解螺旋公眾號(hào)·陪伴你科研的第2236天
大家好，我是風(fēng)。有腫瘤研究方向的學(xué)員來(lái)問(wèn)我，能不能為新人來(lái)詳細(xì)分析一篇腫瘤研究的零代碼生信文章，今天這篇Identification of Therapeutic Targets and Prognostic Biomarkers Among CXC Chemokines in the Renal Cell Carcinoma Microenvironment不知道合不合你們胃口。會(huì)了代碼的學(xué)員可能會(huì)不喜歡這種零代碼的文章，認(rèn)為用上代碼都發(fā)不了好文章，還零代碼？你這種想法從某種角度來(lái)說(shuō)也沒(méi)錯(cuò)，畢竟如果純生信10+的文章，那不上代碼可能不行，但是找個(gè)好的切入點(diǎn)，利用各種數(shù)據(jù)庫(kù)零代碼解決“溫飽”，應(yīng)該還是可以的。這篇文章是2020年發(fā)表在Frontiers in Oncology，IF為4.137，實(shí)時(shí)IF 4.99，估計(jì)今年上5分是沒(méi)問(wèn)題了。
先看題目
一樣我們先來(lái)看下題目，疾病為腎癌，問(wèn)題一樣是尋找預(yù)后靶點(diǎn)和標(biāo)志物：
從題目就可以看出來(lái)，這又是一個(gè)基因家族的分析，對(duì)于這種文章，分子的選擇就非常關(guān)鍵了。不要拘泥于基因家族，你也可以選擇某條通路的基因或者某一條通路一個(gè)分支上的基因。當(dāng)然啦，分子新穎性和經(jīng)典性也要考慮。除了這種多個(gè)基因單腫瘤的分析，你也可以選擇一個(gè)分子，然后單基因泛腫瘤分析，這個(gè)很容易可以想到對(duì)吧？在線工具門(mén)檻低，所以提出問(wèn)題和設(shè)計(jì)故事就非常重要了。腎細(xì)胞癌背景知識(shí)不復(fù)雜，使用到的工具有：ONCOMINE, GEPIA, UALCAN, cBioPortal, GeneMANIA, DAVID 6.8, Metascape, TRRUST, LinkedOmics和TIMER，都是我們熟悉的工具吧？
再看內(nèi)容
挑
作者先是使用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)價(jià)CXC趨化因子在腎癌中的表達(dá)，采用閾值為FC>2，p<0.05，rank為top10，結(jié)果顯示在癌組織中CXCL6、CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL16的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于正常腎組織，而CXCL3、CXCL7和CXCL13的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于正常腎組織（作者在展示這個(gè)結(jié)果的時(shí)候就開(kāi)始引用文獻(xiàn)討論結(jié)果的可靠性，emmmm，我覺(jué)得見(jiàn)仁見(jiàn)智，放在討論部分闡述可能會(huì)更好）。為了驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，作者還用UALCAN驗(yàn)證了CXC家族在腎癌中的表達(dá)。（Figure 1-3）
▲Figure 1 Oncomine
▲Figure 2 UALCAN
▲Figure 3（作者并沒(méi)有交代Figure 3是怎么畫(huà)出來(lái)的，但是GEPIA可以達(dá)到這樣的效果）
靠
接下來(lái)作者轉(zhuǎn)到了臨床意義部分，即使用GEPIA分析CXC和腎癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果表示隨著腫瘤進(jìn)展，CXC1、CXC5、CXC9、CXC10、CXC11和CXC13的表達(dá)增加，這些數(shù)據(jù)表明這些CXC趨化因子在腎癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。
▲Figure GEPIA
還沒(méi)結(jié)束，作者趁熱打鐵，既然分析了CXC表達(dá)與腎癌分期之間的關(guān)系，那接著再分析一下這些分子的預(yù)后作用，很合理吧？所以接下來(lái)還是使用GEPIA分析CXC趨化因子在腎癌進(jìn)展中的預(yù)后價(jià)值，主要分析了無(wú)病生存期（DFS）和總生存期（OS），結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCL1和CXCL5的表達(dá)與較長(zhǎng)的無(wú)病生存期有關(guān)，而CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5和CXCL13的低轉(zhuǎn)錄水平與較長(zhǎng)的總生存期顯著相關(guān)。
