基因的變異類型有多種（點(diǎn)擊查看），對(duì)應(yīng)的分子檢測(cè)方法亦有多種，當(dāng)前資本市場(chǎng)驅(qū)動(dòng)著分子檢測(cè)市場(chǎng)，并極力追捧NGS技術(shù)，因?yàn)槠渫扛撸`敏度高且性價(jià)比高。小編承認(rèn)NGS是分子檢測(cè)的必然發(fā)展趨勢(shì)，但是短時(shí)間內(nèi)，NGS并不會(huì)取代其他分子檢測(cè)方法，因?yàn)獒槍?duì)不同的需求，都有對(duì)應(yīng)的理想檢測(cè)方法，每個(gè)檢測(cè)平臺(tái)都有著自己的優(yōu)勢(shì)，比如：
操作簡(jiǎn)單：PCR，ARMS-PCR，HRM等
時(shí)間快速：ARMS-PCR，HRM等
成本低：PCR，PCR-RFLP，MassARRAY等
準(zhǔn)確：Sanger等
通量高：NGS等
靈活性：Pyrosequencing等
結(jié)果分析簡(jiǎn)單：ARMS-PCR等
自動(dòng)化：核酸提取等
......
小編一直認(rèn)為：沒有最好的技術(shù)，只有最合適的技術(shù)！最好的，不一定是最合適的；最合適的，才是真正最好的。
今天，我們聊一聊一直以來都比較火的ARMS-PCR技術(shù)，首先，我們先了解下什么是ARMS-PCR？
ARMS-PCR：擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR（Amplification Refractory Mutation System PCR，ARMS-PCR），又稱為等位基因特異性PCR（Allele-Specific PCR，AS-PCR）。
ARMS-PCR技術(shù)建立在等位基因特異性延伸反應(yīng)基礎(chǔ)上，只有當(dāng)某個(gè)等位基因特異性引物的3’末端堿基與突變位點(diǎn)處堿基互補(bǔ)時(shí)，才能進(jìn)行延伸反應(yīng)。常規(guī)PCR擴(kuò)增DNA所用的上、下游引物與靶序列完全匹配，而等位基因PCR采用等位基因特異的兩條上游引物，兩者在3’端核苷酸不同，一個(gè)對(duì)野生型等位基因特異，另一個(gè)對(duì)突變型等位基因特異，在Taq DNA聚合酶作用下，與模板不完全匹配的上游引物將不能退火，不能生成PCR產(chǎn)物，而與模板匹配的引物體系則可擴(kuò)增出產(chǎn)物，通過凝膠電泳或者qPCR就能很容易地分辨出擴(kuò)增產(chǎn)物的有無，從而確定SNP基因型，目前市場(chǎng)主流為ARMS+qPCR技術(shù)，采用TaqMan探針進(jìn)行檢測(cè)。（比如腫瘤靶向用藥EGFR基因檢測(cè)，CFDA批準(zhǔn)的檢測(cè)試劑盒，90%以上都是ARMS檢測(cè)方法）
簡(jiǎn)而言之：引物3’端錯(cuò)配的堿基會(huì)導(dǎo)致PCR引物延伸速度變慢，當(dāng)錯(cuò)配達(dá)到一定程度時(shí)，引物延伸將終止，得不到特異長(zhǎng)度的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，從而提示模板DNA沒有與引物3’端配對(duì)的堿基，反之則有。
ARMS-PCR（AS-PCR）檢測(cè)原理：橫向?yàn)獒槍?duì)W和M的兩條上游引物，縱向?yàn)閃和M的DNA Template，可以看出W引物只能特異性擴(kuò)增W模板，M引物只能特異性擴(kuò)增M模板。（在此基礎(chǔ)上又延伸出四引物ARMS-PCR技術(shù)（Tetra-Primer ARMS-PCR）：同時(shí)使用4條PCR引物，兩條3’末端位于SNP位點(diǎn)上的分屬不同基因型的方向相反的內(nèi)引物（inner Primer），兩條位于SNP外側(cè)并與SNP距離不等的外引物（outer Primer），4條引物理論上如果都匹配的話，兩兩組合可擴(kuò)增出3條DNA產(chǎn)物（位于同一位點(diǎn)的兩內(nèi)引物無法產(chǎn)生長(zhǎng)片段擴(kuò)增產(chǎn)物，多為引物二聚體）。但若其中一條針對(duì)SNP的內(nèi)引物不匹配，則只能擴(kuò)增出另外兩條DNA片段。由于外引物到達(dá)SNP距離不同，擴(kuò)增產(chǎn)物大小也就不同，通過電影根據(jù)局?jǐn)U增產(chǎn)物的大小即可判斷基因型，同時(shí)由外側(cè)引物擴(kuò)增的長(zhǎng)片段產(chǎn)物可作為體系的陽性質(zhì)控）
