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乳腺癌是當(dāng)今女性中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，對(duì)女性健康存在重大威脅。雌激素受體（ERα）驅(qū)動(dòng)了相當(dāng)一部分乳腺癌的進(jìn)展，對(duì)于這部分乳腺癌，靶向 ERα 或雌激素合成的內(nèi)分泌療法是重要的治療手段。然而，相當(dāng)多的患者仍會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)及耐藥的現(xiàn)象 ^[1]。因此，探究 ERα 在乳腺癌中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有重要科學(xué)意義及轉(zhuǎn)化價(jià)值。

2017 年一篇發(fā)表于 Nature 的報(bào)道指出，抑癌通路 Hippo 可以介導(dǎo) ERα 的降解，進(jìn)而調(diào)控 ER + 乳腺癌對(duì)內(nèi)分泌療法的敏感性。然而，近日 Hippo 領(lǐng)域大牛管坤良組卻對(duì)此提出了截然相反的結(jié)論 —— Hippo 通路反而促進(jìn) ERα 的表達(dá)。

到底是什么使得這兩篇文章產(chǎn)生了如此大的差異呢？

作為重要的抑癌通路和明星級(jí)研究熱點(diǎn)，Hippo 通路不僅在器官發(fā)育、尺寸控制和組織再生中起重要作用，更與多種癌癥的進(jìn)展密切相關(guān)。在 Hippo 通路中，激酶 MST1/2 在輔因子 MOB1 和 SAV1 的幫助下，磷酸化活化激酶 LATS1/2，后者進(jìn)一步磷酸化轉(zhuǎn)錄激活因子 YAP/TAZ，使其滯留在細(xì)胞質(zhì)中并降解。當(dāng) Hippo 通路上游信號(hào)減弱或丟失時(shí)，YAP/TAZ 磷酸化水平降低，發(fā)生核轉(zhuǎn)位，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子 TEAD1-4，調(diào)控一系列下游基因的表達(dá)。

 哺乳動(dòng)物 Hippo 通路示意圖 ^[2]

Hippo 通路的失調(diào)常見(jiàn)于多種腫瘤，YAP/TAZ 的異?；罨粌H促進(jìn)腫瘤發(fā)生，更調(diào)控上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、腫瘤干細(xì)胞干性維持、對(duì)化療和多種靶向療法的耐藥、免疫逃逸等腫瘤病理過(guò)程 ^[2,3]。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在 ER + 乳腺癌中，Hippo 通路的失活使 YAP/TAZ 活化并上調(diào) CDK4/6 的表達(dá)，從而介導(dǎo)對(duì) CDK4/6 靶向藥的耐藥性 ^[4]。

闡明 Hippo 通路對(duì) ERα 的調(diào)控機(jī)制，對(duì)深入了解 ER + 乳腺癌的進(jìn)展機(jī)制及尋找新的潛在治療靶點(diǎn)具有重要意義。

2017 年，來(lái)自瑞士 Friedrich Miescher Institute 的 Mohamed Bentires-Alj 團(tuán)隊(duì)于 Nature 發(fā)表題為 The Hippo kinases LATS1 and 2 control human breast cell fate via crosstalk with ERα 的文章，報(bào)道了 Hippo 通路中的 抑癌激酶 LATS1/2 通過(guò)調(diào)控 ERα 及 YAP/TAZ 的降解，決定原始乳腺上皮細(xì)胞（PHBECs）的分化，及 ER + 乳腺癌細(xì)胞對(duì)內(nèi)分泌治療的敏感性。

圖片來(lái)源：Nature

作者發(fā)現(xiàn)，抑制 LATS1/2 的表達(dá)促使 PHBECs 往腔面型（Luminal）方向分化，產(chǎn)生具有強(qiáng)自我更新能力（self-renewal）的腔面譜系細(xì)胞。在機(jī)制上，LATS1/2 可以通過(guò)結(jié)合 ERα 并募集泛素連接酶底物受體 DCAF1/DCAF13，通過(guò)泛素 - 蛋白酶體途徑誘導(dǎo) ERα 的降解，且這一過(guò)程不依賴其激酶活性或 YAP/TAZ 蛋白。

基于此，作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，敲降 LATS1/2 增加了 MCF-7 等腔面型乳腺癌細(xì)胞中 ERα 的穩(wěn)定性，使癌細(xì)胞耐受內(nèi)分泌治療藥物氟維司群（Fulvestrant, 可誘導(dǎo) ERα 降解），但不影響 ERα 拮抗劑他莫昔芬（Tamoxifen）的療效。

