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HBV感染目前仍是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，威脅著人類的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球現(xiàn)有2.57億慢性HBV感染者，每年約有88.7萬人死于HBV感染所導(dǎo)致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝癌。HBV是正鏈不完整的部分雙鏈DNA病毒，屬嗜肝DNA病毒家族，家族中還包括鴨乙型肝炎病毒（DHBV）和土撥鼠肝炎病毒（WHV）等。HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）以超螺旋微小染色體形式存在于肝細(xì)胞核內(nèi)，是啟動(dòng)病毒RNA轉(zhuǎn)錄和后續(xù)翻譯、復(fù)制的關(guān)鍵模板,是維持HBV慢性感染狀態(tài)的關(guān)鍵因素，且cccDNA結(jié)構(gòu)高度穩(wěn)定，難以清除。檢測cccDNA對進(jìn)一步認(rèn)識(shí)HBV的致病機(jī)制及指導(dǎo)抗病毒藥物使用有重要意義，但傳統(tǒng)的檢測手段存在靈敏度或特異度方面的不足，并且只能反映出樣本中cccDNA的平均水平。原位雜交技術(shù)（ISH）在研究cccDNA的組織分布、豐度變化等方面有著重要意義，可為HBV的研究提供新信息，現(xiàn)就近年來ISH的發(fā)展以及在慢性乙型肝炎中的應(yīng)用綜述如下。

1  HBV復(fù)制特點(diǎn)和cccDNA的生物學(xué)特性

HBV基因組全長為3.2 kb，其成熟病毒顆粒以松弛環(huán)狀DNA（rcDNA）的形式存在。當(dāng)HBV感染宿主肝細(xì)胞時(shí)，在NTCP等受體的介導(dǎo)下進(jìn)入肝細(xì)胞胞漿，rcDNA脫去結(jié)合于其負(fù)鏈的HBV聚合酶pol成為脫蛋白松弛環(huán)狀DNA (PF-rcDNA),隨后核衣殼解聚，并釋放PF-rcDNA至細(xì)胞核中。胞核中的PF-rcDNA通過進(jìn)一步修復(fù)，形成超螺旋的cccDNA。HBV以cccDNA 作為模板轉(zhuǎn)錄出病毒亞基因組RNA,于胞漿中翻譯成病毒各蛋白，其中轉(zhuǎn)錄出的pgRNA不僅作為mRNA翻譯產(chǎn)生病毒聚合酶pol及核心蛋白Core，還作為逆轉(zhuǎn)錄模板被包裝于核心顆粒中，從而形成成熟的核心顆粒，隨后被外膜蛋白包裹產(chǎn)生子代病毒粒子釋放至胞外。此外，新生的成熟核心顆粒還可再次入核，擴(kuò)充細(xì)胞的 cccDNA 儲(chǔ)存庫。已有的大量研究提示HBV cccDNA高度穩(wěn)定是HBV持續(xù)感染的關(guān)鍵。

目前臨床上用于治療慢性乙型肝炎的藥物主要有兩類，即干擾素和核苷類似物。干擾素治療中，約有30%~40%的患者產(chǎn)生HBV DNA陰轉(zhuǎn)，HBeAg血清轉(zhuǎn)換的病毒學(xué)應(yīng)答，有不到10%的患者可發(fā)生HBsAg陰轉(zhuǎn)，但其副作用較多，且不適用于失代償期乙型肝炎患者。核苷類似物對HBV復(fù)制的抑制效果較好，但無法清除cccDNA，HBsAg清除率極低，停藥后容易反彈，因此需長期服藥。HBV cccDNA水平是指導(dǎo)臨床慢性乙型肝炎抗病毒治療的重要依據(jù)之一，cccDNA的清除也是抗病毒治療期望達(dá)到的最佳終點(diǎn)之一。如何有效耗竭或清除肝臟中殘余的cccDNA，是目前著眼于治愈乙型肝炎的藥物、免疫治療研究的重要目標(biāo)。

