Western blot是一項在復雜樣本中檢測蛋白質(zhì)表達水平的技術(shù)，至今已有超過40年的歷史，并成為了蛋白質(zhì)研究中最常用的工具之一。
首先通過SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳使蛋白質(zhì)樣本分離，再將凝膠上的蛋白電泳轉(zhuǎn)移到固相載體上（NC膜或者PVDF膜），方便后續(xù)印跡顯影操作，然后使用封閉液將封閉非特異位點，以避免抗體的非特異性吸附，這樣固定的蛋白質(zhì)即可與特異性的多克隆或單克隆抗體相互作用。最后通過化學發(fā)光法或熒光方法進行蛋白條帶顯影。
其中SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳條件是關(guān)系到蛋白條帶是否均一、整齊、干凈的關(guān)鍵步驟，下面小編整理了SDS-PAGE電泳的原理與操作關(guān)鍵，為你理清每一個關(guān)鍵試劑和操作的背后的故事。
SDS-PAGE （十二烷基硫酸鈉–聚丙烯酰胺，sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis）凝膠電泳是一種可以根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量分離樣本中蛋白的技術(shù)。在電荷的影響下分離大分子稱為電泳（electrophoresis）。在SDS-PAGE中使用的凝膠是聚丙烯酰胺（polyacrylamide），使蛋白質(zhì)呈線性化的試劑是SDS。因此得名SDS-PAGE。首先準備一套蛋白電泳設(shè)備，蛋白質(zhì)樣品和marker上樣到凝膠孔中，設(shè)置電壓，啟動電泳程序。通常樣本中會添加一種還原劑，如巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)(在洗滌劑的存在下，如SDS），可以打開折疊蛋白質(zhì)的二硫鍵；而樣本中加入的SDS洗滌劑可以給所有蛋白質(zhì)加上負電荷，從而將它們線性化成多肽。聚丙烯酰胺則是多肽電泳分離的介質(zhì)。多肽在電場的作用下向陽極方向泳動。蛋白電泳的遷移率與以下三個因素有關(guān)
① 形狀---所有的蛋白質(zhì)在用還原劑處理后都處于一級結(jié)構(gòu)中。因此，形狀不影響蛋白質(zhì)的分離。
② 電荷---經(jīng)過SDS處理后，所有的蛋白質(zhì)都是負電荷， 因此，電荷不影響分離。
③ 大小---蛋白質(zhì)的分離完全與它們的分子量大小有關(guān)。
在電泳中，分子量越小的多肽移動得越快，因為它們遇到的阻力更小。分子量越大的多肽移動得更慢，因為它們遇到的阻力更大。因此蛋白質(zhì)完全是因為分子量大小的不同而分開（如圖1）。
圖1.SDS-PAGE電泳原理
β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）做為還原劑添加入樣品中，可以還原（分解）存在于蛋白質(zhì)的肽鏈上半胱氨酸殘基之間的二硫鍵(S-S鍵)。S-S鍵使蛋白質(zhì)折疊形成二級結(jié)構(gòu)。因為蛋白的構(gòu)象會干擾電泳的遷移率。所以，當電泳時，消除蛋白構(gòu)象對遷移率的干擾非常重要。β-巰基乙醇還原蛋白的二硫鍵為游離的-SH，樣本中所有的蛋白都變成線性的一級結(jié)構(gòu)，使其電泳遷移率只與蛋白分子量有關(guān)（圖1）。在制備SDS-PAGE樣品時，將SDS混合在樣品緩沖液中。蛋白樣本用β-巰基乙醇處理后解聚成單一線性；用SDS處理后，所有蛋白質(zhì)均只帶負電荷。SDS可以使所有的蛋白質(zhì)分子均勻的帶上負電荷(圖01)。因此，當施加電壓時，所有的蛋白質(zhì)都向凝膠的正極遷移。因為，不同大小的蛋白質(zhì)得到的負電荷與其分子量成正比，它們只因為分子量大小的不同而分離開，而不是因為帶電荷的多少或者蛋白構(gòu)象。在凝膠中也存在SDS，這是為了確保所有的蛋白質(zhì)在整個凝膠中保持荷載負電荷。溴酚藍是電泳中的示蹤染料，用于監(jiān)測各個蛋白分子電泳過程的進展。BPB與樣品蛋白混合后上樣，當電泳開始時，BPB與蛋白質(zhì)一起遷移，但速度更快，會比樣品中的任何蛋白質(zhì)更快到達凝膠的末端，甚至緩沖液中的甘氨酸分子也在BPB之后到達末端。BPB帶有輕微的負電荷，這就是為什么它可以向陽極遷移，同時又可以作為蛋白質(zhì)分子的示蹤染料。