核酸（nucleic acid）是重要的生物大分子，是生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究的重要對(duì)象和領(lǐng)域。由于核酸的結(jié)構(gòu)和功能比較復(fù)雜，分子很不穩(wěn)定，在細(xì)胞中的含量又比較小，在四類生物大分子中，它的研究開始最晚。現(xiàn)代生物化學(xué)建立于18世紀(jì)下半葉?！暗鞍踪|(zhì)”一詞最早于1838年，由J.J.Berzelius提出，“核酸”這個(gè)詞出現(xiàn)要晚半個(gè)世紀(jì)。1868年瑞士外科醫(yī)師米歇（Friedrich Miescher）由膿細(xì)胞中分離提取出一種含磷量很高的酸性物質(zhì)，稱為核素（nuclein），繼任者發(fā)展了制備不含蛋白質(zhì)的核酸的方法，1889年R.Altmann最早提出“核酸”（nucleic acid）一詞。核酸的研究改變了整個(gè)生命科學(xué)的面貌，并由此誕生了分子生物學(xué)這一當(dāng)今發(fā)展最迅速、最有活力的學(xué)科。
核酸分為兩大類：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid,RNA）。RNA根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的不同主要分為三類：信使RNA(messenger RNA,mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(transfer RNA,tRNA)和核糖體RNA(ribosomal RNA,rRNA)。DNA是遺傳信息的貯存和攜帶者，RNA主要是轉(zhuǎn)錄、傳遞DNA上的遺傳信息，直接參與細(xì)胞蛋白質(zhì)的的生物合成。在真核細(xì)胞中，DNA絕大部分（約98%）存在于細(xì)胞核染色質(zhì)中，其余分布于細(xì)胞器（如線粒體、葉綠體）中；RNA絕大部分（約90%）分布在細(xì)胞質(zhì)中，其余分布在細(xì)胞核內(nèi)。
核酸是由什么組成的？
核酸是生物體內(nèi)的高分子化合物。它包括脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA）和核糖核酸（ribonucleicacid,RNA）兩大類。DNA和RNA都是由一個(gè)一個(gè)核苷酸(nucleotide)頭尾相連而形成的。RNA平均長(zhǎng)度大約為2000個(gè)核苷酸，而人的DNA卻是很長(zhǎng)的，約有3X109個(gè)核苷酸。
單個(gè)核苷酸是由含氮有機(jī)堿(稱堿基)、戊糖(即五碳糖)和磷酸三部分構(gòu)成的。
堿基(base)：構(gòu)成核苷酸的堿基分為嘌呤（purine)和嘧啶 >（pyrimi-dine)二類。前者主要指腺嘌呤（adenine，A）和鳥嘌呤（guanine,G），DNA和RNA中均含有這二種堿基。后者主要指胞嘧啶（cytosine,C）胸腺嘧啶（thymine，T）和尿嘧啶（uracil,U），胞嘧啶存在于DNA和RNA中，胸腺嘧啶只存在于DNA中，尿嘧啶則只存在于RNA中。這五種堿基的結(jié)構(gòu)如圖。
嘌呤環(huán)上的N-9或嘧啶環(huán)上的N-1是構(gòu)成核苷酸時(shí)與核糖（或脫氧核糖）形成糖苷鍵的位置。
此外，核酸分子中還發(fā)現(xiàn)數(shù)十種修飾堿基（themodifiedcomponent),又稱稀有堿基，(unusualcomponent)。它是指上述五種堿基環(huán)上的某一位置被一些化學(xué)基團(tuán)（如甲基化、甲硫基化等）修飾后的衍生物。一般這些堿基在核酸中的含量稀少，在各種類型核酸中的分布也不均一。如DNA中的修飾堿基主要見于噬菌體DNA，RNA中以tRNA含修飾堿基最多。
戊糖(五碳糖):RNA中的戊糖是D－核糖(即在2號(hào)位上連接的是一個(gè)羥基)，DNA中的戊糖是D－2－脫氧核糖(即在2號(hào)位上只連一個(gè)H)。D－核糖的Ｃ－2所連的羥基脫去氧就是D－2脫氧核糖。
戊糖Ｃ－1所連的羥基是與堿基形成糖苷鍵的基團(tuán)，糖苷鍵的連接都是β－構(gòu)型。
核苷（nucleoside)：由D－核糖或D－2脫氧核糖與嘌呤或嘧啶通過(guò)糖苷鍵連接組成的化合物。核酸中的主要核苷有八種。
核苷酸(nucleotide)：核苷酸與磷酸殘基構(gòu)成的化合物，即核苷的磷酸酯。核苷酸是核酸分子的結(jié)構(gòu)單元。核酸分子中的磷酸酯鍵是在戊糖C-3’和C-5’所連的羥基上形成的，故構(gòu)成核酸的核苷酸可視為3’－核苷酸或5’－核苷酸。DNA分子中是含有A,G,C,T四種堿基的脫氧核苷酸；RNA分子中則是含A,G,C,U四種堿基的核苷酸。
當(dāng)然核酸分子中的核苷酸都以形式存在，但在細(xì)胞內(nèi)有多種游離的核苷酸，其中包括一磷酸核苷、二磷核苷和三磷酸核苷。
核苷酸是怎么連接的？
3’，5’－磷酸二酯鍵：核酸是由眾多核苷酸聚合而成的多聚核苷酸（polynucleotide），相鄰二個(gè)核苷酸之間的連接鍵即：3’，5’－磷酸二酯鍵。這種連接可理解為核苷酸糖基上的3＇位羥基與相鄰5＇核苷酸的磷酸殘基之間，以及核苷酸糖基上的5＇位羥基與相鄰3＇核苷酸的磷酸殘基之間形成的兩個(gè)酯鍵。多個(gè)核苷酸殘基以這種方式連接而成的鏈?zhǔn)椒肿泳褪呛怂?。無(wú)論是DNA還是ＲＮＡ，其基本結(jié)構(gòu)都是如此，故又稱DNA鏈或RNA鏈。DNA鏈的結(jié)構(gòu)如下示意圖。
寡核苷酸（oligonucleotide)：這是與核酸有關(guān)的文獻(xiàn)中經(jīng)常出現(xiàn)的一個(gè)術(shù)語(yǔ)，一般是指二至十個(gè)核苷酸殘基以磷酸二酯鍵連接而成的線性多核苷酸片段。但在使用這一術(shù)語(yǔ)時(shí)，對(duì)核苷酸殘基的數(shù)目并無(wú)嚴(yán)格規(guī)定，在不少文獻(xiàn)中，把含有三十甚至更多個(gè)核苷酸殘基的多核苷酸分子也稱作寡核苷酸。寡核苷酸目前已可由儀器自動(dòng)合成，它可作為DNA合成的引物（primer)、基因探針（probe)等，在現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中具有廣泛的用途。
核酸鏈的簡(jiǎn)寫式：核酸分子的簡(jiǎn)寫式是為了更簡(jiǎn)單明了的敘述高度復(fù)雜的核酸分子而使用的一些簡(jiǎn)單表示式。它所要表示的主要內(nèi)容是核酸鏈中的核苷酸（或堿基）。下面介紹二種常用的簡(jiǎn)寫式。
字符式：書寫一條多核苷酸鏈時(shí)，用英文大寫字母縮寫符號(hào)代表堿基（DNA和RNA中所含主要堿基及縮寫符號(hào)見表１－１），用小寫英文字母P代表磷酸殘基。核酸分子中的糖基、糖苷鍵和酯鍵等均省略不寫，將堿基和磷酸相間排列即可。因省略了糖基，故不再注解“脫氧”與否，凡簡(jiǎn)寫式中出現(xiàn)Ｔ就視為DNA鏈，出現(xiàn)Ｕ則視為RNA鏈。以5＇和3＇表示鏈的末端及方向，分別置于簡(jiǎn)寫式的左右二端。下面是分別代表DNA鏈和RNA鏈片段的二個(gè)簡(jiǎn)寫式：
5＇pＡpＣpＴpＴpＧpＡpＡpＣpＧ3＇DNA
5＇pＡpＣpＵpＵpＧpＡpＡpＣpＧ3＇RNA
此式可進(jìn)一步簡(jiǎn)化為：
5＇pＡＣＴＴＧＡＡＣＧ3＇
5＇pＡＣＵＵＧＡＡＣＧ3＇
上述簡(jiǎn)寫式的5＇－末端均含有一個(gè)磷酸殘基（與糖基的Ｃ－5＇位上的羥基相連）,3＇－末端含有一個(gè)自由羥基（與糖基的Ｃ－3＇位相連）,若5＇端不寫Ｐ，則表示5＇－末端為自由羥基。雙鏈DNA分子的簡(jiǎn)寫式多采用省略了磷酸殘基的寫法，在上述簡(jiǎn)式的基礎(chǔ)上再增加一條互補(bǔ)鏈（complentarystrand)即可，鏈間的配對(duì)堿基用短縱線相連或省略，錯(cuò)配（mismatch)堿基對(duì)錯(cuò)行書寫在互補(bǔ)鏈的上下兩邊，如下所示：
5＇ＧＧＡＡＴＣＴＣＡＴ3＇
3＇ＣＣＴＴＡＧＡＧＴＡ5＇
5＇ＧＧＡＡＴＣ錯(cuò)配）
線條式：在字符書寫基礎(chǔ)上，以垂線（位于堿基之下）和斜線（位于垂線與Ｐ之間）分別表示糖基和磷酸酯鍵。如下圖所示
上式中，斜線與垂線部的交點(diǎn)為糖基的Ｃ－3＇位，斜線與垂線下端的交點(diǎn)為糖基的Ｃ－5＇位。這一書寫式也可用于表示短鏈片段。不難看出，簡(jiǎn)寫式表示的中心含義就是核酸分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)，即核酸分子中的核苷酸（或堿基）排列順序。