▲Figure 5 GEPIA
▲Figure 6 GEPIA
聯(lián)
接著作者轉(zhuǎn)到分子交互部分，使用cBioportal對(duì)腎癌中的CXC家族成員基因突變進(jìn)行分析，同時(shí)利用TCGA數(shù)據(jù)，分析了CXC成員表達(dá)之間的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5之間的相關(guān)性較強(qiáng)。此外，作者還使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)的CXC趨化因子進(jìn)行了PPI網(wǎng)絡(luò)分析，以探索它們之間的潛在相互作用，并GeneMANIA探索它們之間的可能參與的通路與功能（這個(gè)你們很少用吧？）最后使用cBioportal分析CXC分子與50個(gè)最相關(guān)的鄰近基因的關(guān)系（cBioportal這個(gè)功能好像已經(jīng)消失了，可以用其他數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)上這部分分析）：
▲Figure 7 cBioportal+GeneMANIA
圈
前面作者找到了CXC差異基因的50個(gè)鄰近基因，接著使用DAVID和metascape對(duì)這些分子進(jìn)行功能聚類，也就是GO和KEGG，結(jié)果顯示在KEGG中，趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、癌癥中的通路、病毒致癌途徑、RAS信號(hào)通路、癌癥中的蛋白多糖、白細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移和RAP1信號(hào)通路與腎癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。
▲Figure 8 DAVID
挑圈聯(lián)靠一套打完，各位看官先別急著走，主線走完了，我們來(lái)看看作者還進(jìn)行了哪些支線內(nèi)容：
聯(lián)：（拓展性的聯(lián)）作者利用TRRUST和LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù)探索了差異表達(dá)的CXC趨化因子的可能轉(zhuǎn)錄因子靶點(diǎn)和激酶靶點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(RELA、NFKB1和SP1)與CXC趨化因子的調(diào)節(jié)有關(guān)。RelA和NFKB1是CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL10和CXCL12的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，SP1是CXCL1和CXCL5的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。具體結(jié)果展示如下：
▲Table 2 TRRUST
▲Table 3 LinkedOmics
接著作者認(rèn)為腎癌中CXC趨化因子的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)參與了炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，從而影響腎癌患者的臨床轉(zhuǎn)歸，所以利用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)的CXC趨化因子與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性進(jìn)行分析，后面就是描述一下TIMER的結(jié)果了：
▲Table 9 TIMER
這樣文章整套走完，其實(shí)套路來(lái)說(shuō)相對(duì)簡(jiǎn)單，類似的套路還有在生信全書(shū)第四段位講解的范文，目前來(lái)說(shuō)這種基因家族的分析，只要文章故事組織的好，發(fā)表的可能性還是很大的，就看你能加多少支線內(nèi)容并且構(gòu)成一個(gè)好故事了。