但出乎預(yù)料的是，2021 年 3 月 3 日，Hippo 領(lǐng)域大牛，來(lái)自美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校的管坤良課題組于 Nature 以 Matters arising 的形式發(fā)表題為 Hippo signalling maintains ER expression and ER+ breast cancer growth 的文章，提出了與上文結(jié)果截然相反的結(jié)論 —— 抑癌激酶 LATS1/2 反而促進(jìn) ESR1（ERα 編碼基因）的表達(dá)，從而驅(qū)動(dòng) ER + 乳腺癌的發(fā)展。

圖片來(lái)源：Nature

本文作者首先通過(guò) CRISPR 同時(shí)敲除了 MCF-7 細(xì)胞中的 LATS1/2，然而意外的是，細(xì)胞生長(zhǎng)竟然停滯了，且 ESR1 mRNA 水平和 ERα 蛋白水平大幅下降。

但 Alj 組文章中，LATS1/2 僅在蛋白水平上降解 ERα，在癌細(xì)胞系 T47D 中敲降 LATS1 不影響 ESR1 mRNA 水平（Extended Fig 8b）。

考慮到方法的不同，作者采用了上文作者使用的 shRNA 敲降 LATS1/2，但發(fā)現(xiàn)敲降 LATS1/2 既不影響 ERα 水平，也不活化 YAP/TAZ。作者猜測(cè)，可能是殘余的 LATS1/2 的量仍足以抑制 YAP/TAZ 活化。

此外，在其它 ER + 乳腺癌細(xì)胞系，及小鼠的輸卵管、乳腺和子宮內(nèi)膜類器官（organoids）模型中，敲除 LATS1/2 均可抑制 ESR1 的表達(dá)。另一方面，在 MCF-7 細(xì)胞中過(guò)表達(dá) LATS1 或其激酶缺失突變體，對(duì) ERα 的蛋白水平?jīng)]有影響。

進(jìn)一步，作者通過(guò)構(gòu)建不同突變體，發(fā)現(xiàn) LATS1/2 對(duì) ESR1 mRNA 水平的維持既依賴于其激酶活性，又需要 YAP/TAZ 蛋白的參與，并且在敲除 LATS1/2 后進(jìn)一步敲除 YAP/TAZ，可以完全挽救 ESR1 表達(dá)，表明 LATS1/2 很有可能是通過(guò)抑制 YAP/TAZ 的活化，從而維持 ESR1 基因的表達(dá)。但 YAP/TAZ 如何抑制 ESR1 基因轉(zhuǎn)錄則尚不明確。

在表型層面上，LATS1/2 雙敲除 MCF-7 細(xì)胞增殖減弱，在荷瘤小鼠中生長(zhǎng)緩慢，對(duì) ERα 抑制劑 4 - 羥基 - 他莫昔芬（4OHT）不敏感，且在其中過(guò)表達(dá) ERα，可以挽救其克隆形成能力。這一結(jié)果說(shuō)明，LATS1/2 的缺失降低了 ERα 表達(dá)量，從而抑制了 MCF-7 細(xì)胞的生長(zhǎng)。

 LATS1/2 敲除減緩 MCF-7 細(xì)胞生長(zhǎng)

綜上所述，盡管機(jī)制不盡相同，但管組的這篇文章與 2017 年這篇 Nature 的大部分結(jié)果相悖。那么，原文的作者又作何回應(yīng)呢？

2021 年 3 月 3 日，Mohamed Bentires-Alj 課題組于 Nature 發(fā)表回應(yīng)，提出了可能導(dǎo)致雙方如此迥異的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因：

1. 第一個(gè)焦點(diǎn)集中于使用 CRISPR 敲除和 shRNA 敲低 LATS1/2 所帶來(lái)的差異。Bentires-Alj 組發(fā)現(xiàn)，shRNA 載體慢病毒高滴度感染細(xì)胞會(huì)遲滯其生長(zhǎng)，但根據(jù)原文結(jié)果，LATS1/2 表達(dá)量應(yīng)該與 ERα 表達(dá)量負(fù)相關(guān)，降低 LATS1/2 表達(dá)量應(yīng)該會(huì)使細(xì)胞生長(zhǎng)加快。這表明中等程度的降低 LATS1/2 的表達(dá)量和大幅降低乃至敲除 LATS1/2，可能會(huì)造成不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果。作者猜測(cè)，敲除 LATS1/2 帶來(lái)的 YAP/TAZ 異常持續(xù)活化可能對(duì)細(xì)胞狀態(tài)有較大的改變，從而使細(xì)胞啟動(dòng)某些不為人知的代償通路以維持穩(wěn)態(tài)，從而改變了 Hippo 通路對(duì) ERα 的調(diào)控模式。此外，在 LATS1/2 過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，Alj 組使用的是瞬間轉(zhuǎn)染，而管組使用的是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，作者認(rèn)為這或許會(huì)帶來(lái)一定差異。