核酸是一種多聚核苷酸，它的基本結(jié)構(gòu)是核苷酸（nucleotide）。采用不同的降解法，可以將核酸降解成核苷酸，核苷酸還可以進(jìn)一步降解為核苷和磷酸。核苷再進(jìn)一步分解生成含氮堿基（base）和戊糖。堿基分兩大類：嘌呤堿和嘧啶堿。所以，核酸由核苷酸組成，而核苷酸又由堿基、戊糖與磷酸組成。
一、核苷酸
核苷酸可分為核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸兩類。兩者基本化學(xué)結(jié)構(gòu)相同，只是所含戊糖不同，個(gè)別堿基不同。核糖核苷酸是RNA的結(jié)構(gòu)單位，脫氧核糖核苷酸是DNA的結(jié)構(gòu)單位。細(xì)胞內(nèi)還有各種游離的核苷酸和核苷酸衍生物，他們具有重要的生理功能。由此可見，對(duì)于核酸和蛋白質(zhì)系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，核苷酸相當(dāng)于氨基酸，堿基相當(dāng)于氨基酸的功能基團(tuán)（氨基酸側(cè)鏈）?！?/p>
核酸是一類由碳、氫、氧、氮和磷組成的化合物。其中磷在各種核酸中的含量比較恒定，DNA的平均含磷量為9.9%，RNA的平均含磷量為9.4%。因此，只要測(cè)出核酸樣品的含磷量，就可以計(jì)算出該樣品的核酸含量?！?/p>
（一）戊糖
戊糖有D-核糖（D-ribose,R）和D-2-脫氧核糖（D-2-deoxyribose,dR）兩種。在核苷酸中，碳原子的編號(hào)加撇號(hào)(如1’、2’)等以與堿基上不加撇號(hào)的碳原子相區(qū)別。
（二）含氮堿
核酸中的含氮堿稱堿基，包括嘌呤堿和嘧啶堿兩類。嘌呤堿主要有腺嘌呤（adenine,A）和鳥嘌呤（gaunine,G）。 嘧啶堿主要有胞嘧啶（cytosine,C）、尿嘧啶（uracil,U）和胸腺嘧啶（thymine,?T）。含氮堿雜環(huán)中C和N的編號(hào)以不加撇號(hào)的1，2，3……表示。某些核酸分子中含有一些微量的稀有堿基，如2-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5，6二氫尿嘧啶等（表3-1-2）。這些堿基可能是正常堿基被化學(xué)修飾形成的，或復(fù)制轉(zhuǎn)錄過(guò)程中摻入的非正常堿基。目前已知稀有堿基和核苷達(dá)近百種。
（三）核苷(nucleoside)
戊糖和堿基通過(guò)糖苷鍵連接而成核苷。糖苷鍵是由戊糖C-1′上的羥基與嘌呤堿N-9或嘧啶堿N-1上的氫原子經(jīng)脫水縮合形成。核苷根據(jù)其所含戊糖的不同分為核糖核苷和脫氧核糖核苷。其中腺嘌呤核苷和胸腺嘧啶核苷的結(jié)構(gòu)式如圖3--3所示。由稀有堿基形成的核苷稱稀有核苷，如假尿嘧啶核苷、次黃嘌呤核苷等。
（四）核苷酸(nucleotide)
核苷和磷酸通過(guò)磷酸酯鍵連接而成核苷酸。核糖核苷的戊糖有三個(gè)自由羥基，可形成三種核苷酸：2′-、3′-和5′-核糖核苷酸。脫氧核糖核苷的戊糖只有兩個(gè)自由羥基，只能形成兩種核苷酸：3′-和5′-脫氧核糖核苷酸。生物體內(nèi)游離存在的核苷酸大多數(shù)是5′-核苷酸（5′-?？墒÷圆粚懀：颂呛塑账崾墙M成RNA的基本單位，脫氧核糖核苷酸是組成DNA的基本單位。
二、其他核苷酸
（一）多磷酸核苷
生物體內(nèi)各種5′-核苷酸和5′-脫氧核苷酸還可以在5′位上進(jìn)一步磷酸化，形成二磷酸核苷（NDP和dNDP）和三磷酸核苷（NTP和dNTP）。其中NTP是合成RNA的原料，dNTP是合成DNA的原料。ATP(adenosine triphosphate)是體內(nèi)最重要的高能化合物，分子中含有三個(gè)磷酸酯鍵，其中α-磷酸酯鍵為低能磷酸酯鍵，而β、γ磷酸酯鍵都是高能磷酸酯鍵。每1mol高能磷酸化合物水解時(shí)可釋放出自由能大于20.93kJ。ATP是人體內(nèi)各種生命活動(dòng)的主要的直接供能者。
（二）輔酶類核苷酸
體內(nèi)代謝反應(yīng)中的一些輔酶，也是核苷酸的衍生物。例如尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）、黃素腺嘌呤二核酸（FAD）、輔酶A（HSCoA）等，其分子中都含有腺苷酸。這些輔酶類核苷酸均參與物質(zhì)代謝中氫和某些化學(xué)基團(tuán)的傳遞?！?/p>
（三）環(huán)化核苷酸
組織細(xì)胞中還發(fā)現(xiàn)了兩種環(huán)化核苷酸：3′，5′-環(huán)化腺苷酸（cAMP）和3′，5′-環(huán)化鳥苷酸(cGMP)。它們的含量甚微，但具有重要的生理活性，是一些激素作用的第二信使，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中具有重要調(diào)控作用。
核酸（nucleic acid）是重要的生物大分子，它的構(gòu)件分子是核苷酸（nucleotide）。
天然存在的核酸可分為：
╭ 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）
╰ 核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）
DNA貯存細(xì)胞所有的遺傳信息，是物種保持進(jìn)化和世代繁衍的物質(zhì)基礎(chǔ)。
RNA中參與蛋白質(zhì)合成的有三類：
╭ 轉(zhuǎn)移RNA（transfer RNA，tRNA）
∣ 核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）
╰ 信使RNA（messenger RNA，mRNA）
20世紀(jì)末，發(fā)現(xiàn)許多新的具有特殊功能的RNA，幾乎涉及細(xì)胞功能的各個(gè)方面。
核苷酸可分為：
╭ 核糖核苷酸：是RNA的構(gòu)件分子
╰ 脫氧核糖核苷酸：是DNA構(gòu)件分子。
細(xì)胞內(nèi)還有各種游離的核苷酸和核苷酸衍生物，它們具有重要的生理功能。
核苷酸由：
╭ 核苷（nucleoside）
╰ 磷酸（Phosphonic.acid）
核苷由：
╭ 堿基（base）
╰ 戊糖（Pentose）
堿基（base）：
構(gòu)成核苷酸中的堿基是含氮雜環(huán)化合物，由嘧啶（pyrimidine）和嘌呤（purine）構(gòu)成。
核酸：
╭ 嘌呤堿 ：
╭ 腺嘌呤
∣ ╰ 鳥嘌呤
╰ 嘧啶堿 ：
╭ 胞嘧啶
∣ 胸腺嘧啶
╰ 尿嘧啶
╭ DNA中含有腺嘌呤、鳥嘌呤和胞嘧啶，胸腺嘧啶主要存在于DNA中。
∣
╰ RNA中含有腺嘌呤、鳥嘌呤和胞嘧啶，尿嘧啶主要存在于RNA中。
在某些tRNA分子中也有胸腺嘧啶，少數(shù)幾種噬菌體的DNA含尿嘧啶而不是胸腺嘧啶。這五種堿基受介質(zhì)pH的影響出現(xiàn)酮式、烯醇式互變異構(gòu)體。
在DNA和RNA中，尤其是tRNA中還有一些含量甚少的堿基，稱為稀有堿基（rare bases）稀有堿基種類很多，大多數(shù)是甲基化堿基。tRNA中含稀有堿基高達(dá)10%。
戊糖：
核酸中有兩種戊糖DNA中為D-2-脫氧核糖（D-2-deoxyribose），RNA中則為D-核糖（D-ribose）。在核苷酸中，為了與堿基中的碳原子編號(hào)相區(qū)別核糖或脫氧核糖中碳原子標(biāo)以C-1’，C-2’等。脫氧核糖與核糖兩者的差別只在于脫氧核糖中與2’位碳原子連結(jié)的不是羥基而是氫，這一差別使DNA在化學(xué)上比RNA穩(wěn)定得多。
核苷：
核苷是戊糖與堿基之間以糖苷鍵（glycosidic bond）相連接而成。戊糖中C-1’與嘧啶堿的N-1或者與嘌吟堿的N9相連接，戊糖與堿基間的連接鍵是N-C鍵，一般稱為N-糖苷鍵。
RNA中含有稀有堿基，并且還存在異構(gòu)化的核苷。如在tRNA和rRNA中含有少量假尿嘧啶核苷（用ψ表示），在它的結(jié)構(gòu)中戊糖的C-1不是與尿嘧啶的N-1相連接，而是與尿嘧啶C-5相連接。
核苷酸：
核苷中的戊糖5’碳原子上羥基被磷酸酯化形成核苷酸。核苷酸分為核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸兩大類。依磷酸基團(tuán)的多少，有一磷酸核苷、二磷酸核苷、三磷酸核苷。核苷酸在體內(nèi)除構(gòu)成核酸外，尚有一些游離核苷酸參與物質(zhì)代謝、能量代謝與代謝調(diào)節(jié)，如三磷酸腺苷（ATP）是體內(nèi)重要能量載體；三磷酸尿苷參與糖原的合成；三磷酸胞苷參與磷脂的合成；環(huán)腺苷酸（cAMP）和環(huán)鳥苷酸（cGMP）作為第二信使，在信號(hào)傳遞過(guò)程中起重要作用；核苷酸還參與某些生物活性物質(zhì)的組成：如尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+），尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。
