，數(shù)字PCR可以不需要對照標準樣品和標準曲線來實現(xiàn)絕對定量分析。數(shù)字PCR一般包括兩部分內容，即PCR擴增和熒光信號分析。數(shù)字PCR通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子(DNA模板)，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR擴增，擴增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統(tǒng)計學分析。
根據(jù)反應單元類型不同，數(shù)字PCR分為三類：微反應室/孔板、微流控芯片和微滴數(shù)字PCR系統(tǒng)。目前通過數(shù)字PCR方法進行ctDNA分析的主要技術有ddPCR和BEAMing。
5.2.1ddPCR
ddPCR全稱droplet digital PCR(微滴數(shù)字PCR)。該技術屬于Bio-Rad公司，可實現(xiàn)絕對定量和稀有等位基因的檢測，其工作原理為：首先將血漿中分離出的DNA分割成一個個的小微滴，置于不同的微孔中，便于形成多個獨立、平行的反應；隨后對微孔中的DNA同時進行PCR擴增。在擴增時通過特定的化學試劑和染料探針標記其中的陽性分子，即ctDNA，檢測到ctDNA會有信號累積；最后對每個孔的信號累積情況進行計算和定量分析，即可計算出原始樣品中ctDNA的含量。該技術靈敏度高達0.001%，能夠檢測到血液中痕量的ctDNA，可有效適用于腫瘤的早期篩查，但是不能檢測未知突變，且不能高通量。
ddPCR檢測ctDNA示意圖
資料來源：銀河證券，寬華投研團隊整理
5.2.2BEAMing
該方法基于小珠(Bead)、乳濁液(Emulsion)、擴增(Amplification)、磁性(Magnetic)這四個主要組分來構建，所以被稱作為BEAMing。BEAMing結合了數(shù)字PCR以及流式技術，通過磁珠克隆DNA。利用特異性PCR引物擴增目標突變區(qū)后，與磁珠（磁珠上固定有特異的PCR引物）混合進行油包水單分子擴增反應。反乳化作用后，利用不同顏色的熒光探針結合磁珠上的PCR產(chǎn)物，發(fā)出紅色或綠色熒光。使用流式細胞儀分析磁珠顏色來確定突變情況。BEAMing技術具有較高的靈敏度（0.01%），但是這項技術只能檢測已知突變，且成本較高。同時，它的操作也較復雜，通量低。
BEAMing技術（步驟1：鏈霉親和素包被的磁珠與生物素標記的寡核苷酸結合。步驟2： 含水混合物（包含PCR所需的所有成分、結合引物的磁珠和模板DNA）與油/洗滌劑混合物一起攪拌以產(chǎn)生微乳液；含水隔室（灰色油層中的白色圓圈）含有平均少于一個模板分子和少于一個珠子；紅色和綠色模板代表兩個模板分子，其序列相差一個或多個核苷酸。步驟3：如常規(guī)PCR中那樣對微乳液進行溫度循環(huán)；如果DNA模板和磁珠一起存在于單個水性隔室中，則磁珠結合的寡核苷酸作為擴增的引物；連接到磁珠的紅色和綠色直線代表來自兩種不同模板的延伸產(chǎn)品。步驟4：破壞乳液，用磁鐵純化磁珠。步驟5：變性后，將磁珠與能區(qū)分不同種類模板序列的寡核苷酸（雜交探針）一起溫育；然后使用熒光標記的抗體標記結合的雜交探針，這使得在適當?shù)募す饧ぐl(fā)后含有PCR產(chǎn)物的磁珠為紅色或綠色。步驟6：流式細胞術用于計數(shù)紅色和綠色磁珠。）
資料來源：PNAS July 22, 2003 100 (15)，寬華投研團隊整理
5.3NGS技術
