自噬是一種溶酶體降解途徑，它不僅有助于提供營養(yǎng)物質(zhì)，還能夠清除有害物質(zhì)，如錯誤折疊的蛋白質(zhì)和入侵的微生物，幫助支持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和生存。因此，自噬缺陷與多種人類疾病有關(guān)。
在神經(jīng)退行性病變中，神經(jīng)元自噬功能紊亂和異常蛋白質(zhì)聚集折疊是神經(jīng)退行性疾病的主要病理改變。
經(jīng)典的神經(jīng)退行性疾病有一些關(guān)鍵性蛋白，例如，阿爾茨海默病(AD)的淀粉樣前體蛋白(APP)的Aβ和c末端片段(CTF)，帕金森病(PD)的突變α-synuclein，亨廷頓病(HD)的聚谷氨酰胺(polyQ)擴(kuò)增型亨廷頓蛋白(mHtt)。另外，自噬受體的基因突變，如p62、OPTN、NBR1和ALFY/WDFY3，常與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。
越來越多的證據(jù)表明，自噬與神經(jīng)退行性疾病之間的相互作用，不僅自噬活性的降低是疾病的原因之一，而且疾病相關(guān)基因的突變也會在不同階段抑制自噬。
圖1：自噬過程與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白之間的相互作用
接下來，我們整理了常見的神經(jīng)退行性疾?。ò柶澓ＤD、帕金森氏病PD、亨廷頓氏病HD、肌萎縮性側(cè)索硬化癥ALS）與自噬機(jī)制的前沿進(jìn)展，以及自噬調(diào)節(jié)作為這些疾病的治療策略。
2.1
阿爾茲海默?。ˋD）
阿爾茨海默病(AD)是最常見的癡呆形式，其特征是Tau和β-淀粉樣肽兩種蛋白質(zhì)的積累。自噬途徑的缺失已被證實是AD的標(biāo)志。
針對自噬與AD的2種特征蛋白的研究已有很多。我們首先來看，將M1C細(xì)胞暴露于3-MA (2.5 mM, 5 mM)中，與未處理對照組相比，用3-MA處理細(xì)胞可導(dǎo)致Tau蛋白顯著積累(圖2A)。此外，在加入3-MA (5 mM)的Tau蛋白誘導(dǎo)5天后，從細(xì)胞裂解液中檢測到p44陽性Tau蛋白（圖2B）。
圖2：抑制自噬會增加tau蛋白的積累
這說明，自噬抑制劑3-MA對細(xì)胞的處理會導(dǎo)致Tau蛋白更多的積累，提示自噬系統(tǒng)在清除聚集的Tau蛋白方面發(fā)揮著明顯的作用[1]。
另一種蛋白淀粉樣β肽是淀粉樣前體蛋白(APP)降解的結(jié)果。淀粉樣β肽的積累導(dǎo)致自噬小體與溶酶體融合受損，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的積累。此外，編碼早衰素1 (PSEN1)的基因的突變也會導(dǎo)致溶酶體功能受損，淀粉樣β-肽積累。在AD中淀粉樣β-肽的積累和PSEN1突變受到UPR和自噬的保護(hù)。只有細(xì)胞內(nèi)淀粉樣β-肽和PSEN1突變才能通過RYR和ITPR從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子來觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。有趣的是，PSEN1突變會阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器，從而使神經(jīng)元細(xì)胞更容易受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。
圖3：神經(jīng)元細(xì)胞中的 ER 應(yīng)激和 UPR 通路
除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激外，溶酶體pH的改變在AD中也有有效作用。V0 - ATP酶對降低自噬溶酶體的pH值至關(guān)重要。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PSEN1突變導(dǎo)致了V0-ATP酶 a1亞基從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到溶酶體的靶向性缺陷。因此，PSEN1突變導(dǎo)致AD患者通過自噬減少了底物的蛋白水解，因為PSEN1突變患者的pH沒有得到適當(dāng)?shù)木S持[2]。
圖4：PS1 KO囊胚中v-ATPase的溶酶體靶向功能受損
由于自噬過程中自噬小體酸化和組織蛋白酶激活的選擇性損傷，導(dǎo)致基質(zhì)蛋白水解和自噬小體清除被阻止。引起早發(fā)性AD的PS1突變在AD患者的成纖維細(xì)胞中產(chǎn)生類似的溶酶體/自噬表型。因此，PS1對于v-ATPase靶向溶酶體、溶酶體酸化和自噬過程中的蛋白水解至關(guān)重要。
2.2