一個(gè)核苷酸分子戊糖的3′-羥基和另一個(gè)核苷酸分子戊糖的5′-磷酸可脫水縮合形成3′,5′-磷酸二酯鍵。許多核苷酸借助于磷酸二酯鍵相連形成的化合物稱為多聚核苷酸。多聚核苷酸呈線狀展開，稱為多聚核苷酸鏈，它是核酸的基本結(jié)構(gòu)形式。多聚核苷酸鏈有兩個(gè)末端，戊糖5′位帶有游離磷酸基的稱為5′末端，戊糖3′位帶有游離羥基的一端稱為3′末端。
一、DNA的分子結(jié)構(gòu)
（一）DNA的堿基組成特點(diǎn)
在50年代初，經(jīng)Chargaff等人的分析研究表明，DNA的堿基組成有下列一些特點(diǎn)：
1．各種生物的DNA分子中腺嘌呤與胸腺嘧啶的摩爾數(shù)相等，即A=T；鳥嘌呤與胞嘧啶的摩爾數(shù)相等，即G=C。因此，嘌呤堿的總數(shù)等于嘧啶堿的總數(shù)，即A+G=C+T。
2．DNA的堿基組成具有種屬特異性，即不同生物種屬的DNA具有各自特異的堿基組成，如人、牛和大腸桿菌的DNA堿基組成比例是不一樣的。
3．DNA的堿基組成沒(méi)有組織器官特異性，即同一生物體的各種不同器官或組織DNA的堿基組成相似。比如牛的肝、胰、脾、腎和胸腺等器官的DNA的堿基組成十分相近而無(wú)明顯差別。
4．生物體內(nèi)的堿基組成一般不受年齡、生長(zhǎng)狀況、營(yíng)養(yǎng)狀況和環(huán)境等條件的影響。這就是說(shuō)，每種生物的DNA具有各自特異的堿基組成，與生物的遺傳特性有關(guān)。
DNA堿基組成的這些規(guī)律稱Chargaff規(guī)則，這些規(guī)則為研究DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)提供了重要依據(jù)?！?/p>
（二）一級(jí)結(jié)構(gòu)
DNA是由許多脫氧核糖核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵連接起來(lái)的多聚核苷酸。DNA分子中脫氧核糖核苷酸的排列順序，稱為DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)。它是形成二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)?！?/p>
（三）二級(jí)結(jié)構(gòu)
DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是一個(gè)雙螺旋結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)模型于1953年由美國(guó)的Watson和英國(guó)的Crick兩位科學(xué)家共同提出，從本質(zhì)上揭示了生物遺傳性狀得以世代相傳的分子奧秘。其基本內(nèi)容如下：
1．主干鏈反向平行：DNA分子是一個(gè)由兩條平行的脫氧多核苷酸鏈圍繞同一個(gè)中心軸盤曲形成的右手螺旋結(jié)構(gòu)，兩條鏈行走方向相反，一條鏈為5′→3′走向，另一條鏈為3′→5′走向。磷酸基和脫氧核糖基構(gòu)成鏈的骨架，位于雙螺旋的外側(cè)；堿基位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)。堿基平面與中軸垂直。
2．側(cè)鏈堿基互補(bǔ)配對(duì)：兩條脫氧多核苷酸鏈通過(guò)堿基之間的氫鍵連接在一起。堿基之間有嚴(yán)格的配對(duì)規(guī)律：A與T配對(duì)，其間形成兩個(gè)氫鍵；G與C配對(duì)，其間形成三個(gè)氫鍵。這種配對(duì)規(guī)律，稱為堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。每一堿基對(duì)的兩個(gè)堿基稱為互補(bǔ)堿基，同一DNA分子的兩條脫氧多核苷酸鏈稱為互補(bǔ)鏈。
3．雙螺旋立體結(jié)構(gòu)：DNA雙螺旋的直徑為2nm，一圈螺旋含10個(gè)堿基對(duì)，每一堿基平面間的軸向距離為0.34nm，故每一螺旋的螺距為3.4nm，每個(gè)堿基的旋轉(zhuǎn)角度為36°。維持DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的力量主要是堿基對(duì)之間的堆積力，堿基對(duì)之間的氫鍵也起著重要作用。
（四）三級(jí)結(jié)構(gòu)
DNA雙螺旋進(jìn)一步盤曲形成更加復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，稱為DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)。絕大部分原核生物的DNA都是共價(jià)封閉的環(huán)狀雙螺旋分子，這種雙螺旋分子還需再次螺旋化形成超螺旋結(jié)構(gòu)。超螺旋是DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的最常見的形式。超螺旋方向與雙螺旋方向相反，使螺旋變松者，叫做負(fù)超螺旋；超螺旋方向與雙螺旋方向相同，使螺旋變緊者，叫做正超螺旋。在真核生物的染色質(zhì)中，DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的結(jié)合有關(guān)。構(gòu)成染色質(zhì)的基本單位是核小體。核小體由核小體核心和連接區(qū)組成。核小體核心由組蛋白八聚體（由H2A、H2B、H3、H4各兩分子組成）和盤繞其上的一段約含146堿基對(duì)（base pair,bp）的DNA雙鏈組成，連接區(qū)含有組蛋白H1和一小段DNA雙鏈（約60個(gè)堿基對(duì)）。核小體彼此相連成串珠狀染色質(zhì)細(xì)絲，染色質(zhì)細(xì)絲螺旋化形成染色質(zhì)纖維，后者進(jìn)一步卷曲、折疊形成染色單體。這樣，DNA的長(zhǎng)度被壓縮近萬(wàn)倍。
二、RNA的分子結(jié)構(gòu)
RNA分子中相鄰的兩個(gè)核糖核苷酸也是以3′，5′-磷酸二酯鍵連接形成多聚核糖核苷酸鏈。RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指多聚核糖核苷酸鏈中核糖核苷酸的排列順序。RNA分子是單鏈結(jié)構(gòu)，其核苷酸殘基數(shù)目在數(shù)十至數(shù)千之間，分子量一般在數(shù)百至數(shù)百萬(wàn)之間?！?/p>
RNA的多核苷酸鏈可以在某些部分彎曲折疊，形成局部雙螺旋結(jié)構(gòu)，此即RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在RNA的局部雙螺旋區(qū)，腺嘌呤（A）與尿嘧啶（U）、鳥嘌呤（G）與胞嘧啶（C）之間進(jìn)行配對(duì)，無(wú)法配對(duì)的區(qū)域以環(huán)狀形式突起。這種短的雙螺旋區(qū)域和環(huán)狀突起稱為發(fā)夾結(jié)構(gòu)。RNA在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步彎曲折疊就形成各自特有的三級(jí)結(jié)構(gòu)?！?/p>
（一）tRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
tRNA約含70~100個(gè)核苷酸殘基，是分子量最小的RNA，占RNA總量的16%，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有100多種。tRNA的主要生物學(xué)功能是轉(zhuǎn)運(yùn)活化了的氨基酸，參與蛋白質(zhì)的生物合成?！?/p>
各種tRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)互不相同，但它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)都呈三葉草形。這種三葉草形結(jié)構(gòu)的主要特征是，含有四個(gè)螺旋區(qū)、三個(gè)環(huán)和一個(gè)附加叉。四個(gè)螺旋區(qū)構(gòu)成四個(gè)臂，其中含有3′末端的螺旋區(qū)稱為氨基酸臂，因?yàn)榇吮鄣?′-末端都是C-C-A-OH序列，可與氨基酸連接。三個(gè)環(huán)分別用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。環(huán)Ⅰ含有5，6二氫尿嘧啶，稱為二氫尿嘧啶環(huán)（DHU環(huán)）。環(huán)Ⅱ頂端含有由三個(gè)堿基組成的反密碼子，稱為反密碼環(huán)；反密碼子可識(shí)別mRNA分子上的密碼子，在蛋白質(zhì)生物合成中起重要的翻譯作用。環(huán)Ⅲ含有胸苷（T）、假尿苷（ψ）、胞苷（C），稱為TψC環(huán)；此環(huán)可能與結(jié)合核糖體有關(guān)。tRNA在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步折疊成為倒“L”字母形的三級(jí)結(jié)構(gòu)?！?/p>
