富集分析方法ORA Over-representation analysis過表達(dá)分析，常見的是GO富集分析和KEGG富集分析；FCS functional class scoring功能集打分，常見的是GSEA；PT pathway topology通路拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，代表是SPIA；NT network topology網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析；ORA局限性：1.有可能在多重假設(shè)檢驗(yàn)后不存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異基因存在；2.又或者，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因很多，但并不富集于統(tǒng)一的生物學(xué)主題；相應(yīng)的闡述可能冗長、主觀，主要依賴生物學(xué)家的專業(yè)知識(shí)；3.單基因分析可能丟失對(duì)通路影響的重要信息；細(xì)胞過程通常會(huì)對(duì)多個(gè)基因造成影響； 代謝通路中所有編碼基因的表達(dá)增加20%對(duì)通路造成的影響可能比單個(gè)基因增加20倍更重要;4.不同的課題組研究同一種生物現(xiàn)象時(shí)，得到的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因list的overlap很少；GSEA的優(yōu)勢(shì)：1.在基因集的水平上進(jìn)行分析；2.基于先驗(yàn)的生物學(xué)知識(shí)（基因集S）；3.不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因也會(huì)考慮進(jìn)去(Gene List L)；4.目的：觀察基因集S中的基因在L中是隨機(jī)分布還是集中在top/bottom（預(yù)期是如果富集，會(huì)呈現(xiàn)出后面的分布）；GSEA的步驟1.ES（Enrichment Score）的計(jì)算Kolmogorov-Smirnov test詳細(xì)介紹可參見https://www.cnblogs.com/arkenstone/p/5496761.html以gseKEGG為例，K-S test檢驗(yàn)的是，treat vs control（geneList-L）的分布與geneSet的分布是否一致，檢驗(yàn)得到的結(jié)果是ES；geneList為ID依據(jù)logFC排序所得，L中的基因在S中，sum increase，不在S中，sum decrease，最終得到的max|sum|即為ES；
2.ES 顯著水平的計(jì)算permutation test詳細(xì)介紹可參見：https://www.plob.org/article/3176.htmlgene_set permutation生成隨機(jī)基因集(我的理解是，從geneList中隨機(jī)抽?。╪umber of genes in gene_set）個(gè)基因得到），產(chǎn)生ES(S, pi) ，集合所有ES(S, pi) 形成直方圖，對(duì)ES的顯著水平進(jìn)行檢驗(yàn)（p=percentage of ES(S, pi)>=ES(S)）；p.vlaue的解釋見：https://www.jianshu.com/p/eede4ea05f59
3.多重假設(shè)檢驗(yàn)校正FDRFDR代表某個(gè)基因集的特定NES是假陽性的概率；樣本量大（每組至少7個(gè)）的情況，使用sample_label permutaion，F(xiàn)DR的閾值建議是0.25，即4個(gè)假設(shè)中至少有3個(gè)是可用的；但如果樣本量少的情況下，使用gene_set permutation進(jìn)行分析，此時(shí)，F(xiàn)DR的cutoff應(yīng)該更嚴(yán)格一些，比如5%；FDR是兩個(gè)分布的比率：（1）permutation背景下，實(shí)際的ES versus 所有基因集的所有permutation的ES（2）實(shí)際基因集背景下，實(shí)際的ES versus 所有基因集的ES；例如，如果分析四個(gè)基因集并執(zhí)行1000次permutation，則第一個(gè)分布包含4000個(gè)數(shù)據(jù)，第二個(gè)分布包含4個(gè)。建立直方圖（所有S和所有permutation），于某個(gè)NES（>=0）而言， FDR為NES（S，pi）>=NES的比例（permutation水平下），除以基因集水平下，NES（S）>=NES*的比例；