2  HBV cccDNA檢測的技術(shù)困難

對肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA的監(jiān)測被認(rèn)為是評(píng)估抗病毒藥物療效以及臨床治愈的金標(biāo)準(zhǔn)。但是，HBV cccDNA的定量檢測存在一系列難點(diǎn)。首先，缺乏合適的研究模型，通過對DHBV的研究，已經(jīng)對cccDNA的形成及維持有了大致的了解，但它不能反映慢性乙型肝炎患者體內(nèi)真實(shí)的情況。其次，慢性感染者肝穿刺標(biāo)本比較珍貴，且相對DHBV、WHV慢性感染標(biāo)本，HBV cccDNA含量較低（0.1~1拷貝/細(xì)胞）。更重要的是，目前缺乏既靈敏準(zhǔn)確又操作簡便的檢測技術(shù)。Southern blot是檢測cccDNA的傳統(tǒng)方法，雖然其受到廣泛的承認(rèn)，但此法靈敏度低，操作復(fù)雜，不適用于大量臨床標(biāo)本的檢測；而后期開發(fā)的cccDNA特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）靈敏度高，操作便捷，但其特異性有待提高。此外，考慮到 cccDNA在患者肝組織內(nèi)的分布是不均一的，傳統(tǒng)的定量檢測方法只能反映出其平均水平，無法顯示其在空間上的定位信息，因此亟需開發(fā)特異度、靈敏度更高的，且反映cccDNA空間定位信息的檢測方法。

3  ISH的發(fā)展及在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用

ISH是將特定標(biāo)記的已知序列核酸作為探針與細(xì)胞或者組織切片中核酸進(jìn)行雜交并對其進(jìn)行檢測的方法，能夠在細(xì)胞和染色體水平上顯示特異性核酸的分布及其意義。1969年，Pardue和Gall利用放射性同位素標(biāo)記的RNA探針成功檢測到非洲爪蟾細(xì)胞核內(nèi)的rDNA，同年John等使用的放射性標(biāo)記探針，利用放射自顯影檢測一些高度重復(fù)序列DNA在染色體上的定位，開創(chuàng)了ISH這一全新技術(shù)。不過，由于同位素標(biāo)記探針存在放射性污染、穩(wěn)定性差、操作耗時(shí)等缺點(diǎn)，科學(xué)家們逐漸開始研究非放射性標(biāo)志物來替代同位素。1981年，Bauman等將RNA 探針的3′端用熒光素進(jìn)行標(biāo)記，并檢測到了目的DNA。同年，Langer等首次采用了生物素標(biāo)記核苷酸探針，并成功地進(jìn)行了染色體原位雜交，建立了非放射性ISH。1987年, Boeringer Mannheim公司將地高辛標(biāo)記的有關(guān)試劑投放市場。非放射性標(biāo)記探針（生物素、地高辛等）使得ISH更加安全方便，且提高了分辨率，逐漸替代了放射性標(biāo)記探針。

隨著技術(shù)發(fā)展，ISH與其他技術(shù)結(jié)合，在病毒學(xué)研究方面發(fā)揮了重要作用。Haase等于1990年建立了一種將PCR技術(shù)和ISH相結(jié)合的原位多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù) (in situ PCR)，相比傳統(tǒng)的ISH，該技術(shù)可將感染細(xì)胞中梅迪-維斯納病毒DNA檢測的靈敏度提高2個(gè)數(shù)量級(jí)。

在定量PCR技術(shù)出現(xiàn)之前，Chiron公司開發(fā)的支鏈DNA(branched DNA，bDNA)信號(hào)放大技術(shù)曾是病毒載量檢測的主導(dǎo)技術(shù)。bDNA技術(shù)是一種不依賴分子擴(kuò)增的核酸雜交信號(hào)放大檢測技術(shù)。當(dāng)探針特異捕獲目標(biāo)核酸后，可結(jié)合多個(gè)酶標(biāo)志物的bDNA與探針結(jié)合，進(jìn)而通過分支上酶標(biāo)志物的發(fā)光獲得放大的靶標(biāo)信號(hào)，從而大大提高了原位雜交的靈敏度，同時(shí)也可保證檢測的高特異度。bDNA可實(shí)現(xiàn)HIV-1 RNA、HBV DNA、HCV RNA等病毒核酸的高靈敏度定量。在組織切片水平，bDNA技術(shù)也顯示了良好的信號(hào)放大能力，例如針對人乳頭瘤病毒設(shè)計(jì)的探針可檢測到病毒的mRNA與DNA，并在混合細(xì)胞中成功區(qū)分人乳頭瘤病毒的不同亞型。由Panomics研發(fā)推廣的ViewRNA系列試劑盒就是基于bDNA放大機(jī)制的單細(xì)胞單拷貝級(jí)別靈敏度的ISH。其主要特點(diǎn)是采用了特異性的雙Z探針，避免了傳統(tǒng)長鏈RNA探針的弊端，提高了特異度，配以級(jí)聯(lián)放大檢測原理，可以高效敏感地檢測到目標(biāo)RNA。

