北京中醫(yī)藥大學(xué) | 董雷
目的:近年來(lái),男性不育的發(fā)病率明顯增加,少弱精子癥作為導(dǎo)致男性不育的重要原因之一,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,臨床無(wú)特效治療藥物。中醫(yī)在少弱精子癥中的治療作用逐漸得到認(rèn)可,中醫(yī)治療少弱精子癥可能成為一種更為安全有效的治療手段。李海松教授臨床治療少弱精子癥經(jīng)驗(yàn)獨(dú)到,臨床治療效果滿意,借助“中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)系統(tǒng)(V2.5)”軟件,分析李海松教授治療少弱精子癥的用藥規(guī)律和學(xué)術(shù)思想,并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),基于細(xì)胞凋亡信號(hào)通路探索其核心處方治療少弱精子癥的分子機(jī)制。方法:數(shù)據(jù)挖掘:篩選收集李海松教授于2017年9月1日至2018年3月30日在北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院男科特需門診治療的少弱精子癥患者病例,建立數(shù)據(jù)庫(kù),并將醫(yī)案處方錄入“中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)(V2.5)”中,對(duì)處方中藥物的使用頻次、四氣五味、歸經(jīng)等基本信息統(tǒng)計(jì)分析;利用關(guān)聯(lián)規(guī)則分析、復(fù)雜系統(tǒng)熵聚類等無(wú)監(jiān)督數(shù)據(jù)挖掘方法,挖掘藥物之間的關(guān)聯(lián)規(guī)則、處方規(guī)律,分析李海松教授治療少弱精子癥用藥經(jīng)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)研究一:50只SPF級(jí)SD大鼠,隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、中藥干預(yù)組和陽(yáng)性對(duì)照組,采用雷公藤多苷(40mg/kg)灌胃四周制造大鼠少弱精子癥模型之后空白對(duì)照組、模型對(duì)照組采用去離子水(10ml/kg)灌胃,中藥干預(yù)組采用廣嗣育麟湯顆粒水懸液(10ml/kg,3g/kg)、陽(yáng)性對(duì)照組采用左卡尼汀水溶液(10ml/kg,0.3mg/kg)灌胃。干預(yù)四周后取材,檢測(cè)大鼠一般狀況、體質(zhì)量、臟器系數(shù)、精液質(zhì)量,采用western blot以及Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)GDNF、Ret、PI3K、Akt、Bcl-2、Bax及其mRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)二:30只SPF級(jí)SD大鼠,隨機(jī)分為空白對(duì)照組、抑制劑組、中藥+抑制劑組。空白對(duì)照組:自實(shí)驗(yàn)起始日,經(jīng)尾靜脈注射DMSO溶液5 ml/kg,1次/周,連續(xù)8周;抑制劑組:自實(shí)驗(yàn)起始日,經(jīng)尾靜脈注射DMSO配制后的LY294002 5ml/kg(0.1mg/ml),1次/周,連續(xù)8周;中藥+抑制劑組:自實(shí)驗(yàn)起始日,經(jīng)尾靜脈注射DMSO配制后的LY2940025 ml/kg(0.1mg/ml),1次/周,連續(xù)8周,第五周起每日9時(shí)給予中藥顆粒劑水懸液(10ml/kg,3g/kg)灌胃干預(yù)。八周后取材,檢測(cè)大鼠一般狀況、體質(zhì)量、臟器系數(shù)、精液質(zhì)量,采用western blot以及Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)GDNF、Ret、PI3K、Akt、Bcl-2、Bax及其mRNA的表達(dá)。結(jié)果:數(shù)據(jù)挖掘:共納入398張?zhí)幏?共包含111味中藥,總頻次8776次。藥性以平、溫、寒為主,其中平性藥物應(yīng)用最多,溫性藥物次之,寒性藥物使用頻次第三,與溫性藥物幾乎相當(dāng),相差不多。藥味以甘味最多,苦味、辛味、酸味次之,咸和澀味藥物少用。藥物歸經(jīng)多屬于肝、腎、脾經(jīng)。使用頻率較高的藥物有
五味子、構(gòu)杞子、熟地黃、車前子、菟絲子、黃芪、覆盆子、當(dāng)歸、山藥、牡蠣、茯苓、水蛭、松花粉、赤芍、白芍、黃精、麥芽、黨參、敗醬草、甘草等。
根據(jù)關(guān)聯(lián)規(guī)則分析,治療少弱精子癥核心的藥物組合為