生信只是一種工具，不管是代碼也好，在線工具也罷，能夠?yàn)槲覀兊目蒲蟹?wù)才是好工具，生信就像是一個(gè)大綜述，一個(gè)有理有據(jù)帶有很多圖表的大綜述，只有把生信的結(jié)果落實(shí)到生物學(xué)功能并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，那生信結(jié)果才有它的價(jià)值，進(jìn)一步說(shuō)，只有有希望轉(zhuǎn)化成臨床成果的數(shù)據(jù)挖掘才是好的科研項(xiàng)目，當(dāng)然我加了“有希望”三個(gè)字，畢竟就算是基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，能夠轉(zhuǎn)化的也不多，但是科研就是這樣不是嗎？畢竟不積跬步，又如何以至千里呢？
文章套路就算拆解完了，接下來(lái)我們看看文中圖表是如何做出來(lái)的？我們要怎么進(jìn)行復(fù)現(xiàn)？
Figure1分析
Figure 1 是使用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)腎癌中CXC趨化因子mRNA水平進(jìn)行研究，圖片的解讀見(jiàn)上一章，這期我們主要是復(fù)現(xiàn)，首先打開(kāi)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.oncomine.org/resource/main.html）：
以CXCL1為例，文章采用的閾值分別為：p 0.05, fold change 2, gene rank top 10%，接下來(lái)我們?cè)跈z索框中輸入CXCL1，然后點(diǎn)擊CXCL1 (Gene):
在左邊的欄目設(shè)置篩選條件，分別設(shè)置：Analysis Type選擇Cancer vs. Normal Analysis ，Cancer Type選擇Kidney Cancer，Data Type選擇mRNA，然后在右邊圖片上方設(shè)置篩選閾值，分別為：
設(shè)置內(nèi)容及結(jié)果如下圖：
上圖紅色框出來(lái)的Cancer VS Normal的圖片就是Figure 1中CXCL1所對(duì)應(yīng)的圖片了，按照上述方法依次輸入CXC家族其他基因，最后使用Adobe Illustrator進(jìn)行拼圖，拼成Figure 1的形式，這樣Figure 1就完成啦。
Table1分析
看起來(lái)好像很復(fù)雜，但是我們拆開(kāi)來(lái)看，表格可以用Excel進(jìn)行制作，那關(guān)鍵就在于獲取表格中的內(nèi)容啦，我們需要的數(shù)據(jù)分別是：TLR基因名稱，Type腫瘤類型，F(xiàn)old change，P值，t-test值和Reference引用，需要注意，文章表格納入的是腎透明細(xì)胞癌的dataset，所以表格沒(méi)有CXCL1的內(nèi)容，為方便大家理解和操作，我們直接使用CXCL1為例找到表格中的信息，具體操作步驟并無(wú)異同。在剛才的界面中點(diǎn)擊右上角Other View，然后選擇Dataset View：
出來(lái)的界面如下圖：
表格所需要的信息除了Reference之外，其他信息都在上圖紅色框內(nèi)，復(fù)制粘貼到Excel表格中即可，那么Reference該怎么找呢？點(diǎn)擊圖片下方作者信息：
怕大家找不到，我還標(biāo)多了一個(gè)箭頭，然后會(huì)彈出下方的頁(yè)面：
點(diǎn)擊紅色方框內(nèi)箭頭所指的Pubmed即可跳轉(zhuǎn)到文章的Pubmed頁(yè)面，找到PMID或者DOI，接著使用Endnote進(jìn)行引用即可。同樣的方法查找CXC家族其他成員的信息，制作成Table 1，這樣Oncomine部分的內(nèi)容就此結(jié)束。
Figure2分析
Figure 2是使用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CXC家族成員進(jìn)行分析，我們直接看操作部分，首先打開(kāi)UALCAN網(wǎng)站（http://ualcan.path.uab.edu/）：
點(diǎn)擊TCGA analysis，進(jìn)入TCGA數(shù)據(jù)分析頁(yè)面：
輸入的Gene symbol可以一次性輸入多個(gè)，避免重復(fù)操作，這里仍然以CXCL1為例，下方選擇腎透明細(xì)胞癌，然后點(diǎn)擊Explore，出來(lái)的頁(yè)面如下：
然后點(diǎn)擊Expression:
這樣，F(xiàn)igure 2中CXCL1的內(nèi)容就出來(lái)了，我們可以從圖片下方框出來(lái)的p值判斷這個(gè)結(jié)果是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，依次操作CXC其他家族成員，下載圖片后一樣使用AI進(jìn)行拼圖，這樣Figure 2就成為我們盤(pán)中餐啦！