數(shù)字PCR技術，具有極高的敏感性，可絕對定量；但該方法操作復雜，一次僅能檢測少數(shù)突變位點，且不能檢測融合變異。為了提高檢測通量和效率，以NGS為核心的測序技術被廣泛應用于ctDNA的下游分析，范圍從全基因組或全外顯子組測序到有限基因組的靶向測序。NGS可實現(xiàn)對多基因核酸片段進行高通量平行深度測序，能夠同步檢測多個基因、不同形式（如突變、拷貝數(shù)改變和基因融合）及未知突變，在預后和療效判斷的時候，多基因的參與可能對預后效果產(chǎn)生非常大的影響。
5.3.1NGS技術的原理
NGS是最近十多年誕生的DNA測序技術，它能同時對幾十萬到幾百萬個DNA分子進行平行測定，與傳統(tǒng)的一代測序技術相比，具有高通量、高敏感性等優(yōu)勢，因此也稱為高通量測序技術，是對傳統(tǒng)Sanger測序革命性的改變。
NGS的測序步驟主要有（1）文庫構建，構建文庫時需要將DNA隨機片段化并在兩頭加上特定的接頭（adaptor）；（2）文庫分子大規(guī)模平行克隆擴增，使用橋式擴增或者乳液PCR方法，對文庫中的DNA片段進行克隆擴增，以產(chǎn)生足夠拷貝數(shù)量的測序模板；（3）測序，目前NGS測序平臺主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system，其中Illumina公司的測序平臺占主導地位。Roche/454 FLX平臺采用焦磷酸測序原理，在第二代中讀長最高，但儀器昂貴，難于處理重復和同種堿基多聚物區(qū)域；SOLID平臺應用連接法測序，測序通量和準確性高，試劑成本低，但儀器昂貴，測序運行時間長，讀長短，數(shù)據(jù)分析困難。Solexa技術采用可逆鏈終止物和合成測序法，測序通量高，需要樣品量少其簡單、快速、自動化，其但儀器高貴，用于數(shù)據(jù)刪節(jié)和分析的費用很高。
NGS技術的原理和流程
資料來源：公開資料，寬華投研團隊整理
5.3.2非靶向測序
非靶向測序根據(jù)檢測范圍分為全外顯子測序(WES)和全基因組測序(WGS)。目前已有技術平臺應用全基因組測序方法來分析ctDNA，該方法能夠在不事先知道腫瘤中可能存在的畸變的情況下鑒定腫瘤特異性的改變。因此，可以利用這些方法從頭發(fā)現(xiàn)治療抗性的基因變化，并鑒定癌癥患者中新的可操作靶標。但是全基因組測序檢測靈敏度較低（5-10%），而且成本高、檢測周期長、數(shù)據(jù)分析難度較大，難以在臨床上應用。
5.3.3靶向深度測序
為了在保證檢測準確性和測序深度的基礎上降低價格，目前越來越多的新技術先對ctDNA目的片段進行富集，再將富集后的目的序列進行深度測序，這種方法稱為靶向深度測序。與全基因組測序以及全外顯子測序相比，靶向測序能夠獲得更深的覆蓋度和更高的數(shù)據(jù)準確性，提高了對目的區(qū)域的檢測效率。同時縮短了檢測周期，降低了測序成本，適合對大量樣本進行分析。
靶向測序技術可通過PCR或雜交捕獲對目的片段進行富集。基于PCR的靶向測序技術是針對目的基因設計幾十對甚至上百對PCR引物，利用PCR擴增富集?；陔s交捕獲的靶向測序技術是針對目的基因設計探針，通過雜交捕獲的方法富集。