帕金森氏病（PD）
帕金森病是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性運(yùn)動障礙，特征是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失，以及多巴胺的丟失導(dǎo)致運(yùn)動障礙。其主要病理特征包括α-synuclein等基因的遺傳突變。帕金森病已被檢測到包含6個基因的突變，即SNCA、GBA、Parkin (PARK2)、PTEN誘導(dǎo)的推定激酶1 (PINK1)、富含亮氨酸重復(fù)激酶2 (LRRK2)和DJ1，這些基因與疾病的早期發(fā)生有關(guān)。
自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄改變在PD中很常見。在PD癥狀期，中腦大部分多巴胺能神經(jīng)元已經(jīng)缺失，TFEB介導(dǎo)的Beclin-1、CTSD和LAMP1的轉(zhuǎn)錄較癥狀前期降低[3]。
圖5：基因轉(zhuǎn)移介導(dǎo)的自噬刺激保護(hù)DA神經(jīng)元免受α-syn毒性。
研究顯示，過表達(dá)Beclin-1和TFEB對黑質(zhì)DA神經(jīng)元具有強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)作用，可抵抗α- sync誘導(dǎo)的毒性。測量結(jié)果顯示，與GFP對照組相比，Beclin-1和TFEB過表達(dá)組紋狀體TH 末端存活顯著。
葡糖腦苷脂酶(GBA)的突變，是一種降解葡糖神經(jīng)酰胺的溶酶體酶，是帕金森病最常見的遺傳危險因素。研究發(fā)現(xiàn)，散發(fā)性帕金森病患者在早期表現(xiàn)為GBA活性選擇性降低，伴有α-突觸核蛋白內(nèi)含物增加[4]。
圖6：GBA1突變PD患者和nc患者的GCase活性和α-syn物種水平
在N370S GBA1突變攜帶者中，我們觀察到比非攜帶者更低的GCase活性，而這些病例也顯示出比非GBA1突變PD患者更高的t-α-syn水平。
帕金森病中第二常見的遺傳危險因素是富含亮氨酸重復(fù)激酶2(LRRK2/PARK8)基因突變。然而，LRRK2在自噬中的作用是否與PD病理相關(guān)仍存在爭議。有研究表明，LRRK2缺失會破壞自噬-溶酶體途徑，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5]。
圖7：衰老LRRK2?/?小鼠的自噬-溶酶體途徑受損，氧化損傷增加
圖7A，年老的LRRK2?/?小鼠腎臟中脂褐素顆粒異常堆積，脂褐素顆粒的異常積累提示自噬-溶酶體系統(tǒng)受損，并與神經(jīng)退行性疾病(如PD)有關(guān)。為了進(jìn)一步評估LRRK2缺失情況下的自噬功能，作者還評估了自噬小體的標(biāo)記物L(fēng)C3。WB分析顯示，20月齡LRRK2?/?腎臟中LC3-II水平顯著下降(圖7C)，表明LRRK2缺失時自噬小體形成受損。
ATP酶離子轉(zhuǎn)運(yùn)的功能缺失突變體ATP13A2是PD早期發(fā)病的特征，該蛋白主要是利用水解三磷酸腺苷釋能驅(qū)動物質(zhì)跨膜運(yùn)輸，因此對于維持溶酶體的pH至關(guān)重要。研究表明，ATP13A2的突變被證明可以引起α-synuclein的積累，而α-synuclein的沉默可以減輕ATP13A2缺失引起的神經(jīng)毒性[6]，這表明ATP13A2的缺失可能通過α-synuclein的積累參與PD的病理過程。
圖8：ATP13A2的消耗導(dǎo)致α-syn和初級神經(jīng)元的毒性
這些實驗表明，在神經(jīng)元中敲低ATP13A2導(dǎo)致NF染色減少(圖8C)， LDH釋放增加(圖8D)，核凝結(jié)增加(圖8E)，提示ATP13A2功能的喪失導(dǎo)致神經(jīng)元毒性。
2.3
亨廷頓氏?。℉D）
亨廷頓氏病HD是一種常染色體單基因顯性遺傳性神經(jīng)退行性疾病，它會導(dǎo)致主要是身體狀態(tài)，思維認(rèn)知能力和情緒的變化。亨廷頓病患者體內(nèi)的異常亨廷頓蛋白首先會影響其腦內(nèi)的基底核，使得基底核無法修飾或抑制大腦的指令，于是全身肌肉便不受控制地運(yùn)動，表現(xiàn)為舞蹈樣動作。到了疾病的晚期，連負(fù)責(zé)下達(dá)指令的大腦表層也會逐漸死亡，屆時病人可能失去所有行動能力，并出現(xiàn)認(rèn)知功能下降甚至癡呆。導(dǎo)致亨廷頓氏病的蛋白是突變型的亨廷頓蛋白mHtt，這些蛋白形成泛素陽性聚集物，具有豐富的β-sheet結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致紋狀體和皮層的細(xì)胞毒性。
研究表明，mHtt的過表達(dá)可誘導(dǎo)進(jìn)行性運(yùn)動障礙，并伴有自噬小體的積累。