Figure3分析
這個(gè)圖展示的是CXC家族在RCC中的表達(dá)水平，文章并沒(méi)有說(shuō)明是哪個(gè)網(wǎng)站的圖片，那我們不妨想一想，類似的圖片，好像我們?cè)谏湃珪?shū)的上篇有位老師講過(guò)，好像就是GEPIA網(wǎng)站（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html），那我們打開(kāi)來(lái)看看:
打開(kāi)GEPIA，按照上圖選擇“Multiple Gene Analysis ”下方的“Multiple Gene Comparison ”，進(jìn)入下方頁(yè)面：
在Gene List的位置輸入CXC家族，然后Tissue Order選中dataset為KIRC腎透明細(xì)胞癌，其他選擇默認(rèn)參數(shù)，然后點(diǎn)擊Plot，得到下方圖片：
這個(gè)圖片看起來(lái)和Figure 3是不是就挺像的了？下載圖片后用AI再搗鼓搗鼓（其實(shí)也不用咋搗鼓），這樣我們Figure 3也算搞定啦，接下來(lái)我們看看Figure 4又是什么
Figure4分析
Figure 4表示不同表達(dá)的CXC趨化因子與腎癌病理分期的關(guān)系，也就是stage分期，并且注明了是GEPIA的結(jié)果，好家伙，還好我還沒(méi)關(guān)閉GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html），那行， 我們還是以C XCL1 為例，來(lái)吧：
點(diǎn)擊Expression DIY下方的Stage plot，進(jìn)入下方頁(yè)面后，輸入基因CXCL1并選擇腫瘤為KIRC，然后設(shè)置相應(yīng)顏色，如下：
接著點(diǎn)擊Plot，下方就會(huì)出來(lái)相應(yīng)圖片：
這個(gè)圖片跟文章是一摸一樣了，按照上面的步驟依次對(duì)其他CXC家族成員進(jìn)行分析，然后保存所有圖片后使用AI進(jìn)行拼圖，F(xiàn)igure 4又被不知不覺(jué)搞定了，好像速度有點(diǎn)快？接下來(lái)繼續(xù)往下。
Figure5分析
Figure 5還是用GEPIA做的圖，表示的是腎細(xì)胞癌患者無(wú)病生存曲線(DFS)中不同表達(dá)CXC趨化因子的預(yù)后價(jià)值，那接著我們還沒(méi)關(guān)閉的GEPIA繼續(xù)往下：
點(diǎn)擊Survival下的Survival plot，進(jìn)入生存分析的界面：
按照上圖紅色框中的內(nèi)容進(jìn)行設(shè)置，然后點(diǎn)擊Plot，這樣CXCL1的圖就又出來(lái)了（奇怪，
我為什么要說(shuō)又？）：
一樣的步驟再做其他CXC家族的成員，然后進(jìn)行拼圖即可，接下來(lái)我們?cè)偻拢?/span>
Figure6分析
OMG，又是生存曲線，還只是把DFS換成了OS，你們別信啊，生信不是這么簡(jiǎn)單的東西，只是剛好這個(gè)文章就用GEPIA弄了好幾個(gè)圖而已，我們?cè)賮?lái)看看操作，還是剛才的頁(yè)面，把DFS換成了OS，如下：
然后點(diǎn)擊Plot，這樣CXCL1的OS生存曲線又出來(lái)了：
這樣Figure 6也完成了，誒，行吧，今天就到這里吧，我們打到了Figure 6，下回從Figure 7開(kāi)始。
Figure7A分析
這個(gè)圖展示的是CXC家族在RCC中的突變情況，一看就知道是cBioportal（www.cbioportal.org），我們打開(kāi)網(wǎng)站：
在左邊選擇腫瘤Kidney，然后選擇相應(yīng)的TCGA RCC數(shù)據(jù)集，如下：
點(diǎn)擊Query by gene，到達(dá)下面頁(yè)面，然后進(jìn)行相應(yīng)設(shè)置：
提交后等待頁(yè)面結(jié)果：
這個(gè)結(jié)果跟文章似乎稍微有點(diǎn)出入，可以多試試幾個(gè)參數(shù)，不過(guò)這個(gè)結(jié)果是我試了幾次后最接近文章結(jié)果的結(jié)果了，考慮到cBioportal曾經(jīng)改版過(guò)，似乎這個(gè)有差異也算正常，既然說(shuō)到cBioportal，就不得不說(shuō)一下，新版的網(wǎng)站取消了network的模塊，所以這7B和7E是沒(méi)辦法做了≡(▔﹏▔)≡，那我們接著繼續(xù)到7C吧；
Figure7C分析
7C是STRING做的CXC家族的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，STRING網(wǎng)站 (https://string-db.org/)，大家應(yīng)該很熟了，打開(kāi)網(wǎng)站：