由于NGS的實驗流程技術較為復雜，在文庫構建、目的片段富集及測序過程中不可避免的會引入一些擴增和測序的錯誤，這些錯誤稱為背景噪音，而ctDNA檢測往往突變頻率較低，受到背景噪音干擾較大，來自ctDNA樣本中的低頻突變往往淹沒在背景噪音之中，造成假陰性或假陽性結果，這就限制了ctDNA檢測的靈敏度和特異性。因此，目前基于NGS的靶向測序技術都致力于降低背景噪音，提高ctDNA檢測的靈敏度和特異性，大多數(shù)技術通過分子條形碼(barcode)的策略。分子條形碼又稱分子標簽(Unique Molecular indentifier, UMI)，它的原理就是給每一條原始DNA片段加上一段特有的標簽序列，經(jīng)文庫構建及PCR擴增后一起進行測序。這樣，根據(jù)不同的標簽序列就可以區(qū)分不同來源的DNA模板，分辨哪些是PCR擴增及測序過程中的隨機錯誤造成的假陽性突變，哪些是患者真正攜帶的突變，從而改善檢測的局限性，提高測序的準確性。最初使用的條形碼策略是追蹤單鏈DNA的單鏈標簽，目前大多使用的策略是追蹤雙鏈DNA的雙鏈標簽。盡管雙鏈標簽比單鏈標簽能實現(xiàn)更好的錯誤抑制，但是效率相對較低，因此對于臨床上數(shù)量有限的cfDNA不是最佳的。
使用分子條形碼策略的NGS方法
資料來源：N Engl J Med 2018;379:1754-65，寬華投研團隊整理
除了使用分子條形碼，一些錯誤抑制算法和富集特定長度的ctDNA片段（ctDNA片段通常比健康細胞釋放的cfDNA片段?。┮脖挥脕斫档捅尘霸胍?，改善ctDNA檢測的敏感度。
目前通過靶向深度測序方法進行ctDNA檢測的主要技術有標記擴增深度測序(TAM-Seq)，安全測序系統(tǒng)(Safe-seqS)，癌癥個體化深度測序(CAPP-Seq)，集成數(shù)字錯誤抑制方法(iDES)，靶向錯誤矯正測序(TEC-Seq)等。
TAM-Seq 基本原理是設計特異性引物對目標區(qū)域進行循環(huán)預擴增，產(chǎn)生大小200bp以下末端重疊覆蓋整個區(qū)域的擴增子（預擴增），接著通過單重PCR選擇性擴增帶突變的擴增子區(qū)（標簽擴增），從而排除非特異性產(chǎn)物，最后在回收的產(chǎn)物上加接頭和特異性條形碼(barcode)，進一步通過單端測序得到最終結果。該方法主要特點是測序通量高、測序時間和成本顯著降低，但檢測敏感度有待提高（>2%）。
TAM-Seq流程（紅星代表攜帶突變的DNA分子）
資料來源：Sci Transl Med 4, 136ra68 (2012)，寬華投研團隊整理
Safe-seqS 該方法包括兩個基本步驟：第一步為每個待分析的DNA模板分子分配獨特的標示物（UID，或稱條形碼）；第二步對每個UID標記的模板進行擴增，從而產(chǎn)生具有相同序列的許多子分子（定義為UID家族）。如果用于擴增的模板分子中預先存在突變，則該突變應該存在于含有該UID的每個子代分子中（除非任何后續(xù)的復制或測序錯誤）。至少95％的家庭成員具有相同突變的UID家族被稱為“超級突變體”。原始模板中沒有發(fā)生的突變，例如復制或測序錯誤，不會產(chǎn)生超級突變體。Safe-seqS改善了大規(guī)模平行測序的準確性，能用于鑒定DNA模板中的稀有突變，發(fā)現(xiàn)PCR或測序過程中產(chǎn)生的錯誤。UID標記的模板的擴增效率對該方法的成功至關重要，但臨床樣品含有降低該步驟效率的抑制劑，需要優(yōu)化以解決這一問題。
Safe-SeqS流程
資料來源：PNAS. 2011 Jun 7; 108(23): 9530–9535，寬華投研團隊整理