tRNA分子中稀有堿基的數(shù)量是所有核酸分子中比例最高的，這些稀有堿基的來(lái)源是轉(zhuǎn)錄之后經(jīng)過(guò)加工修飾形成的。
（二）mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
mRNA的含量最少，約占RNA總量的2%。mRNA一般都不穩(wěn)定，代謝活躍，更新迅速，半衰期短。mRNA分子中從5′-未端到3′-未端每三個(gè)相鄰的核苷酸組成的三聯(lián)體代表氨基酸信息，稱為密碼子。mRNA的生物學(xué)功能是傳遞DNA的遺傳信息，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的生物合成。細(xì)胞內(nèi)mRNA的種類很多，分子大小不一，由幾百至幾千個(gè)核苷酸組成。真核生物mRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)有如下特點(diǎn)：
1．mRNA的3′-未端有一段含30~200個(gè)核苷酸殘基組成的多聚腺苷酸（polyA）。此段polyA不是直接從DNA轉(zhuǎn)錄而來(lái)，而是轉(zhuǎn)錄后逐個(gè)添加上去的。有人把polyA稱為mRNA的“靴”。原核生物一般無(wú)polyA的結(jié)構(gòu)。此結(jié)構(gòu)與mRNA由胞核轉(zhuǎn)位胞質(zhì)及維持mRNA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定有關(guān)，它的長(zhǎng)度決定mRNA的半衰期。
2．mRNA的5′-未端有一個(gè)7-甲基鳥嘌呤核苷三磷酸（m7Gppp）的“帽”式結(jié)構(gòu)。此結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)的生物合成過(guò)程中可促進(jìn)核蛋白體與mRNA的結(jié)合，加速翻譯起始速度，并增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性，防止mRNA從頭水解。
在細(xì)胞核內(nèi)合成的mRNA初級(jí)產(chǎn)物被稱為不均一核RNA（hnRNA）,它們?cè)诤藘?nèi)迅速被加工、剪接成為成熟的mRNA并透出核膜到細(xì)胞質(zhì)?！?/p>
3、rRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
rRNA是細(xì)胞中含量最多的RNA，約占RNA總量的82%。rRNA單獨(dú)存在時(shí)不執(zhí)行其功能，它與多種蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖體，作為蛋白質(zhì)生物合成的“裝配機(jī)”。
rRNA的分子量較大，結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜，目前雖已測(cè)出不少rRNA分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)，但對(duì)其二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)及其功能的研究還需進(jìn)一步的深入。原核生物的rRNA分三類：5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA。真核生物的rRNA分四類：5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA。S為大分子物質(zhì)在超速離心沉降中的一個(gè)物理學(xué)單位，可間接反應(yīng)分子量的大小。原核生物和真核生物的核糖體均由大、小兩種亞基組成。
過(guò)去認(rèn)為，大亞基的蛋白質(zhì)具有酶的活性，促使肽鍵形成，故稱為轉(zhuǎn)肽酶。20世紀(jì)90年代初，H.F.Noller等證明大腸桿菌的23SrRNA能夠催化肽鍵的形成，才證明核糖體是一種核酶，從而根本改變了傳統(tǒng)的觀點(diǎn)。核糖體催化肽鍵合成的是rRNA，蛋白質(zhì)只是維持rRNA構(gòu)象，起輔助的作用。
三、 DNA的空間結(jié)構(gòu)
(一)DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)
DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)即雙螺旋結(jié)構(gòu)（double helix structure）。20世紀(jì)50年代初Chargaff等人分析多種生物DNA的堿基組成發(fā)現(xiàn)的規(guī)則。
DNA雙螺旋模型的提出不僅揭示了遺傳信息穩(wěn)定傳遞中DNA半保留復(fù)制的機(jī)制，而且是分子生物學(xué)發(fā)展的里程碑。
DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)特點(diǎn)如下：①兩條DNA互補(bǔ)鏈反向平行。②由脫氧核糖和磷酸間隔相連而成的親水骨架在螺旋分子的外側(cè)，而疏水的堿基對(duì)則在螺旋分子內(nèi)部，堿基平面與螺旋軸垂直，螺旋旋轉(zhuǎn)一周正好為10個(gè)堿基對(duì)，螺距為3.4nm，這樣相鄰堿基平面間隔為0.34nm并有一個(gè)36?的夾角。③DNA雙螺旋的表面存在一個(gè)大溝（major groove）和一個(gè)小溝（minor groove），蛋白質(zhì)分子通過(guò)這兩個(gè)溝與堿基相識(shí)別。④兩條DNA鏈依靠彼此堿基之間形成的氫鍵而結(jié)合在一起。根據(jù)堿基結(jié)構(gòu)特征，只能形成嘌呤與嘧啶配對(duì)，即A與T相配對(duì)，形成2個(gè)氫鍵；G與C相配對(duì)，形成3個(gè)氫鍵。因此G與C之間的連接較為穩(wěn)定。⑤DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定。維持這種穩(wěn)定性主要靠堿基對(duì)之間的氫鍵以及堿基的堆集力（stacking force）。
生理?xiàng)l件下，DNA雙螺旋大多以B型形式存在。右手雙螺旋DNA除B型外還有A型、C型、D型、E型。此外還發(fā)現(xiàn)左手雙螺旋Z型DNA。Z型DNA是1979年Rich等在研究人工合成的CGCGCG的晶體結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)的。Z-DNA的特點(diǎn)是兩條反向平行的多核苷酸互補(bǔ)鏈組成的螺旋呈鋸齒形，其表面只有一條深溝，每旋轉(zhuǎn)一周是12個(gè)堿基對(duì)。研究表明在生物體內(nèi)的DNA分子中確實(shí)存在Z-DNA區(qū)域，其功能可能與基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)還存在三股螺旋DNA，三股螺旋DNA中通常是一條同型寡核苷酸與寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸雙螺旋的大溝結(jié)合，三股螺旋中的第三股可以來(lái)自分子間，也可以來(lái)自分子內(nèi)。三股螺旋DNA存在于基因調(diào)控區(qū)和其他重要區(qū)域，因此具有重要生理意義。
?。ǘ?DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)——超螺旋結(jié)構(gòu)
DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)是指DNA鏈進(jìn)一步扭曲盤旋形成超螺旋結(jié)構(gòu)。生物體內(nèi)有些DNA是以雙鏈環(huán)狀DNA形式存在，如有些病毒DNA，某些噬菌體DNA，細(xì)菌染色體與細(xì)菌中質(zhì)粒DNA，真核細(xì)胞中的線粒體DNA、葉綠體DNA都是環(huán)狀的。環(huán)狀DNA分子可以是共價(jià)閉合環(huán)，即環(huán)上沒(méi)有缺口，也可以是缺口環(huán)，環(huán)上有一個(gè)或多個(gè)缺口。在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，共價(jià)閉合環(huán)DNA（covalently close circular DNA）可以進(jìn)一步扭曲形成超螺旋形（super helical form）。根據(jù)螺旋的方向可分為正超螺旋和負(fù)超螺旋。正超螺旋使雙螺旋結(jié)構(gòu)更緊密，雙螺旋圈數(shù)增加，而負(fù)超螺旋可以減少雙螺旋的圈數(shù)。幾乎所有天然DNA中都存在負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)。