點(diǎn)擊SEARCH進(jìn)入下一個(gè)頁(yè)面：
按上圖輸入CXC家族，選擇human后點(diǎn)擊SEARCH，到達(dá)下一頁(yè)面：
打開(kāi)GEPIA，按照上圖選擇“Multiple Gene Analysis ”下方的“Multiple Gene Comparison ”，進(jìn)入下方頁(yè)面：
在Gene List的位置輸入CXC家族，然后Tissue Order選中dataset為KIRC腎透明細(xì)胞癌，其他選擇默認(rèn)參數(shù)，然后點(diǎn)擊Plot，得到下方圖片：
點(diǎn)擊CONTINUE:
這個(gè)圖又跟文章的結(jié)果一致了有沒(méi)有？人狠話不多，接著7D；
Figure7D分析
這個(gè)圖其實(shí)我在訓(xùn)練營(yíng)就講過(guò)了，來(lái)過(guò)訓(xùn)練營(yíng)的學(xué)員可能有印象，這個(gè)圖是GeneMANIA (http://www.genemania.org)網(wǎng)站的圖片，我們打開(kāi)網(wǎng)站：
在左上角輸入CXC家族成員，點(diǎn)擊SEARCH，結(jié)果如下：
點(diǎn)擊左下角的小圓圈可以給網(wǎng)絡(luò)添加相應(yīng)的顏色：
可以選擇排名靠前的通路，也可以選擇符合自己研究方向的通路，當(dāng)然還可以對(duì)網(wǎng)絡(luò)排列進(jìn)行修飾：
相應(yīng)的操作都在圖片坐標(biāo)，多點(diǎn)點(diǎn)，選擇自己喜歡的style，又不花錢，點(diǎn)點(diǎn)沒(méi)壞處嘛，這樣我們7D也就解決了，接下來(lái)的Figure 8是 腎細(xì)胞癌中不同表達(dá)的CXC趨化因子和50個(gè)最常改變的鄰近基因的富集分析，其中50個(gè)鄰近基因也是從cBioportal得到的結(jié)果，也就是基于Figure 7E，網(wǎng)站改版后暫時(shí)無(wú)法復(fù)現(xiàn)，接下來(lái)看到Table 2;
Table2分析
Table 2是通過(guò)TRRUST預(yù)測(cè)CXC家族成員的轉(zhuǎn)錄因子，網(wǎng)站網(wǎng)址為：TRRUST (https://www.grnpedia.org/trrust/)，我們一樣打開(kāi)一下網(wǎng)頁(yè)：
點(diǎn)擊中間的SEARCH，在出來(lái)的頁(yè)面拉到下方，然后如下圖設(shè)置：
輸入CXC家族成員之后，點(diǎn)擊提交，得到結(jié)果如下：
將表格整理就可以放入文章中，點(diǎn)擊表格中紅框的數(shù)字，可以直接跳轉(zhuǎn)到相應(yīng)詳情頁(yè)面，這里就不給大家展開(kāi)啦，最后到了Figure 9；
Figure9分析
Figure 9是不同表達(dá)的CXC趨化因子與免疫浸潤(rùn)細(xì)胞豐度(TIMER)的相關(guān)性，我們打開(kāi)TIMER網(wǎng)站(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)：
我們以CXCL1為例，選擇TIMER首頁(yè)的GENE模塊，點(diǎn)擊進(jìn)入下方頁(yè)面進(jìn)行設(shè)置：
設(shè)置完成后點(diǎn)擊Submit提交，得到了下方的結(jié)果：
按照上面的步驟依次分析剩下的CXC成員，然后拼成Figure 9，這樣就大功告成啦！等等等等，好像還有一個(gè)表格：
Table4分析
這個(gè)表格其實(shí)也可以在TIMER進(jìn)行分析，我們點(diǎn)擊TIMER模塊中的Survival，然后進(jìn)行如下設(shè)置（這里我以CXCL1和CXCL2為例）：
設(shè)置完成后，在右邊就可以看到相應(yīng)的分析結(jié)果了：
然后整理成表格就完成啦！這樣我們文章的復(fù)現(xiàn)操作就此結(jié)束！
這篇零代碼的文章，用的很多數(shù)據(jù)庫(kù)都是在我們生信全書(shū)上篇中講解過(guò)的網(wǎng)站，有了好工具，關(guān)鍵的還是怎么組成一個(gè)好的故事，當(dāng)然，思路也是很重要，當(dāng)然文章復(fù)現(xiàn)過(guò)程中還有很多細(xì)節(jié)需要大家去進(jìn)一步細(xì)化，這些都是打磨的工作，相信難不倒大家。一篇文章復(fù)現(xiàn)完了，也不是就此結(jié)束，我們可以思考下，還有哪些網(wǎng)站的哪些分析可以加進(jìn)來(lái)，讓數(shù)據(jù)更加豐富呢？
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