枸杞子、五味子、車前子、菟絲子、覆盆子、熟地黃、當(dāng)歸、黃芪、牡蠣、山藥、茯苓之間的組合,基于復(fù)雜系統(tǒng)熵聚類,我們得到了新核心藥物組合7組,應(yīng)用無(wú)監(jiān)督熵層次聚類算法,進(jìn)一步分析得到新處方7首。實(shí)驗(yàn)一:在睪丸、附睪組織臟器、精子計(jì)數(shù)、精子活力方面,模型對(duì)照組、中藥干預(yù)組、陽(yáng)性對(duì)照組皆低于空白對(duì)照組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,附睪組織臟器、精子計(jì)數(shù)方面,中藥干預(yù)組和陽(yáng)性對(duì)照組皆高于模型組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在睪丸、附睪組織臟器、精子計(jì)數(shù)、向前運(yùn)動(dòng)精子百分率改善方面,中藥干預(yù)組、陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著差異,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,精子總活力改善方面,中藥干預(yù)組優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在蛋白和mRNA表達(dá)方面,與空白組相比,模型對(duì)照組、中藥干預(yù)組和陽(yáng)性對(duì)照組GDNF、Ret、PI3K、Akt、Bcl-2表達(dá)皆有一定程度的下降,Bax表達(dá)上升,其中模型對(duì)照組和空白對(duì)照組具有明顯差異,各蛋白及mRNA表達(dá)皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中藥干預(yù)組與模型對(duì)照組相比在RET、PI3K、Bcl-2、Bax表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中藥干預(yù)組和陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)二:在睪丸、附睪組織臟器、精子計(jì)數(shù)、精子活力方面,抑制組和中藥+抑制劑組皆低于空白對(duì)照組,中藥+抑制劑在附睪組織臟器、精子計(jì)數(shù)、精子活力方面有改善作用,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在蛋白和mRNA表達(dá)方面,GDNF、Ret三組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,PI3K、Akt、Bcl-2,Bax表達(dá)上,抑制劑組和中藥+抑制劑組皆低于空白對(duì)照組,中藥+抑制劑組和抑制劑組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)論:
1.李海松教授治療少弱精子癥常用藥物有五味子、枸杞子、熟地黃、車前子、菟絲子、黃芪、覆盆子、當(dāng)歸、山藥、牡蠣、茯苓,其中種子類藥物較多。
所有核心藥物組合為枸杞子、五味子、車前子、菟絲子、覆盆子、熟地黃、當(dāng)歸、黃芪、牡蠣、山藥十味藥物,也恰好是李海松教授臨床治療少弱精子癥的基礎(chǔ)方“廣嗣育麟湯”的組成。
2.李海松教授治療少弱精子癥的學(xué)術(shù)思想和用藥經(jīng)驗(yàn):(1)少弱精子癥的根本病機(jī)是陰陽(yáng)失和,病理改變以腎虛為本,大多兼夾濕熱、血瘀、痰濕。(2)少弱精子癥病位在腎,與肝脾密切相關(guān)。(3)李海松教授在臨證治療少弱精子癥時(shí)以“補(bǔ)腎生精為則,以微調(diào)陰陽(yáng)為法”,用藥時(shí)寒熱溫涼搭配,強(qiáng)調(diào)攻補(bǔ)兼施,以期達(dá)到“陰平陽(yáng)秘”的狀態(tài)。(4)李海松教授在臨床治療少弱精子癥時(shí)多以辨病與辨證相結(jié)合的方式,在基礎(chǔ)方劑“廣嗣育麟湯”的基礎(chǔ)上,根據(jù)個(gè)人辯證情況,輔以補(bǔ)肝健脾、行氣活血、清熱利濕等相應(yīng)藥物。3.李海松教授核心處方“廣嗣育麟湯”可以有效改善雷公藤多苷和抑制劑LY294002所致的少弱精子癥大鼠的一般狀態(tài)、生殖器官臟器系數(shù)、精液質(zhì)量.4.廣嗣育麟湯治療少弱精子癥的分子機(jī)制與GDNF/Ret-PI3K/Akt-Bcl-2/Bax細(xì)胞凋亡密切相關(guān),其機(jī)制可能為通過(guò)促進(jìn)GDNF、Ret、PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表達(dá),抑制Bax蛋白表達(dá),從而產(chǎn)生抑制少弱精子癥大鼠生精細(xì)胞凋亡的作用,并且廣嗣育麟湯可能存在多靶點(diǎn)多通路的的作用機(jī)制。
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