?。ㄈ?DNA的四級(jí)結(jié)構(gòu)——DNA與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物
在真核生物中其基因組DNA要比原核生物大得多，如原核生物大腸桿菌的DNA約為4.7×103kb，而人的基因組DNA約為3×106 kb，因此真核生物基因組DNA通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，經(jīng)過(guò)多層次反復(fù)折疊，壓縮近10 000倍后，以染色體形式存在于平均直徑為5μm的細(xì)胞核中。線性雙螺旋DNA折疊的第一層次是形成核小體（nucleosome）。猶如一串念珠, 核小體由直徑為11nm×5.5nm的組蛋白核心和盤繞在核心上的DNA構(gòu)成。核心由組蛋白H2A、H2B、H3和H4各2分子組成，為八聚體，146 bp長(zhǎng)的 DNA以左手螺旋盤繞在組蛋白的核心1.75圈，形成核小體的核心顆粒，各核心顆粒間有一個(gè)連接區(qū)，約有60 bp雙螺旋DNA和1個(gè)分子組蛋白H1構(gòu)成。平均每個(gè)核小體重復(fù)單位約占DNA 200 bp。DNA組裝成核小體其長(zhǎng)度約縮短7倍。在此基礎(chǔ)上核小體又進(jìn)一步盤繞折疊，最后形成染色體。
（四）DNA結(jié)構(gòu)的多態(tài)性
?。譨tson和Crick所推導(dǎo)出來(lái)的DNA結(jié)構(gòu)在生物學(xué)研究中有深遠(yuǎn)意義。他們是以在生理鹽溶液中抽出的DNA纖維在92％相對(duì)溫度下進(jìn)行X－射線衍射圖譜為依據(jù)進(jìn)行推設(shè)的。在這一條件下得出的DNA稱B構(gòu)象。實(shí)際上在溶液中的DNA的確呈這一構(gòu)象，這也是最常見的DNA構(gòu)象。但是，研究表明DNA的結(jié)構(gòu)是動(dòng)態(tài)的。在以鈉、鉀或銫作反離子，相對(duì)溫度為75％時(shí)，DNA分子的X－射線衍射圖給出的是A構(gòu)象。這一構(gòu)象不僅出現(xiàn)于脫水DNA中，還出現(xiàn)在RNA分子中的雙螺旋區(qū)域的DNA－RNA雜交分子中。如果以鋰作反離子，相對(duì)溫度進(jìn)一步降為66％，則DNA是C構(gòu)象。但是這一構(gòu)象僅在實(shí)驗(yàn)室中觀察到，還未在生物體中發(fā)現(xiàn)。這些DNA分子中G-C堿基對(duì)較少，這些分子將取D和E構(gòu)象。這些研究表明DNA的分子結(jié)構(gòu)不是一成不變的，在不同的條件下可以有所不同。但是，這些不同構(gòu)象的DNA都有共同的一點(diǎn)，即它們都是右手雙螺旋；兩條反向平行的核苷酸鏈通過(guò)Ｗatson-Crick堿基配對(duì)結(jié)合在一起；鏈的重復(fù)單位是單核苷酸；這些螺旋中都有兩個(gè)螺旋溝，分為大溝與小溝，只是它們的寬窄和深淺程度有所不同。
但是，Wang和Rich等人在研究人工合成的CGCGCG單晶的X－射線衍射圖譜時(shí)分別發(fā)現(xiàn)這種六聚體的構(gòu)象與上面講到的完全不同。它是左手雙螺旋，在主鏈中各個(gè)磷酸根呈鋸齒狀排列，有如“之”字形一樣，因此叫它Z構(gòu)象（英文字Zigzag的第一個(gè)字母）。還有，這一構(gòu)象中的重復(fù)單位是二核苷酸而不是單核苷酸；而且Z－DNA只有一個(gè)螺旋溝，它相當(dāng)于B構(gòu)象中的小溝，它狹而深，大溝則不復(fù)存在。
立即就有幾個(gè)問(wèn)題被提了出來(lái)：這種結(jié)構(gòu)是怎樣生成的？這一結(jié)構(gòu)在天然狀態(tài)下存在嗎？它有什么生物學(xué)意義？
研究表明，Z－DNA的形成是DNA單鏈上出現(xiàn)嘌呤與嘧啶交替排列所成的。比如CGCGCGCG或者CACACACA。這種堿基排列方式會(huì)造成核苷酸的糖苷鍵的順式和反式構(gòu)象的交替存在。當(dāng)堿基與糖構(gòu)成反式結(jié)構(gòu)時(shí)，它們之間離得遠(yuǎn)；而當(dāng)它們成順式時(shí)，就彼此接近。嘧啶糖苷鍵通常是反式的，而嘌呤糖苷酸鍵既可成順式的也可成反式的。而在Z－DNA中，嘌呤堿是順式的。這樣，在Z－DNA中嘧啶的糖苷鏈離開小溝向外挑出，而嘌呤上的糖苷鍵則彎向小溝。嘌呤與嘧啶的交替排列就使得糖苷鍵也是順式與反式交替排列，從而使Z－DNA主鏈呈鋸齒狀或“之”字形。
人們相信，并用實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞DNA分子中確實(shí)存在有Z－DNA區(qū)。而且，細(xì)胞內(nèi)有一些因素可以促使B－DNA轉(zhuǎn)變?yōu)閆－DNA。比如，胞嘧啶第五位碳原子的甲基化，在甲基周圍形成局部的疏水區(qū)。這一區(qū)域擴(kuò)伸到B－DNA的大溝中，使B－DNA不穩(wěn)定而轉(zhuǎn)變?yōu)閆－DNA。這種C5甲基化現(xiàn)象在真核生物中是常見的。因此在生物B構(gòu)象的DNA中某些區(qū)段具有Z－DNA構(gòu)象是可能的。DNA真是一個(gè)構(gòu)象可變動(dòng)態(tài)分子。
Z－DNA有會(huì)么生物學(xué)意義呢？應(yīng)當(dāng)指出Z－DNA的形成通常在熱力學(xué)上是不利的。因?yàn)閆－DNA中帶負(fù)電荷的磷酸根距離太近了，這會(huì)產(chǎn)物靜電排斥。但是，DNA鏈的局部不穩(wěn)定區(qū)的存在就成為潛在的解鏈位點(diǎn)。DNA解螺旋卻是DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等過(guò)程中必要的環(huán)節(jié)，因此認(rèn)為這一結(jié)構(gòu)位點(diǎn)與基因調(diào)節(jié)有關(guān)。比如ＳＶ40增強(qiáng)子區(qū)中就有這種結(jié)構(gòu)，又如鼠類微小病毒ＤＮＳ復(fù)制區(qū)起始點(diǎn)附近有GC交替排列序列。此外，DNA螺旋上溝的特征在其信息表達(dá)過(guò)程中起關(guān)鍵作用。調(diào)控蛋白都是通過(guò)其分子上特定的氨基酸側(cè)鏈與DNA雙螺旋溝中的堿基對(duì)一側(cè)的氫原子供體或受體相互作用，形成氫鍵從而識(shí)別DNA上的遺傳信息的。大溝所帶的遺傳信息比小溝多。溝的寬窄和深淺也直接影響到調(diào)控蛋白質(zhì)對(duì)DNA信息的識(shí)別。Z－DNA中大溝消失，小溝狹而深，使調(diào)探蛋白識(shí)別方式也發(fā)生變化。這些都暗示Z－DNA的存在不僅僅是由于DNA中出現(xiàn)嘌呤－啶嘧交替排列之結(jié)果，也一定是在漫漫的進(jìn)化長(zhǎng)河中對(duì)DNA序列與結(jié)構(gòu)不斷調(diào)整與篩選的結(jié)果，有其內(nèi)在而深刻的含意，只是人們還未充分認(rèn)識(shí)而已。
DNA構(gòu)象的可變性，或者說(shuō)DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)拓寬了人們的視野。原來(lái)，生物體中最為穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)也可以采用不同的姿態(tài)來(lái)實(shí)現(xiàn)其豐富多采的生物的奧妙，也讓人們?cè)谶@一領(lǐng)域中探索和攀越時(shí)減少疲勞和厭倦，樂(lè)而忘返，從而有更多更新的發(fā)現(xiàn)。
多年來(lái)，DNA結(jié)構(gòu)的研究手段主要是X射線衍線技術(shù),其結(jié)果是通過(guò)間接觀測(cè)多個(gè)DNA分子有關(guān)結(jié)構(gòu)參數(shù)的平均值而獲得的。同時(shí)，這項(xiàng)技術(shù)的樣品分析條件使被測(cè)DNA分子與天然狀態(tài)相差甚遠(yuǎn)。因此，在反映DNA結(jié)構(gòu)真實(shí)性方面這種方法存在著缺陷。1989年,應(yīng)用掃描隧道顯微鏡(STM)研究DNA結(jié)構(gòu)克服了上述技術(shù)的缺陷。這種先進(jìn)的顯微技術(shù),不僅可將被測(cè)物放大500萬(wàn)倍,且能直接觀測(cè)接近天然條件下單個(gè)DNA分子的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。應(yīng)該說(shuō)它所取得的DNA結(jié)構(gòu)資料更具有"權(quán)威性"。表1-6是STM測(cè)到的B-DNA結(jié)構(gòu)參數(shù)及其與X射線衍線資料的比較結(jié)果。STM研究還證實(shí)了d(CG)重復(fù)序列的寡核苷酸片段為Z-DNA結(jié)構(gòu)的事實(shí)。STM技術(shù)的應(yīng)用是DNA結(jié)構(gòu)研究中的重要進(jìn)展,可望在探索DNA結(jié)構(gòu)的某些未知點(diǎn)上展示巨大潛力。
