腫瘤細(xì)胞具有快速增殖的特性，需要生物大分子提供能量和生物合成，以實現(xiàn)不斷增殖的需求。營養(yǎng)限制被認(rèn)為是治療腫瘤的潛在策略，但是腫瘤細(xì)胞通過改寫代謝途徑，能夠在營養(yǎng)限制的環(huán)境中存活。腫瘤細(xì)胞中非必需氨基酸的合成已經(jīng)被證明能夠阻礙治療效果。例如，谷氨酰胺通過谷胱甘肽的生物合成，能夠支持腫瘤細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成增加和抗氧化應(yīng)激，而且為三羧酸循環(huán)提供原料，并產(chǎn)生ATP和合成核苷酸、氨基酸、脂質(zhì)的前體【1】。在沒有外源谷氨酰胺的條件下，腫瘤細(xì)胞可以從頭合成谷氨酰胺，但不能從頭合成天冬酰胺。谷氨酰胺限制抑制腫瘤生長的原因就是不能維持細(xì)胞內(nèi)天冬酰胺的水平，因此降低細(xì)胞內(nèi)天冬酰胺的水平或?qū)⑹窍拗颇[瘤生長的重要步驟【2】。
天冬酰胺合成酶（asparagine synthetase，ASNS）催化天冬氨酸轉(zhuǎn)化為天冬酰胺，伴隨著谷氨酰胺脫酰胺反應(yīng)。急性淋巴細(xì)胞白血病中ASNS的表達(dá)缺陷導(dǎo)致其對天冬酰胺限制敏感，但是，在ASNS低水平表達(dá)的實體瘤中，天冬酰胺限制對其沒有效果【3】。那么實體瘤中腫瘤細(xì)胞如何對天冬酰胺限制產(chǎn)生抵抗及相關(guān)分子機(jī)制，目前尚未清楚。
2019年11月18日，來自美國的Ze’ev A. Ronai 在Nature Cell Biology上發(fā)表了題為Translational reprogramming marks adaptation to asparagine restriction incancer的文章，揭示了黑色素瘤和胰腺癌細(xì)胞中，天冬酰胺限制可激活RTK-MAPK-mTORC1通路，進(jìn)而激活翻譯重編程，增強(qiáng)MNK1、eIF4E的翻譯，MNK1和mTORC1協(xié)同增加ATF4 mRNA的翻譯。抑制MAPK能夠破壞ATF4及其靶標(biāo)基因ASNS的上調(diào)，使腫瘤細(xì)胞對天冬酰胺限制更加敏感，限制其生長。此外，ASNA的低表達(dá)可以用來預(yù)測黑色素瘤病人對MAPK通路抑制劑是否響應(yīng)的預(yù)測因子，而且ASNA的低表達(dá)和較低的MAPK活性與良好的預(yù)后相關(guān)。
研究團(tuán)隊首先在胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等細(xì)胞系中敲低ASNS的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)顯著降低天冬酰胺的水平，并且抑制細(xì)胞系的增殖，回補(bǔ)L-天冬酰胺能夠逆轉(zhuǎn)這種表型。同時，ASNS缺失導(dǎo)致GCN2的活化，以及eIF2α磷酸化增加、ATF4蛋白及其靶標(biāo)基因的表達(dá)增加，表明氨基酸響應(yīng)（amino acid response，AAR）通路被激活。而且破壞GCN2-ATF4通路能夠增強(qiáng)天冬酰胺限制對腫瘤細(xì)胞的抗增殖效果。
生物信息分析顯示受體酪氨酸激酶（VEGFR2）、血小板衍生生長因子受體（PDGFRA、PDGFRB）、MAPKKK BRAF、MNK1（MAPK信號的效應(yīng)蛋白和翻譯起始的調(diào)控因子）和Polo樣激酶1（一個Ser/Thr激酶，通過c-RAF磷酸化激活MAPK信號）等被預(yù)測與ASNS是協(xié)同致死（SL）關(guān)系，其中多項與MAPK信號相關(guān)。同時失活A(yù)SNS和預(yù)測的SL基因顯著降低腫瘤導(dǎo)致的死亡。相比于ASNAhi細(xì)胞系，ASNAlo對預(yù)測的SL蛋白的抑制劑更加敏感。而且，ASNS的表達(dá)是預(yù)測BRAF抑制劑響應(yīng)的最強(qiáng)因子之一。單獨(dú)的BRAFi能夠抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖，但與ASNS缺失聯(lián)合能夠更高效。抑制MAPK信號（抑制BRAF、MEK或ERK）破壞了ASNS缺失誘導(dǎo)的GCN2-ATF4通路及ATF4靶標(biāo)基因的上調(diào)。ASNS缺失增強(qiáng)MEK和ERK的磷酸化，形成正反饋機(jī)制。ASNS缺失導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸和乳酸水平增加，BRAF或MEK抑制劑能夠抑制這種現(xiàn)象。病人中ASNS和BRAF的同時下調(diào)預(yù)示著其預(yù)后更為良好。綜上，MAPK信號在ASNS缺失誘導(dǎo)ATF4表達(dá)及相關(guān)表型、代謝變化中有重要作用。
