1.研究背景和生物學(xué)問(wèn)題
環(huán)狀RNA（circRNA）是動(dòng)物細(xì)胞中廣泛存在的一種非編碼RNA形式，分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶的影響，表達(dá)穩(wěn)定，不易降解。已有的研究表明，circRNA的表達(dá)具有細(xì)胞特異性，這也就預(yù)示著它們?cè)谛纬蛇^(guò)程中是受到調(diào)控的，也從一定程度上說(shuō)明了它們是具有特定功能的。目前，對(duì)于circRNA的研究主要圍繞著兩個(gè)問(wèn)題：形成過(guò)程受什么調(diào)控？功能是什么？本文中，作者闡明了在EMT過(guò)程中circRNA的形成調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了RNA結(jié)合蛋白Quaking在circRNA在形成過(guò)程中的促進(jìn)作用，初步建立了circRNA的形成調(diào)控模型。
2.研究流程圖
3.取材
人類乳腺上皮細(xì)胞（HMLE），間充質(zhì)化的人類乳腺上皮細(xì)胞（mesHMLE）
HEK 293T細(xì)胞，MDA-MB-231細(xì)胞
4.研究技術(shù)
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，雙熒光篩選技術(shù)，siRNA，shRNA，RIP
5.具體研究過(guò)程
1）在人類EMT過(guò)程中，circRNA的形成受到調(diào)節(jié)
人類乳腺上皮細(xì)胞（HMLE）在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變（EMT）前后， circRNA的形成受到了一定的調(diào)節(jié)。測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，在HMLE中，有5178種circRNA，而在mesHMLE中，circRNA種類顯著增加到8084種，其中兩者共有3417種circRNA。在EMT前后，mRNA的水平變化不大，但circRNA顯著增加，經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證確認(rèn)mesHMLE中的許多circRNA顯著升高。
2）circRNA形成過(guò)程中起重要作用的調(diào)節(jié)因子的篩選
構(gòu)建得到雙色熒光篩選系統(tǒng)—circScreen，該系統(tǒng)在circRNA形成時(shí)表達(dá)GFP，在線性mRNA形成時(shí)表達(dá)mCherry。利用siRNA敲降RNA結(jié)合蛋白，通過(guò)檢測(cè)綠色熒光與紅色熒光的比例變化，篩選得到與circRNA形成有重要聯(lián)系的調(diào)控因子QKI。同時(shí)，在EMT過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)QKI蛋白顯著升高。
3）QKI通過(guò)結(jié)合pre-mRNA內(nèi)含子上的結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控circRNA的形成
在SMARCA5 pre-mRNA 上circRNA形成區(qū)域的上下游，分別存在兩個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)，若同時(shí)突變上游或下游兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，或四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)同時(shí)突變，均會(huì)極大減少circRNA的形成。所以，QKI蛋白通過(guò)結(jié)合SMARCA5 pre-mRNA 上結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)circRNA的形成。當(dāng)對(duì)QKI進(jìn)行敲降或過(guò)表達(dá)時(shí)，circRNA的形成發(fā)生相應(yīng)的下調(diào)或上調(diào)。
4）在內(nèi)含子區(qū)域特異性插入QKI結(jié)合位點(diǎn)，可促進(jìn)circRNA的形成
作者選擇四個(gè)基因SYT8, ADD3,TIMP1, 和 NACAD，該四個(gè)基因不能在HMLE, mesHMLE, MDAMB-231, 和 HEK293T中形成circRNA。構(gòu)建得到包含基因三個(gè)外顯子和QKI結(jié)合位點(diǎn)的質(zhì)粒，在HEK293細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，通過(guò)RT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，在這些細(xì)胞中存在circRNA的形成。
6.結(jié)論
在EMT過(guò)程中，Quaking通過(guò)結(jié)合pre-mRNA上的特定結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)circRNA的形成。隨著Quaking表達(dá)量升高，circRNA的數(shù)目和表達(dá)量也隨之增加。
7.參考文獻(xiàn)
Simon J. Conn, Katherine A. Pillman, Gregory J. Goodall, et al. TheRNA binding protein Quaking regulates formation of circRNAs. Cell, 2015, 160, 1125–1134.
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