今天主要介紹ARMS+TaqMan探針+qPCR技術(shù)
我們都清楚ARMS的簡(jiǎn)單原理，即理論上Taq DNA聚合酶必須在引物3’末端堿基與模板完全互補(bǔ)情況下才能進(jìn)行有效的聚合反應(yīng)，但由于Taq DNA嚴(yán)謹(jǐn)性受多因素影響，某些情況下，即使引物的3’末端堿基與模板不互補(bǔ)，延伸仍然可以進(jìn)行（如果3′末端只有一個(gè)堿基的錯(cuò)配，那么是引物是可以錯(cuò)配結(jié)合的并可以進(jìn)行延伸的，只是延伸的效率低于那些3′末端正好配對(duì)的引物），而且不同的3’末端錯(cuò)位（mismatch）有不同的延伸效率（如果在3′末端引入了其他的錯(cuò)配堿基，那么錯(cuò)配的數(shù)目太多或達(dá)到一定程度，那么3′末端無法進(jìn)行延伸），因而僅靠引物3’末端一個(gè)堿基的錯(cuò)配不能充分而可靠地區(qū)分兩個(gè)等位基因，進(jìn)而造成假陽性結(jié)果。
那么如何提高引物延伸的特異性？
為了提高引物延伸的特異性，可在3’端倒數(shù)第2位或第3位堿基處引入一個(gè)錯(cuò)配堿基，該錯(cuò)配堿基與3’末端的錯(cuò)配堿基共同作用，使引物在與其3’末端不互補(bǔ)的模板中擴(kuò)增產(chǎn)物率顯著降低，而引物在與其3’末端互補(bǔ)的模板中正常擴(kuò)增，引物的錯(cuò)配堿基類型取決于3’末端堿基錯(cuò)配類型。
注意：當(dāng)3’末端是“強(qiáng)”錯(cuò)配（A/G或G/T）時(shí)，可以在引物中引入一個(gè)“弱”錯(cuò)配（C/A或C/T）；當(dāng)3’末端是“弱”錯(cuò)配時(shí)，則需要在引物中引入一個(gè)“強(qiáng)錯(cuò)配”；當(dāng)3’末端是出“中度”錯(cuò)配（A/A、C/C、G/G、T/T）時(shí)，可以在引物中再引入一個(gè)“中度”錯(cuò)配。一般在3’末端引入突變（倒數(shù)第3個(gè)堿基），可以顯著提高特異性。
提高引物特異性，引入錯(cuò)配堿基
ARMS的特異性引物設(shè)計(jì)完成后，還需要一對(duì)等位基因特異性熒光共振能量轉(zhuǎn)移的TaqMan探針，TaqMan探針分別連有兩種不同的熒光染料，5’端為熒光基團(tuán)，3’端連有通用的熒光淬滅基團(tuán)。一個(gè)完整的探針，淬滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)在空間上特別靠近而產(chǎn)生熒光淬滅。正常情況下檢測(cè)不到5’端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光，只能檢測(cè)到3’端淬滅基團(tuán)的背景熒光。在靶基因擴(kuò)增過程中，PCR引物和熒光標(biāo)記探針在退火時(shí)均會(huì)與目標(biāo)序列互補(bǔ)結(jié)合（Probe Tm比較高，需在Primer 之前與DNA Template 結(jié)合）。Taq 酶在延伸模板鏈延伸時(shí)遇到與模板穩(wěn)定結(jié)合的探針，Taq酶的5’-3’外切核酸酶會(huì)將與模板結(jié)合的特異性探針降解，從而使探針上的熒光基團(tuán)因?yàn)槲锢砜臻g分離，淬滅效應(yīng)消失，發(fā)出熒光。如果熒光探針與目標(biāo)序列存在錯(cuò)配，就會(huì)大大減少熒光的釋放量。后續(xù)通過軟件分析處理熒光數(shù)據(jù)而確定基因型。
ARMS-TaqMan檢測(cè)原理
TaqMan-MGB探針技術(shù)是在TaqMan法基礎(chǔ)上優(yōu)化而成的一個(gè)SNP檢測(cè)方法（由普通Taqman探針和MGB基團(tuán)兩部分組成），該探針的3’端結(jié)合了小溝結(jié)合物（minor groove binder，MGB），MGB與DNA螺旋的小溝（minor groove）契合，通過穩(wěn)定DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)來提高雜交的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。這使得探針長(zhǎng)度進(jìn)一步縮短，TM值較高，增加了探針的雜交穩(wěn)定性，使結(jié)果更準(zhǔn)確。該探針結(jié)合的為非熒光淬滅基因，這可大大降低熒光本底，提高反應(yīng)靈敏度。MGB探針設(shè)計(jì)應(yīng)使SNP位點(diǎn)處于探針中間1/3范圍內(nèi)，盡量縮短MGB探針長(zhǎng)度，但不少于13個(gè)堿基。