四、基因與基因組
?。ㄒ唬?基因（gene）的現(xiàn)代分子生物學(xué)概念是指能編碼有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或合成RNA所必需的全部核酸序列，是核酸分子的功能單位。一個(gè)基因通常包括編碼蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA的編碼序列，保證轉(zhuǎn)錄和加工所必需的調(diào)控序列和5’端、3’端非編碼序列。另外在真核生物基因中還有內(nèi)含子等核酸序列。
?。ǘ┗蚪M（genome）是指一個(gè)細(xì)胞或病毒所有基因及間隔序列，儲(chǔ)存了一個(gè)物種所有的遺傳信息。在病毒中通常是一個(gè)核酸分子的堿基序列，單細(xì)胞原核生物是它僅有的一條染色體的堿基序列，而多細(xì)胞真核生物是一個(gè)單倍體細(xì)胞內(nèi)所有的染色體。如人單倍體細(xì)胞的23條染色體的堿基序列。多細(xì)胞真核生物起源于同一個(gè)受精卵，其每個(gè)體細(xì)胞的基因組都是相同的。
1. 病毒基因組
2.原核生物基因組
3.真核生物基因組
在高等真核生物中基因序列占整個(gè)基因組不到10%，大部分是非編碼的間隔序列。人類基因組研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在人的基因組中與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的基因只占整個(gè)基因組2 %。真核生物基因組的最大的特點(diǎn)是出現(xiàn)分隔開的基因，在這類基因中有編碼作用的序列稱外顯子（exon），沒(méi)有編碼作用的序列稱內(nèi)含子（intron），它們彼此間隔排列。
五、各類RNA的結(jié)構(gòu)
絕大部分RNA分子都是線狀單鏈，但是RNA分子的某些區(qū)域可自身回折進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，形成局部雙螺旋。在RNA局部雙螺旋中A與U配對(duì)、G與C配對(duì)，除此以外，還存在非標(biāo)準(zhǔn)配對(duì)，如G與U配對(duì)。RNA分子中的雙螺旋與A型DNA雙螺旋相似，而非互補(bǔ)區(qū)則膨脹形成凸出（bulge）或者環(huán)（loop），這種短的雙螺旋區(qū)域和環(huán)稱為發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）。發(fā)夾結(jié)構(gòu)是RNA中最普通的二級(jí)結(jié)構(gòu)形式，二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步折疊形成三級(jí)結(jié)構(gòu)，RNA只有在具有三級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)才能成為有活性的分子。RNA也能與蛋白質(zhì)形成核蛋白復(fù)合物，RNA的四級(jí)結(jié)構(gòu)是RNA與蛋白質(zhì)的相互作用。
?。ㄒ唬?tRNA的結(jié)構(gòu)
tRNA約占總RNA的15%，tRNA主要的生理功能是在蛋白質(zhì)生物合成中轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸和識(shí)別密碼子，細(xì)胞內(nèi)每種氨基酸都有其相應(yīng)的一種或幾種tRNA， 因此tRNA的種類很多，在細(xì)菌中約有30~40種tRNA，在動(dòng)物和植物中約有50~100種tRNA。
1. tRNA一級(jí)結(jié)構(gòu)：
tRNA是單鏈分子，含73~93核苷酸，分子質(zhì)量為24 000～31 000，沉降系數(shù)4S。含有10%的稀有堿基。如二氫尿嘧啶（DHU）、核糖胸腺嘧啶（rT）和假尿苷（ψ）以及不少堿基被甲基化, 其3’端為CCA-OH，5’端多為pG, 分子中大約30%的堿基是不變的或半不變的，也就是說(shuō)它們的堿基類型是保守的。
2. tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)：
tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)為三葉草型。配對(duì)堿基形成局部雙螺旋而構(gòu)成臂，不配對(duì)的單鏈部分則形成環(huán)。三葉草型結(jié)構(gòu)由4臂4環(huán)組成。氨基酸臂由7對(duì)堿基組成，雙螺旋區(qū)的3’末端為一個(gè)4個(gè)堿基的單鏈區(qū)-NCCA-OH 3’，腺苷酸殘基的羥基可與氨基酸α羧基結(jié)合而攜帶氨基酸。二氫尿嘧啶環(huán)以含有2個(gè)稀有堿基二氫尿嘧啶（DHU）而得名，不同tRNA其大小并不恒定，在8-14個(gè)堿基之間變動(dòng)，二氫尿嘧啶臂一般由3~4對(duì)堿基組成。反密碼環(huán)由7個(gè)堿基組成，大小相對(duì)恒定，其中3個(gè)核苷酸組成反密碼子（anticodon），在蛋白質(zhì)生物合成時(shí)，可與mRNA上相應(yīng)的密碼子配對(duì)。反密碼臂由5對(duì)堿基組成。額外環(huán)在不同tRNA分子中變化較大可在4~21個(gè)堿基之間變動(dòng)，又稱為可變環(huán)，其大小往往是tRNA分類的重要指標(biāo)。TψC環(huán)含有7個(gè)堿基，大小相對(duì)恒定，幾乎所有的tRNA在此環(huán)中都含TψC序列，TψC臂由5對(duì)堿基組成。
3. tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)：
二十世紀(jì)七十年代初科學(xué)家用X線射衍技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)為倒L形（圖3-20b）。tRNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)是氨基酸臂與TψC臂構(gòu)成L的一橫，-CCAOH3’末端就在這一橫的端點(diǎn)上，是結(jié)合氨基酸的部位，而二氫尿嘧啶臂與反密碼臂及反密碼環(huán)共同構(gòu)成L的一豎，反密碼環(huán)在一豎的端點(diǎn)上，能與mRNA上對(duì)應(yīng)的密碼子識(shí)別，二氫尿嘧啶環(huán)與TψC環(huán)在L的拐角上。形成三級(jí)結(jié)構(gòu)的很多氫鍵與tRNA中不變的核苷酸密切有關(guān)，這就使得各種tRNA三級(jí)結(jié)構(gòu)都呈倒L形的。在tRNA中堿基堆積力是穩(wěn)定tRNA構(gòu)型的主要因素。
?。ǘ﹎RNA
原核生物中mRNA轉(zhuǎn)錄后一般不需加工，直接進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯。mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯不僅發(fā)生在同一細(xì)胞空間，而且這兩個(gè)過(guò)程幾乎是同時(shí)進(jìn)行的。真核細(xì)胞成熟mRNA是由其前體核內(nèi)不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA）剪接并經(jīng)修飾后才能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中參與蛋白質(zhì)合成。所以真核細(xì)胞mRNA的合成和表達(dá)發(fā)生在不同的空間和時(shí)間。mRNA的結(jié)構(gòu)在原核生物中和真核生物中差別很大。下面分別作一介紹：
1. 原核生物mRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