圖9：LC3點(diǎn)狀蛋白和泛素與mhtt聚集物共定位
40周齡HdhQ200雜合子小鼠紋狀體相鄰部分的LC3免疫熒光標(biāo)記顯示，與WT同窩小鼠對照相比，每個神經(jīng)元的LC3點(diǎn)狀點(diǎn)增加了4倍(圖9A)。LC3與AF共定位(圖9B)，一些異常的蛋白聚集物通過泛素化作用被導(dǎo)向自噬-溶酶體降解途徑。
最近對紋狀體的全基因組篩查表明，許多自噬相關(guān)基因，如Atg4b、TFEB和Atlastin 3，似乎可以預(yù)防m(xù)Htt毒性。
圖10：體內(nèi)CRISPR篩選驗證神經(jīng)元必需基因和通路
全基因組篩選已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與維持體內(nèi)神經(jīng)元活力的基因。這些基因?qū)儆谠S多細(xì)胞通路，包括自噬通路、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號和突觸傳遞相關(guān)的通路(圖10G)。研究人員還在這些重要基因中發(fā)現(xiàn)了一組紋狀體富集基因，并預(yù)測抑制這些特定的紋狀體富集基因的mHTT誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄失調(diào)將有助于抑制mHTT毒性。
2.4
肌萎縮性側(cè)索硬化癥（ALS）
肌萎縮性側(cè)索硬化癥是一種衰弱性神經(jīng)肌肉疾病，以脊髓和大腦運(yùn)動神經(jīng)元的進(jìn)行性退化為特征。這些運(yùn)動神經(jīng)元的退化導(dǎo)致神經(jīng)肌肉失神經(jīng)、隨意骨骼肌萎縮，最終導(dǎo)致癱瘓和死亡。目前還沒有治愈這種致命疾病的方法，現(xiàn)有的治療方法效果都比較有限。
迄今為止發(fā)現(xiàn)的幾個ALS相關(guān)基因都與自噬和線粒體吞噬功能有關(guān)，特別是蛋白質(zhì)聚集物和受損線粒體的清除。已知在自噬中起作用的ALS基因包括OPTN、TBK1和SQSTM1等。
這其中，TDP-43是一個多功能的DNA和RNA結(jié)合蛋白，在細(xì)胞內(nèi)的RNA轉(zhuǎn)錄、選擇性剪接及mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮功能。在ALS和額顳葉變性（FTLD）病人脊髓或大腦受損區(qū)域的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中，能檢測到泛素化的蛋白質(zhì)包涵體，TDP-43是其特征性成分。研究表明，自噬激活能減少TDP-43的聚集，并可改善攜帶TDP-43突變的人類運(yùn)動神經(jīng)元的生存[7]。
圖11：自噬刺激改善ALS神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞模型的生存。
研究發(fā)現(xiàn)，攜帶ALS相關(guān)TARDBP突變的人iPSC衍生的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞會積累突變的TDP-43蛋白，這進(jìn)一步支持了過量的TDP-43是疾病發(fā)病機(jī)制的中心的觀點(diǎn)。并且，自噬誘導(dǎo)有效地提高了嚙齒動物神經(jīng)元和人類iPSC來源的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活率。這一研究表明增強(qiáng)TDP-43清除是一種合理的人類疾病的神經(jīng)保護(hù)策略。
UBQLN2是另一個家族性ALS的遺傳風(fēng)險因子，也與自噬有關(guān)。UBQLN2與LC3形成復(fù)合物，并在自噬小體中泛素化貨運(yùn)蛋白。并且，UBQLN2會促進(jìn)自噬體-溶酶體融合[8]。
圖12：泛素與自噬小體共定位，揭示UBQLNs與自噬小體相互作用
結(jié)果顯示，GFP-LC3廣泛共定位，這是自噬小體的標(biāo)記物(圖12A)。UBQLNs和LC3也在內(nèi)源性穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的MCF-10A細(xì)胞中共定位(圖12B)，這排除了過度表達(dá)的假象。
近年來，ALS與p62、OPTN等聚集性受體蛋白的相關(guān)性越來越明顯。我們要知道，大約一半的ALS相關(guān)突變是位于p62的PB1、LIR和UBA區(qū)域，這些區(qū)域負(fù)責(zé)與貨運(yùn)蛋白或LC3的相互作用，這說明源自p62突變的ALS病理可能與蛋白聚集物向自噬小體傳遞效率低下有關(guān)。研究顯示，p62過表達(dá)會減弱由不溶性蛋白聚集物引起的ALS癥狀。
圖13：p62的過表達(dá)降低了TDP-43的聚集