2. 其次，雙方使用的細(xì)胞培養(yǎng)條件有部分不同。Bentires-Alj 組使用的是 M5 培養(yǎng)基培養(yǎng) PHBECs 和 MCF10A 細(xì)胞，鑒于這一培養(yǎng)基可以維持乳腺上皮細(xì)胞的增殖和分化，其對(duì) ERα 及相關(guān)因子的影響可能與 DMEM 等標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基不同。

此外，雖然雙方均使用了 MCF-7 細(xì)胞系，但由于癌細(xì)胞的高度異質(zhì)性和基因組不穩(wěn)定性，或許雙方實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞是不同的亞克隆，在生理生化性質(zhì)上其實(shí)有較大差異。

3. 作者認(rèn)為，雙方報(bào)道的機(jī)制也許都是真實(shí)的，可能只是 Hippo 通路對(duì) ERα 在不同條件下的正向和負(fù)向調(diào)控。并且可能與不同的 Hippo 通路上游信號(hào)有關(guān)（見(jiàn)本推送圖 1）。作者提出，管組文章 Fig 1-o 中，敲除 LATS1/2 徹底消除了 ERα 的表達(dá)，但只敲除 YAP/TAZ，ERα 的表達(dá)量只是稍微上調(diào)，說(shuō)明 ERα 的表達(dá)調(diào)控可能存在更復(fù)雜的機(jī)制。

 敲除 LATS1/2 和（或）YAP/TAZ 對(duì) ERα 表達(dá)的影響

筆者認(rèn)為，Alj 組的回應(yīng)在一定程度上是有道理的，但尚不足以完全解釋兩篇文章的差異。Alj 組的原文中，在 PHBECs 中敲降 LATS1/2 后，并未產(chǎn)生典型的 YAP/TAZ 靶基因轉(zhuǎn)錄譜（Extended Fig 3），且 ESR1 mRNA 水平上調(diào)（Fig 4a）。說(shuō)明 PHBECs 中，YAP/TAZ 的調(diào)控機(jī)制與乳腺癌細(xì)胞中或許不同，可能源于 YAP/TAZ 的不同翻譯后修飾或輔因子，從而對(duì) ESR1 的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生不同的調(diào)控效應(yīng)。

但是，Alj 組在 MCF-7、T47D 等乳腺癌細(xì)胞中的表型實(shí)驗(yàn)，和蛋白水平的機(jī)制實(shí)驗(yàn)（Fig 4b-e, Extended Fig 8, Fig 9），也都得到了支持其結(jié)論的結(jié)果。當(dāng)然，這并不能說(shuō)明 Alj 組的結(jié)論一定不可靠，其蛋白機(jī)制部分的實(shí)驗(yàn)還亟需驗(yàn)證。同時(shí)，管組報(bào)道的結(jié)果也只是表型實(shí)驗(yàn)居多，也需要更深入的機(jī)制探究。

除上文外，其它文獻(xiàn)亦報(bào)道了 Hippo 與 ERα 的關(guān)系。YAP1/TEAD4 可以作為 ERα 的輔因子，促進(jìn) ERα 相關(guān)增強(qiáng)子的激活，從而促進(jìn) ERα 下游信號(hào)通路的激活及 ER + 乳腺癌的進(jìn)展 ^[5]。ERα 亦對(duì) Hippo 通路有影響：ER + 乳腺癌中，CRABP2 可以結(jié)合 LATS1 并抑制其泛素化降解，從而抑制 YAP/TAZ 的核轉(zhuǎn)位；但 ER - 乳腺癌中，CRABP2 反而促進(jìn) LATS1 泛素化降解，促進(jìn) YAP/TAZ 的活化，但具體機(jī)制尚不明確 ^[6]。這些研究成果說(shuō)明，ER + 乳腺癌細(xì)胞中 ERα 與 Hippo 間可能存在精密的反饋調(diào)控機(jī)制，并受到 CRABP2 等輔因子的調(diào)節(jié)，從而一定程度上造成了上述兩文結(jié)論的差異。

總而言之，真理是越辯越明的。筆者真心希望，不論最終結(jié)果如何，這一爭(zhēng)鳴都能加深人類對(duì)乳腺癌、雌激素受體與 Hippo 通路的認(rèn)識(shí)，為新的靶向療法的開(kāi)發(fā)添磚加瓦，最終造福廣大患者。

原文鏈接:

Alj 組原文：https://www.nature.com/articles/nature20829

管坤良組原文：https://www.nature.com/articles/s41586-020-03131-5

Alj 組回應(yīng)：https://www.nature.com/articles/s41586-020-03132-4