4  ISH應(yīng)用于HBV核酸檢測的進(jìn)展

ISH對闡明肝內(nèi)病毒的傳播和分布, 病毒的復(fù)制機(jī)理, 致癌和致病機(jī)理等研究起著十分重要的作用。因此，利用高靈敏度的ISH檢測肝組織切片上病毒核酸的信號(hào)及空間分布顯得非常必要。

4.1  ISH檢測HBV DNA、RNA

1981年，Gowans等應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記探針，檢測HBV感染肝細(xì)胞內(nèi)的HBV DNA，首次將ISH引入HBV的研究。利用ISH檢測HBV DNA可以觀察到其在肝組織內(nèi)分布特點(diǎn)，ISH還可以與免疫組化相結(jié)合，在同一份組織樣本上同時(shí)顯示出胞內(nèi)核酸與抗原的定位信息，從而反映不同病程中肝內(nèi)HBV DNA分布的變化情況，幫助進(jìn)一步認(rèn)識(shí)HBV生活周期。

為了進(jìn)一步提高ISH檢測組織中HBV DNA靈敏度，特別是組織中低拷貝的核酸，Nuriya等通過設(shè)計(jì)特異性探針，調(diào)節(jié)蛋白酶的種類、濃度和處理時(shí)間，控制PCR循環(huán)數(shù)等方式優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，提高了原位PCR特異度，成功在感染組織中定位出DNA與RNA，并通過多次實(shí)驗(yàn)證明該方法的重復(fù)性較好。原位PCR有著更高的靈敏度，但是特異度仍然是個(gè)挑戰(zhàn)。

相比原位PCR,基于bDNA的信號(hào)放大技術(shù)在檢測HBV DNA及RNA時(shí)更有一系列優(yōu)勢：（1）無需經(jīng)受溫度循環(huán)，更好保存樣本原始形態(tài)；（2）不用考慮組織中存在酶抑制劑而影響PCR擴(kuò)增效率的情況；（3）避免了交叉污染或者擴(kuò)增產(chǎn)物向臨近細(xì)胞擴(kuò)散。這些技術(shù)為臨床醫(yī)生提供了直接定量定位HBV DNA及RNA的能力，在HBV基本病毒學(xué)的研究和臨床應(yīng)用中非常適用。

4.2  ISH檢測HBV cccDNA

在1998年，Yeh等首次報(bào)道了將ISH用于cccDNA檢測，研究者在整合有HBV基因組的HepG2細(xì)胞中，用地高辛標(biāo)記的RNA探針檢測到了cccDNA，但該體系未在肝組織中驗(yàn)證。Zhong等還嘗試了將結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）與原位PCR相結(jié)合，在RCA處理之后采用5′端標(biāo)記地高辛的cccDNA特異探針進(jìn)行原位PCR，最終可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)檢測到2個(gè)拷貝cccDNA的靈敏度，可反映出cccDNA水平與肝組織病理學(xué)特征的關(guān)聯(lián)，從而評(píng)價(jià)抗病毒治療效果。但該方案中還有些不足，比如原位PCR可能導(dǎo)致擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物擴(kuò)散到鄰近細(xì)胞，以及交聯(lián)的組蛋白或其他cccDNA結(jié)合蛋白可能阻礙PCR的有效擴(kuò)增。

2016年，本課題組改進(jìn)了ViewRNA技術(shù)，在bDNA信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)基礎(chǔ)上二次開發(fā)，成功建立了一種能在組織水平顯示cccDNA分布的ISH。該方案設(shè)計(jì)了3組探針分別針對HBV DNA正鏈、負(fù)鏈以及rcDNA正鏈的缺口處，經(jīng)過相應(yīng)的酶處理，可以特異地檢測到HBV DNA（正鏈或負(fù)鏈）、HBV RNA（pgRNA或總HBV RNA）以及cccDNA。同時(shí)該方法可以與HBV主要抗原的免疫組化或免疫熒光結(jié)合，獲得了病毒核酸與抗原的綜合圖像，并由此提出了在單細(xì)胞水平HBV存在“抗原富集期”“DNA富集期”和“潛伏期”的三階段假說，為進(jìn)一步針對患者不同病情設(shè)計(jì)清除HBV cccDNA提供理論基礎(chǔ)。當(dāng)然，該方法也存在一些局限性，比如在HBV的生活周期中可能發(fā)生HBV DNA整合到基因組的情況，而該方案中的cccDNA檢測探針無法區(qū)分cccDNA與整合DNA。