原核生物的mRNA結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，往往含有幾個(gè)功能上相關(guān)的蛋白質(zhì)的編碼序列，可翻譯出幾種蛋白質(zhì)，為多順?lè)醋?。在原核生物mRNA中編碼序列之間有間隔序列，可能與核糖體的識(shí)別和結(jié)合有關(guān)。在5’端與3’端有與翻譯起始和終止有關(guān)的非編碼序列，原核生物mRNA中沒(méi)有修飾堿基， 5’端沒(méi)有帽子結(jié)構(gòu)，3’端沒(méi)有多聚腺苷酸的尾巴（polyadenylate tail，polyA尾巴）。原核生物的mRNA的半衰期比真核生物的要短得多，現(xiàn)在一般認(rèn)為，轉(zhuǎn)錄后1min，mRNA降解就開始。
2. 真核生物mRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
真核生物mRNA為單順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)，即一個(gè)mRNA分子只包含一條多肽鏈的信息。在真核生物成熟的mRNA中5’端有m7GpppN的帽子結(jié)構(gòu)，帽子結(jié)構(gòu)可保護(hù)mRNA不被核酸外切酶水解，并且能與帽結(jié)合蛋白結(jié)合識(shí)別核糖體并與之結(jié)合，與翻譯起始有關(guān)。3’端有polyA尾巴，其長(zhǎng)度為20~250個(gè)腺苷酸，其功能可能與mRNA的穩(wěn)定性有關(guān)，少數(shù)成熟mRNA沒(méi)有polyA尾巴，如組蛋白mRNA，它們的半衰期通常較短。
?。ㄈ﹔RNA的結(jié)構(gòu)
rRNA占細(xì)胞總RNA的80%左右，rRNA分子為單鏈，局部有雙螺旋區(qū)域（圖3-22）具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，原核生物主要的rRNA有三種，即5S、16S和23S rRNA，如大腸桿菌的這三種rRNA分別由120、1542和2904個(gè)核苷酸組成。真核生物則有4種，即5S、5.8S、18S和28S rRNA, 如小鼠，它們相應(yīng)含121、158、1874和4718個(gè)核苷酸。rRNA分子作為骨架與多種核糖體蛋白（ribosomal protein）裝配成核糖體。
所有生物體的核糖體都由大小不同的兩個(gè)亞基所組成。原核生物核糖體為70S，由50S和30S兩個(gè)大小亞基組成。30S小亞基含16S的rRNA和21種蛋白質(zhì)，50S大亞基含23S和5S兩種rRNA及34種蛋白質(zhì)。真核生物核糖體為80S，是由60S和40S兩個(gè)大小亞基組成。40S的小亞基含18S rRNA及33種蛋白質(zhì)，60S大亞基則由28S、5.8S和5S ３種rRNA及49種蛋白質(zhì)組成。
（四）其他RNA分子
20世紀(jì)80年代以后由于新技術(shù)不斷產(chǎn)生，人們發(fā)現(xiàn)RNA有許多新的功能和新的RNA基因。細(xì)胞核內(nèi)小分子RNA（small nuclear RNA，snRNA）是細(xì)胞核內(nèi)核蛋白顆粒（Small nuclear ribonucleoprotein particles，snRNPs）的組成成分，參與mRNA前體的剪接以及成熟的mRNA由核內(nèi)向胞漿中轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程。核仁小分子RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）是類新的核酸調(diào)控分子, 參與rRNA前體的加工以及核糖體亞基的裝配。胞質(zhì)小分子RNA（small cytosol RNA， scRNA）的種類很多，其中7S LRNA與蛋白質(zhì)一起組成信號(hào)識(shí)別顆粒（signal recognition particle，SRP）, SRP參與分泌性蛋白質(zhì)的合成，反義RNA（antisense RNA）由于它們可以與特異的mRNA序列互補(bǔ)配對(duì)，阻斷mRNA翻譯，能調(diào)節(jié)基因表達(dá)。核酶是具有催化活性的RNA分子或RNA片段。目前在醫(yī)學(xué)研究中已設(shè)計(jì)了針對(duì)病毒的致病基因mRNA的核酶，抑制其蛋白質(zhì)的生物合成，為基因治療開辟新的途徑，核酶的發(fā)現(xiàn)也推動(dòng)了生物起源的研究。微RNA（microRNA，miRNA）是一種具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，長(zhǎng)度一般為20-24個(gè)核苷酸，在mRNA翻譯過(guò)程中起到開關(guān)作用，它可以與靶mRNA結(jié)合，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默作用（post-transcriptional gene silencing，PTGS），在一定條件下能釋放，這樣mRNA又能翻譯蛋白質(zhì)，由于miRNA的表達(dá)具有階段特異性和組織特異性，它們?cè)诨虮磉_(dá)調(diào)控和控制個(gè)體發(fā)育中起重要作用。
六、RNA組
隨著基因組研究不斷深入，蛋白組學(xué)研究逐漸展開，RNA的研究也取得了突破性的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了許多新的RNA分子，人們逐漸認(rèn)識(shí)到DNA是攜帶遺傳信息分子，蛋白質(zhì)是執(zhí)行生物學(xué)功能分子，而RNA即是信息分子，又是功能分子。人類基因組研究結(jié)果表明，在人類基因組中約有30000～40000個(gè)基因，其中與蛋白質(zhì)生物合成有關(guān)的基因只占整個(gè)基因組的2%，對(duì)不編碼蛋白質(zhì)的98%基因組的功能有待進(jìn)一步研究，為此20世紀(jì)末科學(xué)家在提出蛋白質(zhì)組學(xué)后，又提出RNA組學(xué)。RNA組是研究細(xì)胞的全部RNA基因和RNA的分子結(jié)構(gòu)與功能。目前RNA組的研究尚處在初級(jí)階段，RNA組的研究將在探索生命奧秘中做出巨大貢獻(xiàn)。
核酸的性質(zhì) (包括化學(xué)、物理、以及光譜學(xué)和熱力學(xué))：
a.化學(xué)：
?、?酸效應(yīng)：在強(qiáng)酸和高溫，核酸完全水解為堿基，核糖或脫氧核糖和磷酸。在濃度略稀的的無(wú)機(jī)酸中，最易水解的化學(xué)鍵被選擇性的斷裂，一般為連接嘌呤和核糖的糖苷鍵，從而產(chǎn)生脫嘌呤核酸。
?、?堿效應(yīng)
1. DNA:當(dāng)PH值超出生理范圍（PH7~8）時(shí)，對(duì)DNA結(jié)構(gòu)將產(chǎn)生更為微妙的影響。堿效應(yīng)使剪輯的互變異構(gòu)態(tài)發(fā)生變化。這種變化影響到特定堿基間的氫鍵作用，結(jié)果導(dǎo)致DNA雙鏈的解離，稱為DNA的變性
2. RNA：PH較高時(shí)，同樣的變性發(fā)生在RNA的螺旋區(qū)域中，但通常被RNA的堿性水解所掩蓋。這是因?yàn)镽NA存在的2`-OH參與到對(duì)磷酸脂鍵中磷酸分子的分子內(nèi)攻擊，從而導(dǎo)致RNA的斷裂。
?、?化學(xué)變性：一些化學(xué)物質(zhì)能夠使DNA/RNA在中性PH下變性。由堆積的疏水剪輯形成的核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)在能量上的穩(wěn)定性被削弱，則核酸變性。
b.物理：
④ 黏性：DNA的高軸比等性質(zhì)使得其水溶液具有高黏性，很長(zhǎng)的DNA分子又易于被機(jī)械力或超聲波損傷，同時(shí)黏度下降。
?、?浮力密度：可根據(jù)DNA的密度對(duì)其進(jìn)行純化和分析。在高濃度分子質(zhì)量的鹽溶液（CsCl）中，DNA具有與溶液大致相同的密度，將溶液高速離心，則CsCl趨于沉降于底部，從而建立密度梯度，而DNA最終沉降于其浮力密度相應(yīng)的位置，形成狹帶，這種技術(shù)成為平衡密度梯度離心或等密度梯度離心。
c.光譜學(xué)：
?、?減色性：dsDNA相對(duì)于ssDNA是減色的，而ssDNA相對(duì)于dsDNA是增色的。
?、?DNA純度：A260/A280。
d.熱力學(xué)：