TaqMan-MGB檢測(cè)原理
ARMS方法與MGB方法對(duì)比：ARMS方法靈敏度高，需要在qPCR上通過CT值進(jìn)行判斷，MGB方法靈敏度較高，PCR跑完之后一般直接用qPCR掃版即可，會(huì)出現(xiàn)Cluster的現(xiàn)象，一般會(huì)有三個(gè)簇，一簇野生，一簇雜合，一簇純合突變。
TaqMan系統(tǒng)有提供它自己的引物/探針設(shè)計(jì)軟件，即來自于ABI的Primer Express 2.0，這一款軟件是實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最廣發(fā)的Oligo設(shè)計(jì)程序，其可用于以TaqMan為探針標(biāo)準(zhǔn)的DNA PCR、RE-PCR、巢式PCR、等位基因特異的PCR、多重PCR的寡核苷酸設(shè)計(jì)。該軟件有一個(gè)引物校驗(yàn)文件，可根據(jù)其Tm值、二級(jí)結(jié)構(gòu)和形成引物二聚體的可能性，來評(píng)價(jià)預(yù)先設(shè)計(jì)的引物。該軟件除了適用于TaqMan探針外，也適用于TaqMan-MGB探針，可為單個(gè)及多個(gè)（至48）序列設(shè)計(jì)探針。
ARMS-PCR法應(yīng)用實(shí)例介紹
比如現(xiàn)在有兩名女性肺腺癌患者，檢測(cè)EGFR L858R突變后使用吉非替尼半年，現(xiàn)在想看看是否耐藥，需針對(duì)EGFR T790M突變進(jìn)行檢測(cè)。
我們采用ARMS-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，首先設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)T790M突變位點(diǎn)的特異性引物，外加一條TaqMan探針，然后加上mix混勻上qPCR檢測(cè)即可。qPCR檢測(cè)結(jié)果參考內(nèi)參基因進(jìn)行解讀，通過baseline劃線之后，確定產(chǎn)物ct值與內(nèi)參基因ct值的大小，如果ct值比內(nèi)參ct值小，即是沒有T790M突變，則為野生型，對(duì)吉非替尼還是敏感的（見下圖左側(cè)）：如果ct值比內(nèi)參ct值大，即是T790M突變，則為突變型，對(duì)吉非替尼耐藥，可使用AZD9291（見下圖右側(cè)）。
市場(chǎng)上有些上市的ARMS-PCR產(chǎn)品會(huì)添加Block（block其實(shí)就像普通的Taq man-MGB里面的MGB探針，一段Oligo序列，目的是封閉野生型提高檢測(cè)的靈敏度），Block添不添加主要的決定因素是引物的特異性如何，如果特異性不好可以考慮添加Block提高檢測(cè)靈敏度，其實(shí)引物足夠好的話，block是不需要的。
block的序列要有一定的特異性，也不一定要非常好，只要能影響PCR效率，就可以和引物一起去篩了，這個(gè)是完全從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來說的，理論上的很多對(duì)block設(shè)計(jì)行不通，因?yàn)樗遣糠指?jìng)爭(zhēng)。Block封閉一點(diǎn)突變沒有關(guān)系，只要對(duì)突變的擴(kuò)增效率影響比對(duì)野生的影響小，然后整體擴(kuò)增效率能達(dá)到你要求就可以。block還是好篩的，關(guān)鍵還是引物，假陽性假陰性的關(guān)鍵都在前引物。
高分辨前引物與Block寡聚核苷酸競(jìng)爭(zhēng)，提高檢測(cè)的靈敏度
整個(gè)實(shí)驗(yàn)主要操作步驟
ARMS-PCR技術(shù)點(diǎn)評(píng)
優(yōu)點(diǎn)：
1，操作簡(jiǎn)單；
2，時(shí)間快速；
3，靈敏度高，可檢測(cè)低至1%的突變；
4，只有一次開蓋過程，有效防止污染；
5，整個(gè)操作只需Real-time PCR儀；
6，有大量成熟的商品化試劑盒提供；
7，成本較低（LDT）。
缺點(diǎn)：
1，通量較低；
2，不能檢測(cè)未知突變；
3，不適于位點(diǎn)附近GC含量過高或過低的SNP的分型檢測(cè)。
此方法適宜于對(duì)通量要求不高的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行突變檢測(cè)，特別是體細(xì)胞突變。