4.3  熒光ISH檢測HBV cccDNA

上述ISH通常使用化學(xué)顯色法，雖然此法在臨床應(yīng)用較廣，但其空間分辨率具有一定限制，無法揭示核酸在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的精細(xì)定位。而熒光標(biāo)記探針通過寬場顯微鏡成像的理論分辨率可達(dá)200 nm左右，因此熒光ISH可獲得病毒在細(xì)胞內(nèi)高分辨率圖像。Li等建立了以生物素標(biāo)記探針、熒光標(biāo)記親和素為基礎(chǔ)的FISH檢測體系，分別在模擬有無抗病毒治療的情況下，觀測DHBV cccDNA與HBV核內(nèi)DNA在細(xì)胞分裂時(shí)的命運(yùn)。該研究有助于加深對HBV生活周期的理解，有助于未來進(jìn)一步確認(rèn)cccDNA在核內(nèi)儲(chǔ)西藏域的研究。此外，本課題組也在前期工作基礎(chǔ)上，在bDNA放大體系的最后一步改為熒光標(biāo)記的Label probe，建立了一套熒光ISH，在HBV復(fù)制系統(tǒng)HepAD38及感染系統(tǒng)HepG2-NTCP中，使用3D-STORM 和3D-SIM成像系統(tǒng),獲得了HBV RNA和DNA的圖像，提高了空間分辨率，有助于進(jìn)一步剖析HBV在宿主細(xì)胞內(nèi)傳播過程中的關(guān)鍵分子事件，并驗(yàn)證cccDNA維持和轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵表觀調(diào)控因子。由于細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中存在正鏈相對完整的rcDNA，因此無法完全確保針對正鏈缺口區(qū)域的探針對cccDNA的特異性。盡管如此，憑借FISH的高分辨率，可利用cccDNA染色質(zhì)化的特點(diǎn)，通過與組蛋白的共同染色，確定核內(nèi)HBV DNA的分子性質(zhì)。HBV熒光ISH的建立將幫助研究者深入探討病毒感染、擴(kuò)增周期中關(guān)鍵事件（cccDNA轉(zhuǎn)錄，pgRNA翻譯與核衣殼包裝、病毒成熟釋放等）的分子機(jī)制，為鑒定病毒復(fù)制關(guān)鍵宿主因子、開發(fā)新一代抗病毒藥物提供線索。

5  挑戰(zhàn)與展望

ISH相比其他傳統(tǒng)的HBV核酸和cccDNA檢測技術(shù)，主要優(yōu)勢在于能夠顯示各類型核酸在組織上的位置分布和豐度變化，為HBV發(fā)病機(jī)制研究提供組織學(xué)信息。HBV DNA與cccDNA的ISH有望與病毒抗原的免疫組化相結(jié)合，納入到慢性乙型肝炎臨床病理常規(guī)檢查。當(dāng)然，要達(dá)到臨床應(yīng)用，相關(guān)技術(shù)在檢測靈敏度以及特異度方面仍需進(jìn)一步提高。

在乙型肝炎相關(guān)臨床、基礎(chǔ)研究方面，ISH擁有多項(xiàng)獨(dú)特的優(yōu)勢。首先，ISH可與其他檢測方法，如免疫組化與特殊染色聯(lián)用，以獲取病毒復(fù)制與慢性乙型肝炎組織學(xué)進(jìn)展的相互關(guān)系，未來也有望和其他新技術(shù)（如單細(xì)胞質(zhì)譜技術(shù)、單細(xì)胞表達(dá)譜技術(shù)等）聯(lián)合運(yùn)用，加深對病毒致病機(jī)制的理解。其次，在乙型肝炎相關(guān)細(xì)胞、動(dòng)物模型中，如將熒光ISH與超分辨率顯微成像技術(shù)相結(jié)合，可獲得HBV復(fù)制過程中一些關(guān)鍵過程的納米尺度圖像，為病毒與宿主相互作用以及藥物靶標(biāo)的深度研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)基礎(chǔ)。

總之，HBV核酸和cccDNA的原位檢測對于臨床評(píng)價(jià)慢性乙型肝炎疾病狀態(tài)，指導(dǎo)抗病毒藥物運(yùn)用以及深入研究HBV生活周期等方面，有著非常重要的意義。ISH的進(jìn)一步優(yōu)化無疑將加速上述研究的進(jìn)展。