逆轉(zhuǎn)錄病毒載體屬RNA病毒，但可在受染細胞內(nèi)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生DNA互補鏈，此DNA單鏈可作為模板合成第二條DNA鏈，第二條DNA鏈可摻入細胞基因組DNA中。此病毒可利用宿主細胞的酶自行轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，RNA可合成蛋白，再包裝病毒，RNA從胞內(nèi)釋放，成為感染性病毒，該載體可經(jīng)不同方式改變。介導(dǎo)過程可使病毒單拷貝基因組穩(wěn)定地進入細胞。
首先，逆轉(zhuǎn)錄病毒的繁殖必須要有適當(dāng)?shù)陌b細胞系，以利于產(chǎn)生高滴度的病毒，同時還具有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)。如：ψ2(第一代包裝細胞)，PA317(第二代包裝細胞)，ψ1-CRIP、PG13、DA、CFA(第三代包裝細胞)，包裝細胞可提供逆轉(zhuǎn)錄病毒gag、pol和env蛋白才能使帶有包裝信號及目的基因的病毒載體RNA進行包裝，包裝細胞只提供gag、pol和env蛋白而不產(chǎn)生具有復(fù)制能力的野生型病毒(RCR)，而第一代包裝細胞可產(chǎn)生 RCR，安全性較差；第二代包裝細胞，臨床上已廣泛應(yīng)用，也未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生RCR，安全性好；第三代包裝細胞更加安全，第三代包裝細胞中主要區(qū)別是病毒結(jié)構(gòu)基因中env不同。
反轉(zhuǎn)錄病毒作為基因轉(zhuǎn)移的載體有如下特點：
①反轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞的效率高，基因轉(zhuǎn)移率在10%-100%；
②病毒基因轉(zhuǎn)移能將外源基因整合到宿主細胞基因組中外源基因能穩(wěn)定存在而不丟失；
③外源基因整合的拷貝數(shù)一般只有一個；
④反轉(zhuǎn)錄病毒只選擇感染分裂細胞；
⑤病毒可容納外源基因的DNA長度為<8Kb。
反轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)構(gòu)：已切除了病毒的結(jié)構(gòu)基因gag，大部分pol和env，包括兩側(cè)的LTR，被選擇(標(biāo)記)基因和目的基因插入的多聚位點所取代，同時還帶有包裝信號ψ。
(一)可產(chǎn)生特異性逆轉(zhuǎn)錄病毒細胞系的建立
1、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進入包裝細胞系
從細胞質(zhì)粒中產(chǎn)生感染性病毒包括將質(zhì)粒導(dǎo)入包裝細胞系，可從穩(wěn)定感染細胞中選擇病毒產(chǎn)生細胞或用一個包裝細胞系暫時產(chǎn)生的病毒感染另一種有不同包裝的細胞系，從中選擇病毒的產(chǎn)生細胞。
1.1準(zhǔn)備工作（用品）：
(1)適當(dāng)?shù)陌b細胞系及培養(yǎng)液
(2)大多數(shù)包裝細胞系為鼠源的，含有鼠“Helpe病毒”，此病毒可幫助被去除某些功能結(jié)構(gòu)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制，并包裝于蛋白衣殼中。
(3)逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒DNA常構(gòu)建成含有抗藥基因neo新霉素基因的載體。
(4)Hepes-緩沖液(HeBs)
(5)2mol/L CaCL2
(6)含血清及不含血清培養(yǎng)液
(7)HeBs 15%甘油（HeBs/甘油）
(8)800mg/L(100×聚凝胺)(肝素對抗物)
(9)10%～15%DMSO
(10)10cm、6cm培養(yǎng)皿
(11)24孔、6孔培養(yǎng)板
(12)克隆環(huán)
1.2操作步驟：
(1)轉(zhuǎn)染前，10cm培養(yǎng)皿中接種大約10%～20%皿底面積的包裝細胞。
(2)將10μg含抗藥基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒DNA加入0.5mL HeBs中，加入32μL 2mol/L CaCL2,輕振動，加蓋30分鐘，室溫下培養(yǎng)45分鐘，直到小的、模糊的蘭色沉淀產(chǎn)生。
(3)從包裝細胞中棄去舊液，輕輕滴入HeBs-DNA沉淀于細胞培養(yǎng)皿中心，使細胞接觸DNA20分鐘，每10分鐘輕輕搖動培養(yǎng)皿，使溶液均勻，加入10mL培養(yǎng)液，并于37℃放置4小時。
(4)完全吸出培養(yǎng)液，逐滴加入2.5mL的HeBs/甘油，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，如果使用的是ψ2/YCRE/YCRIP/PA317包裝細胞系，需培養(yǎng)3.5分鐘，若為Q2bn包裝細胞系，需培養(yǎng)1.5分鐘，或根據(jù)不同包裝細胞選用不同時間。迅速棄去HeBs/甘油，用10mL培養(yǎng)液洗2次，加入含有血清的5ml培養(yǎng)液培養(yǎng)18～24小時。
(5)取出培養(yǎng)液用0.45μm過濾，可獲得含有短期產(chǎn)生病毒的培養(yǎng)上清，-70℃或-80℃貯存，或立即用于其它包裝細胞系的感染。
(6)加入10ml培養(yǎng)液于上述已感染的細胞，繼續(xù)培養(yǎng)2～3天，繼續(xù)步驟10。
(7)另一包裝細胞受感染前1:10或1:20傳代。
(8)倒去包裝細胞的培養(yǎng)液，加入步驟5獲得的病毒。方法如下：
對于10cm培養(yǎng)皿，將0.1至1.0mL病毒貯存液稀釋至3～5mL的終體積，加入800mg/L聚凝胺至終濃度為8 mg/L，培養(yǎng)1小時以上。
(9)若10cm培養(yǎng)皿加入10mL培養(yǎng)液，6mL培養(yǎng)皿中應(yīng)加入4mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)2～3天。
(10)步驟6或步驟9得到的感染細胞，2～3天后按1:10或1:20傳代，接種于選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)3天，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3～4天，直至克隆出現(xiàn)。
(11)用克隆環(huán)挑出分離的克隆，每個克隆接種24孔板或6孔板中的二個孔，生長至50～90%底部面積。
(12)倒去培養(yǎng)液，換入1倍體積的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1～3天，收取培養(yǎng)液，馬上滴定，或者貯存于-70℃或-80℃。
(13)繼續(xù)傳代克隆細胞直到能被冷凍或被鑒定，若病毒產(chǎn)生克隆被鑒定，10%～15%DMSO保護劑液氮凍存細胞。即產(chǎn)生病毒細胞系建立。
2、病毒滴度鑒定
在分離產(chǎn)生病毒的克隆后，需進行病毒滴度的測定，常用的方法是用病毒感染目的細胞，可根據(jù)載體RNA或蛋白的出現(xiàn)粗略定量分析。
2.1準(zhǔn)備工作：
(1)病毒貯存液（步驟5所得）
(2)目的細胞系(NIH3T3成纖維細胞)
(3)G418或其它選擇性藥物
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