p62在N2A細(xì)胞中過表達(dá)會導(dǎo)致不溶性TDP-43或TDP-43片段減少(圖13a)， TDP-43的聚集顯著減少(圖13b)，因此p62水平的增加可以減少TDP-43的聚集。并且在證實了d1GFP蛋白水平可以用作蛋白酶體活性的一個指標(biāo)后，當(dāng)p62過表達(dá)時，d1GFP信號顯著降低，表明p62過表達(dá)確實刺激了蛋白酶體的活性(圖13c)。作者還以LC3-I向LC3-II的修飾為指標(biāo)檢測了p62對自噬的影響，N2A細(xì)胞中p62的過表達(dá)導(dǎo)致了更多的LC3-II，這證實了p62的過表達(dá)也刺激了自噬(圖13c)。
經(jīng)過我們上面的分析，通過自噬上調(diào)來減少細(xì)胞內(nèi)聚集物蛋白的積累，是有助于延緩AD、PD、HD和ALS的疾病惡化的，這表明自噬誘導(dǎo)可作為大多數(shù)神經(jīng)退行性疾病的治療策略。然而，廣泛的自噬對維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)是有害的。因此，用自噬的方法來治療神經(jīng)退行性疾病時應(yīng)謹(jǐn)慎。
圖14：自噬的治療機(jī)制
各種自噬誘導(dǎo)劑的處理可以以mTOR依賴性或非依賴性的方式增強(qiáng)聚集傾向蛋白的清除（圖14）。mTOR依賴的自噬誘導(dǎo)物(紅色)，如雷帕霉素和姜黃素，會直接抑制mTORC1的活性，導(dǎo)致ULK1復(fù)合物的激活。相反，mTOR非依賴性藥物(藍(lán)色)則是通過各種細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)或溶酶體生物發(fā)生上調(diào)自噬活性。
mTOR依賴的自噬誘導(dǎo)劑
作用機(jī)制
雷帕霉素
1、抑制mTOR通路，促進(jìn)自噬發(fā)生；2、清除大量有聚集傾向的polyQ蛋白。
姜黃素
提高自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，如Beclin-1、ATG5或ATG16L1，增加自噬通量，清除細(xì)胞內(nèi)聚集物。
mTOR非依賴的自噬誘導(dǎo)劑
作用機(jī)制
海藻糖
通過激活A(yù)MPK或TFEB來增強(qiáng)自噬，在保護(hù)線粒體功能，延緩ALS骨骼肌的退化，對抗凋亡的發(fā)生等多個方面發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
情緒穩(wěn)定劑，如維拉帕米、洛哌丁胺、可樂定和鈣蛋白酶抑制素等
可通過降低肌醇磷酸3 (IP3)的水平，來誘導(dǎo)自噬-溶酶體系統(tǒng)對聚集性蛋白的降解。
鋰鹽
抑制肌醇單磷酸酶(IMPase)
卡馬西平和丙戊酸
抑制肌醇合成
聚乙醇乳酸
使用聚乙醇乳酸(PLGA)酸性納米顆?；謴?fù)溶酶體pH值已被證明可以用來修復(fù)溶酶體缺陷和自噬降解。
Tat-Beclin-1肽
Tat-Beclin-1小肽是Beclin-1 (aa 267-284)與HIV-1 Tat蛋白結(jié)合的細(xì)胞滲透性肽。Tat-Beclin-1通過與GAPR-1/GLIPR2相互作用，增強(qiáng)自噬的啟動。
部分相關(guān)產(chǎn)品：
貨號
產(chǎn)品名稱
12741S
LC3A/B (D3U4C) XP ? Rabbit mAb
86060S
LC3A (E5C9B) Rabbit mAb
83506S
LC3B (E5Q2K) Mouse mAb
14723S
LC3C (D1R8V) Rabbit mAb
9980S
Atg5 (D5G3) Rabbit mAb
4180S
Atg12 (D88H11) Rabbit mAb
8089S
Atg16L1 (D6D5) Rabbit mAb
39749S
SQSTM1/p62 (D1Q5S) Rabbit mAb
16177S
Phospho-SQSTM1/p62 (Ser349) (E7M1A) Rabbit mAb
4122S
Beclin-1 (2A4) Mouse mAb
84966S
Phospho-Beclin-1 (Ser15) (D4B7R) Rabbit mAb
6439S
ULK1 (D9D7) Rabbit mAb
14205S
Phospho-ULK1 (Ser638) (D8K9O) Rabbit mAb
43110T
Mitophagy Antibody Sampler Kit
4445T
Autophagy Antibody Sampler Kit
59187T
Beclin-1 Complex Antibody Sampler Kit
8359T
ULK1 Antibody Sampler Kit
abs815906
Bafilomycin A1
abs817875
Wortmannin