CAPP-Seq 該方法的關鍵是聯(lián)合數(shù)據(jù)庫檢索和多階段生物信息學方法，來設計一個由生物素化的寡核苷酸組成的“篩選器”，靶向腫瘤的突變區(qū)域，直接應用于待測的循環(huán)DNA，來識別腫瘤相關的基因突變，從而直接進行ctDNA的定量測定。這個篩選器是從腫瘤基因突變數(shù)據(jù)庫（COSMIC）等來源中，納入可能的驅動基因中反復出現(xiàn)突變的外顯子，再對腫瘤基因圖譜庫（TCGA）的407名非小細胞肺癌（NSCLC）患者的全外顯子測序數(shù)據(jù)，運用迭代算法找到最大量的錯義突變，而使篩選器長度最小化。篩選器長度約為125kb，包含了139個反復出現(xiàn)的突變基因中的521個外顯子及12個內含子，平均能夠識別4個單核苷酸突變。CAPP-Seq有效的把測序區(qū)段濃縮到整個基因組大小的0.004%，使得后續(xù)超高深度測序得以實現(xiàn)，其對ctDNA檢測結果靈敏度高，特異性強且經(jīng)濟可行。
CAPP-Seq流程
資料來源：維基百科，寬華投研團隊整理
iDES CAPP-seq技術的檢測極限是0.02%，不過許多測序片段都有錯誤。為了解決這些錯誤，研究人員對CAPP-seq進行了優(yōu)化，開發(fā)了iDES。該方法使用分子條形碼和“背景拋光”兩種技術策略，能獲得有效的cfDNA，大大降低了本底噪音。這兩種方案能分別使CAPP-seq敏感性提升3倍，而結合后提升15倍。
iDES使用的分子條形碼策略綜合了單鏈條形碼和雙鏈條形碼的各自優(yōu)勢。原始DNA雙鏈分子的每條鏈使用四個條形碼標記。單鏈條形碼為“索引讀取”的一部分進行測序，因此稱為“索引”條形碼。雙鏈條形碼作為插入DNA片段主要讀數(shù)的一部分進行測序，因此稱為“插入”條形碼。在測序之后，互補的插入條形碼可匹配，從而重新構建出原始的雙鏈DNA分子。
iDES分子條形碼的設計策略
資料來源：Nat. Biotechnol. 34, 547–555 (2016)，寬華投研團隊整理
雜交捕獲過程中的氧化損傷會產(chǎn)生大量反復發(fā)生的背景錯誤，最常見的是G→T的顛換，也有少量C→T和G→A的錯誤。僅使用分子條形碼策略，這些背景錯誤的發(fā)生率仍較高。為了減少基于雜交捕獲的測序技術產(chǎn)生的背景錯誤，研究人員設計一種稱為“背景拋光”的計算方法。iDES將這種計算方法與分子條形碼策略結合起來，使錯誤率減少了15倍。
iDES能夠檢測到頻率低至0.004%的突變，敏感性和特異性較其他方法得到了改善。在熱點等位基因上實現(xiàn)了與數(shù)字PCR或基于PCR的測序方法類似的靈敏度，但可以同時詢問數(shù)百到數(shù)千個額外的基因組位置，而不會影響靈敏度或特異性。
TEC-seq 該方法基于對基因組的多個區(qū)域的靶向捕獲和DNA片段的深度測序(~30,000X)。除了深度測序以外，該方法還對測序流程做出了一系列改進來提高檢測的靈敏度。其中包括：優(yōu)化測序庫的生成和靶向片段的捕獲，通過加入少量外源條形碼最大化獨特ctDNA在測序庫中的呈現(xiàn)可能，以及在后期分析時過濾掉測序錯誤和其它原因導致的基因變異。TEC-seq檢測有望用于無癥狀的患者進行癌癥早期篩查，但鑒于可能潛在檢測到的不同腫瘤，需要成像和其他診斷手段來完成任何陽性ctDNA分析，以適當鑒別起源腫瘤。
TEC-seq流程（從血液中提取cfDNA，并通過連接含有少量雙索引條形碼適配子的池轉化為基因組文庫。捕獲所得到的cfDNA文庫并進行冗余測序以產(chǎn)生每個DNA片段的多重拷貝。重復片段之間的序列調節(jié)鑒定出具有相同起始和終止位置以及外源條形碼的相同DNA分子中存在的改變。使用包含相同冗余變化的多個不同分子的參照基因組進行比對以鑒別真正的改變）
資料來源：Sci Transl Med 4, 136ra68 (2012)，寬華投研團隊整理
5.4核酸質譜技術