聚丙烯酰胺凝膠是通過使用少量的交聯(lián)劑（如N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺）使單體丙烯酰胺在水中的聚合而成。因此，丙烯酰胺（Acrylamide）和雙丙烯酰胺(Bis-acrylamide)共聚形成了丙烯酰胺的直鏈與雙丙烯酰胺的相互聯(lián)結(jié)形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。圖2: 丙烯酰胺（acrylamide）的直鏈與雙丙烯酰胺（bisacryamide）的相互聯(lián)結(jié)形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)
有其他的交聯(lián)劑可以代替雙丙烯酰胺（bisacrylamide），如：一種可以破壞交聯(lián)劑而使凝膠可溶的試劑；
丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的比例決定了凝膠的孔徑。因此，在不連續(xù)凝膠體系中，會有不同濃度和pH的濃縮膠和分離膠。濃縮膠的目的是將需要分離的蛋白質(zhì)混合物聚集在濃縮膠和分離膠的分界線上。因此，所有的蛋白質(zhì)首先被壓縮累積在分界線上，然后，在大約同一時間進入分離凝膠，無論蛋白質(zhì)的大小是多少。緊隨其后的來自Tris-Gly電泳緩沖液的甘氨酸分子
具備牽引作用的來自Tris-HCL 電泳緩沖液的氯化物離子
當施加電壓后，甘氨酸分子（最簡單的氨基酸）和Cl-開始通過凝膠向正極遷移。由于甘氨酸分子在濃縮膠中以兩性離子的形式存在，其電泳遷移速率非常慢。氯離子比甘氨酸分子遷移得更快，產(chǎn)生了不平衡的正反離子區(qū)域，從而在氯離子和甘氨酸離子之間形成了很大的電壓梯度。 在甘氨酸分子（最慢的)和氯離子(最快的）之間存在樣本混合物中的所有蛋白質(zhì)（圖03）。樣品分子在氯化物和甘氨酸之間中間遷移，逐漸被壓縮成非常薄而清晰的蛋白層，方便后面更好的蛋白分離。在這個階段，樣本蛋白分子處于兩種離子（后面的甘氨酸和前面的氯離子Cl-）之間，在濃縮膠和分離膠之間形成薄薄的一層。圖3: 濃縮膠的作用
當?shù)鞍追肿拥竭_分離膠界面時發(fā)生了什么？當?shù)竭_分離膠時，pH值增大，孔徑急劇減小。在更高的pH值下，甘氨酸分子不再以兩性離子的形式存在，它們在這個階段就會電離，并開始比在濃縮膠中時遷移得更快。氯離子Cl-很快就會向陽極遷移。因此，一旦蛋白質(zhì)不堆積，甘氨酸分子很快難以束縛樣品蛋白質(zhì)分子，蛋白質(zhì)分子開始在電流的作用下按照分子量大小自由的分離。(圖4)圖4.
凝膠的聚合是通過自由基機制發(fā)生的。TEMED(N，N，N，N-四甲基乙二胺)作為催化劑，生成硫酸鹽自由基。過硫酸銨是提供形成自由基的硫酸鹽基團的。這些用于自由基生成的硫酸鹽由過硫酸銨提供，如圖02所示。制備分離膠需要兩塊玻璃板，一個短板，一個長板，將兩塊玻璃板夾在制膠架上（圖5），灌膠完成后，加異丙醇趕走凝膠上面的氣泡。關(guān)于灌膠的高度，這可以通過放置梳子確定，一般大約梳子下1cm,用筆標記制膠的高度，開始灌膠，加異丙醇封膠。等待膠凝固后，倒掉上層異丙醇，用吸水紙吸干異丙醇。圖05: SDS PAGE制膠架
當下層的分離膠凝固后，就可以開始直接加積層膠至玻璃最上層，然后插入梳子。等待積層膠凝固后，小心拔出梳子，避免用力過猛破壞了凝膠上樣孔。用微量移液器向凝膠孔中依次加入蛋白marker和樣本，蛋白marker是已知蛋白條帶分子量的預染蛋白，可作為標定蛋白大小的標尺參考。然后依次點入其他樣本至凝膠孔中。每孔的樣本上樣量保持一致（主要是質(zhì)量一致），加樣時要小心，確保不損壞加樣孔的尺寸或不將樣品溢出孔外，更不能把樣本加到孔外。在這個階段，蛋白質(zhì)的樣品是藍色的，因為在制備樣品時使用了電泳指示劑染料--溴酚藍圖. 06: 上樣至孔中
將凝膠和玻璃板浸入電泳緩沖液中后，就可以開始設(shè)定電壓和時間，開始電泳了。當示蹤染料到達或穿過凝膠時，停止電泳。考馬斯亮藍染色或者進行蛋白轉(zhuǎn)膜以進行后續(xù)的免疫印跡實驗用去離子水沖洗凝膠3-5次，以去除SDS和緩沖液。它可能會阻礙染料（0.1%考馬斯藍）與蛋白質(zhì)的結(jié)合。然后將凝膠浸泡在考馬斯藍染液中染色，室溫，搖床孵育。一般蛋白質(zhì)條帶會在幾分鐘內(nèi)開始出現(xiàn)，但完全染色大約需要1小時（圖06）。
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