MAPK信號如何調(diào)控ATF4表達(dá)？黑色素瘤細(xì)胞中，ASNS缺陷導(dǎo)致TSC2的磷酸化增加，抑制mTORC1負(fù)調(diào)控因子TSC2的活性，激活mTORC1信號，而BRAF抑制劑能夠阻斷該表型。mTORC1可通過磷酸化4E-BPs使其失活，促進(jìn)mRNA 5’帽子結(jié)合蛋白eIF4E而刺激蛋白質(zhì)合成。ASNS缺陷細(xì)胞中，敲低eIF4E、抑制mTOR都能夠阻斷ATF4及其靶標(biāo)基因的上調(diào)。進(jìn)一步分析ATF4的翻譯狀況，發(fā)現(xiàn)ASNS缺陷增加ATF4 mRNA的翻譯，而BRAF抑制其翻譯。而且mTORC1的抑制增強(qiáng)ASNS缺失誘導(dǎo)的抗增殖效應(yīng)。故在ASNS缺陷細(xì)胞中，MAPK-mTORC1-eIF4E信號介導(dǎo)的翻譯重編程增強(qiáng)ATF4 mRNA的翻譯。除此之外，翻譯重編程過程增加MNK1、eIF4E的翻譯，導(dǎo)致蛋白含量增加。MNK1能夠通過直接磷酸化eIF4E調(diào)控翻譯過程，參與調(diào)控ASNS缺陷誘導(dǎo)的ATF4 mRNA翻譯增加，但不參與調(diào)控mTORC1活性。
RTKs是MAPK信號的上游，而且協(xié)同致死預(yù)測中顯示VEGFR2、PDGFRA、PDGFRB是ASNS的SL同伴。在ASNS缺陷細(xì)胞中，VEGFR2的轉(zhuǎn)錄增加，VEGFR2和PDGFRB的蛋白水平增加，而且檢測到VEGFR2和PDGFRB mRNA的翻譯增加。抑制RTKs信號能夠阻斷ASNS缺失導(dǎo)致的MEK1/2、ERK1/2磷酸化增加和ATF的上調(diào)。其中敲低VEGFR2尤為有效，幾乎完全破壞ATF4及其靶標(biāo)基因的上調(diào)。所以，RTK信號是MAPK通路的上游調(diào)控，確保ASNS缺陷導(dǎo)致的ATF4上調(diào)。
最后，研究人員對天冬酰胺限制和MAPK信號抑制劑聯(lián)用的抗腫瘤效果進(jìn)行探索。KPC/B6胰腺癌和NRAS突變黑色素瘤模型中，L-Aase（L-天冬酰胺酶）和MEKi兩者聯(lián)用（所使用濃度均不能抑制腫瘤生長）顯著抑制胰腺癌的生長，而且降低腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡；兩者聯(lián)用顯著增強(qiáng)MEKi對癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的抑制作用。MEKi有效抑制L-Aase導(dǎo)致的ERK1/2磷酸化增加，ATF4及其靶標(biāo)基因（包括ASNS）的上調(diào)。選取15位黑色素瘤患者，在接受BRAFi 或BRAFi和MEKi聯(lián)用治療前取樣進(jìn)行RNA-seq分析。發(fā)現(xiàn)治療反應(yīng)良好的患者其ASNA的表達(dá)顯著較低，而且ASNS的表達(dá)對MAPK抑制治療的應(yīng)答具有高度的預(yù)測作用。研究人員進(jìn)一步收集2群獨(dú)立的人群數(shù)據(jù)——轉(zhuǎn)移性黑色素瘤接受BRAFi或BRAFi+MEKi治療前、后的配對腫瘤樣本，進(jìn)行RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)對MAPK抑制劑產(chǎn)生抵抗與高表達(dá)ASNS相關(guān)。
總之，本項研究報道了腫瘤細(xì)胞通過RTK-MAPK-mTORC1通路重編程翻譯過程，促進(jìn)ATF4及其靶標(biāo)基因的上調(diào)，從而適應(yīng)天冬酰胺限制的環(huán)境，并揭示了天冬酰胺限制和MAPK通路抑制劑聯(lián)用的抗腫瘤效果，為兩者聯(lián)用的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，為新型腫瘤治療提供了新的視角。
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