abs810030
Rapamycin
abs810575
3-MA
abs880011
Autophagy agonist and inhibitor kit
參考文獻(xiàn)：
向上滑動查看
[1]Hamano T, Gendron TF, Causevic E, et al. Autophagic-lysosomal perturbation enhances tau aggregation in transfectants with induced wild-type tau expression. Eur J Neurosci. 2008;27(5):1119-1130. doi:10.1111/j.1460-9568.2008.06084.x
[2]Lee JH, Yu WH, Kumar A, et al. Lysosomal proteolysis and autophagy require presenilin 1 and are disrupted by Alzheimer-related PS1 mutations. Cell. 2010;141(7):1146-1158. doi:10.1016/j.cell.2010.05.008
[3]Decressac M, Mattsson B, Weikop P, Lundblad M, Jakobsson J, Bj?rklund A. TFEB-mediated autophagy rescues midbrain dopamine neurons from α-synuclein toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(19):E1817-E1826. doi:10.1073/pnas.1305623110
[4]Parnetti L, Chiasserini D, Persichetti E, et al. Cerebrospinal fluid lysosomal enzymes and alpha-synuclein in Parkinson's disease. Mov Disord. 2014;29(8):1019-1027. doi:10.1002/mds.25772
[5]Tong Y, Yamaguchi H, Giaime E, et al. Loss of leucine-rich repeat kinase 2 causes impairment of protein degradation pathways, accumulation of alpha-synuclein, and apoptotic cell death in aged mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(21):9879-9884. doi:10.1073/pnas.1004676107
[6]Usenovic M, Tresse E, Mazzulli JR, Taylor JP, Krainc D. Deficiency of ATP13A2 leads to lysosomal dysfunction, α-synuclein accumulation, and neurotoxicity. J Neurosci. 2012;32(12):4240-4246. doi:10.1523/JNEUROSCI.5575-11.2012
[7]Barmada SJ, Serio A, Arjun A, et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nat Chem Biol. 2014;10(8):677-685. doi:10.1038/nchembio.1563
[8]N'Diaye EN, Kajihara KK, Hsieh I, Morisaki H, Debnath J, Brown EJ. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO Rep. 2009;10(2):173-179. doi:10.1038/embor.2008.238
[9]Saha S, Panigrahi DP, Patil S, Bhutia SK. Autophagy in health and disease: A comprehensive review. Biomed Pharmacother. 2018;104:485-495. doi:10.1016/j.biopha.2018.05.007
[10]Park H, Kang JH, Lee S. Autophagy in Neurodegenerative Diseases: A Hunter for Aggregates. Int J Mol Sci. 2020;21(9):3369. Published 2020 May 10. doi:10.3390/ijms21093369