20世紀80年代出現(xiàn)的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)打破了以往質譜僅可進行小分子物質分析的傳統(tǒng)，使得核酸、蛋白質等生物大分子也可應用質譜進行研究。由此其奠基人田中耕一和約翰貝內特芬恩于2002年獲得諾貝爾化學獎，F(xiàn)DA于2014年批準MALDI-TOF MS可用于臨床核酸檢測。MALDI TOF質譜通過將待測樣本轉換成高速運動的離子，根據(jù)不同離子擁有不同的質荷比(m/z)，來對待測樣本進行分離和檢測，可用于ctDNA的SNP、突變、甲基化及拷貝數(shù)差異等多項檢測與分析。
Agena是采用飛行質譜技術進行核酸檢測最知名的公司，目前已經(jīng)與多家公司合作，對公司的MassARRAY?系統(tǒng)、DNA檢測應用和產(chǎn)品進行大力推廣。MassARRAY?系統(tǒng)將飛行質譜的特性和多重基因檢測完美的組合在一起，一次檢測多達40~50個基因位點，單位成本低廉，這是其在臨床應用的核心競爭力。
飛行質譜檢測核酸突變的原理（首先通過多重PCR同時擴增多個待測基因突變和野生的目的片段，然后通過單堿基延伸反應獲得突變片段的延伸產(chǎn)物，延伸產(chǎn)物和非延伸引物與芯片基質共結晶，用激光照射后產(chǎn)物離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達檢測器的飛行時間不同而測定離子的質荷比（m/z），從而確定該位點的堿基。）
資料來源：言行生物官網(wǎng)，寬華投研團隊整理
5.5EFIRM技術
EFIRM全稱Electric Field-induced Release and Measurement(電場誘導的釋放與檢測技術)。該技術由易活生物完全掌握，其創(chuàng)造性地采用超高活性分子探針固定、電場瞬間捕獲靶標分子、捕獲分子信號特異放大三大核心專利技術，從而實現(xiàn)無需核酸提取、無需PCR擴增，直接檢測靶標分子。已有研究表明，利用EFIRM技術可從早期和晚期非小細胞肺癌患者的血液或唾液樣本中準確檢測出EGFR基因突變。
與PCR和二代測序相比，EFIRM的技術核心在于電場誘導，它的優(yōu)勢是檢測時間短(30-60 min，其他技術檢測可能要數(shù)天時間)、操作便捷(可實現(xiàn)半自動和全自動檢測，對技術人員操作要求低)、成本低(價格是目前診斷方法的十分之一)。此外，除了檢測DNA等核酸分子，EFIRM技術還能檢測蛋白質分子。但是該方法目前僅完成了EGFR基因突變的檢測，需要增加分析突變的數(shù)量并進一步提高靈敏度以促進大規(guī)模篩查。
EFIRM技術檢測EGFR突變的原理（設計針對EGFR突變的成對探針（捕獲探針和檢測探針），捕獲探針固定于電化學傳感器金電極表面的導電多聚物上，檢測探針用熒光素標記。將血液或唾液樣品與探針混合，在循環(huán)方波電場（csw E-field）作用下，捕獲探針通過堿基互補作用與樣本中的靶標序列結合。在反應液中加入抗熒光素抗體偶聯(lián)的辣根過氧化物酶（HRP）和HRP的底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB）。在電場作用下，HRP與檢測探針結合并和底物TMB發(fā)生反應，產(chǎn)生電信號。通過測量電信號即可檢測EGFR的突變情況）
資料來源：Am J Respir Crit Care Med. 2014 Nov 15;190(10)，寬華投研團隊整理
（來源：金氪投行之家的財富號 2018-12-29 10:59） [點擊查看原文]
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