?、?熱變性：dsDNA與RNA的熱力學(xué)表現(xiàn)不同，隨著溫度的升高RNA中雙鏈部分的堿基堆積會(huì)逐漸地減少，其吸光性值也逐漸地，不規(guī)則地增大。較短的堿基配對(duì)區(qū)域具有更高的熱力學(xué)活性，因而與較長(zhǎng)的區(qū)域相比變性快。而dsDNA熱變性是一個(gè)協(xié)同過(guò)程。分子末端以及內(nèi)部更為活躍的富含A-T的區(qū)域的變性將會(huì)使其赴京的螺旋變得不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致整個(gè)分子結(jié)構(gòu)在解鏈溫度下共同變性。
?、?復(fù)性：DNA的熱變性可通過(guò)冷卻溶液的方法復(fù)原。不同核酸鏈之間的互補(bǔ)部分的復(fù)性稱為雜交。
一、 核酸的大小和測(cè)定
一般來(lái)說(shuō)，進(jìn)化程度高的生物DNA分子應(yīng)越大，能貯存更多遺傳信息。但進(jìn)化的復(fù)雜程度與DNA大小并不完全一致，如哺乳類動(dòng)物DNA約為3×109 bp，但有些兩棲類動(dòng)物、南美肺魚DNA大小可達(dá)1010bp到1011bp。
常用測(cè)定DNA分子大小的方法有電泳法、離心法。凝膠電泳是當(dāng)前研究核酸的最常用方法，凝膠電泳有瓊脂糖（agarose）凝膠電泳和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠電泳。
二、核酸的水解
DNA和RNA中的糖苷鍵與磷酸酯鍵都能用化學(xué)法和酶法水解。在很低pH條件下DNA和RNA都會(huì)發(fā)生磷酸二酯鍵水解。并且堿基和核糖之間的糖苷鍵更易被水解，其中嘌呤堿的糖苷鍵比嘧啶堿的糖苷鍵對(duì)酸更不穩(wěn)定。在高pH時(shí)，RNA的磷酸酯鍵易被水解，而DNA的磷酸酯鍵不易被水解。
水解核酸的酶有很多種，若按底物專一性分類，作用于RNA的稱為核糖核酸酶（ribonuclease，RNase），作用于DNA的則稱為脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）。按對(duì)底物作用方式分類,可分核酸內(nèi)切酶（endonuclease）與核酸外切酶（exonuclease）。核酸內(nèi)切酶的作用是在多核苷酸內(nèi)部的3’，5’磷酸二酯鍵，有些內(nèi)切酶能識(shí)別DNA雙鏈上特異序列并水解有關(guān)的3’，5’磷酸二酯鍵。核酸內(nèi)切酶是非常重要的工具酶，在基因工程中有廣泛用途。而核酸外切酶只對(duì)核酸末端的3’，5’磷酸二酯鍵有作用，將核苷酸一個(gè)一個(gè)切下，可分為5’→3’外切酶，與3’→5’外切酶。
三、核酸的變性、復(fù)性和雜交
?。ㄒ唬?變性
在一定理化因素作用下，核酸雙螺旋等空間結(jié)構(gòu)中堿基之間的氫鍵斷裂，變成單鏈的現(xiàn)象稱為變性（denaturation）。引起核酸變性的常見理化因素有加熱、酸、堿、尿素和甲酰胺等。在變性過(guò)程中，核酸的空間構(gòu)象被破壞，理化性質(zhì)發(fā)生改變。由于雙螺旋分子內(nèi)部的堿基暴露，其A260值會(huì)大大增加。A260值的增加與解鏈程度有一定比例關(guān)系，這種關(guān)系稱為增色效應(yīng)（hyperchromic effect）。如果緩慢加熱DNA溶液，并在不同溫度測(cè)定其A260值，可得到 “S”形DNA熔化曲線（melting curve）。從DNA熔化曲線可見DNA變性作用是在一個(gè)相當(dāng)窄的溫度內(nèi)完成的。
當(dāng)A260值開始上升前DNA是雙螺旋結(jié)構(gòu)，在上升區(qū)域分子中的部分堿基對(duì)開始斷裂，其數(shù)值隨溫度的升高而增加，在上部平坦的初始部分尚有少量堿基對(duì)使兩條鏈還結(jié)合在一起，這種狀態(tài)一直維持到臨界溫度，此時(shí)DNA分子最后一個(gè)堿基對(duì)斷開，兩條互補(bǔ)鏈徹底分離。通常把加熱變性時(shí)DNA溶液A260升高達(dá)到最大值一半時(shí)的溫度稱為該DNA的熔解溫度（melting temperature Tm），Tm是研究核酸變性很有用的參數(shù)。Tm一般在85～95℃之間，Tm值與DNA分子中G C含量成正比。
?。ǘ?復(fù)性
變性DNA在適當(dāng)條件下，可使兩條分開的單鏈重新形成雙螺旋DNA的過(guò)程稱為復(fù)性（renaturation）。當(dāng)熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后復(fù)性稱為退火（annealing）。DNA復(fù)性是非常復(fù)雜的過(guò)程，影響DNA復(fù)性速度的因素很多：DNA濃度高，復(fù)性快；DNA分子大復(fù)性慢；高溫會(huì)使DNA變性，而溫度過(guò)低可使誤配對(duì)不能分離等等。最佳的復(fù)性溫度為Tm減去25℃，一般在60℃左右。離子強(qiáng)度一般在0.4mol/L以上。
?。ㄈ?雜交
具有互補(bǔ)序列的不同來(lái)源的單鏈核酸分子，按堿基配對(duì)原則結(jié)合在一起稱為雜交（hybridization）。雜交可發(fā)生在DNA-DNA、RNA-RNA和DNA-RNA之間。雜交是分子生物學(xué)研究中常用的技術(shù)之一，利用它可以分析基因組織的結(jié)構(gòu)，定位和基因表達(dá)等，常用的雜交方法有Southern印跡法，Northern印跡法和原位雜交（insitu hybridization）等。
在某些理化因素的作用下，DNA分子中的堿基堆積力和氫鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)被破壞，從而引起理化性質(zhì)和生物學(xué)功能的改變，這種現(xiàn)象稱為核酸的變性。能引起DNA變性的理化因素有加熱、pH值改變、乙醇、尿素等。DNA發(fā)生變性后，雙螺旋被解開，有更多的堿基共軛雙鍵暴露，對(duì)波長(zhǎng)260nm的紫外光吸收增強(qiáng)，這種現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。如果在連續(xù)加熱DNA的過(guò)程中以溫度對(duì)紫外光吸收值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線（圖3-3-1）。從曲線中可以看出，DNA的變性從開始解鏈到完全解鏈，是在一個(gè)相當(dāng)狹窄的溫度內(nèi)完成，在這一范圍內(nèi)，紫外光吸收值達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱為DNA的解鏈溫度，由于這一現(xiàn)象和結(jié)晶的融解過(guò)程類似，又稱融解溫度（Tm）。在Tm時(shí)，核酸分子內(nèi)50%的雙鏈結(jié)構(gòu)被解開。DNA的Tm值一般在70℃~85℃之間。DNA的Tm值大小與DNA分子中G、C的含量有關(guān)，因?yàn)镚—C之間有三個(gè)氫鍵，而A—T之間只有二個(gè)氫鍵，所以G、C越多的DNA，其分子結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，Tm值較高。變性DNA在適宜條件下，兩條彼此分開的鏈經(jīng)堿基互補(bǔ)可重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程稱為復(fù)性。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻即可復(fù)性，這一過(guò)程也稱為退火。最適宜的復(fù)性溫度比Tm約低25℃，這個(gè)溫度叫做退火溫度。
不同來(lái)源的核酸變性后，合并在一起進(jìn)行復(fù)性，只要它們存在大致相同的堿基互補(bǔ)配對(duì)序列，就可形成雜化雙鏈，此過(guò)程叫做雜交。雜交分子可以是DNA/DNA、DNA/RNA或RNA/DNA。用同位素標(biāo)記一個(gè)已知序列的寡核苷酸，通過(guò)雜交反應(yīng)就可確定待測(cè)核酸是否含有與之相同的序列，這種被標(biāo)記的寡核苷酸，叫做探針。雜交和探針技術(shù)對(duì)核酸結(jié)構(gòu)和功能的研究，對(duì)遺傳性疾病的診斷，對(duì)腫瘤病因?qū)W及基因工程的研究已有比較廣泛的應(yīng)用。
(1)DNA的變性：
指DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無(wú)規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。確切地就是維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵和疏水鍵的斷裂。斷裂可以是部分的或全部的，是可逆的或是非可逆的。DNA變性不涉及到其一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素都可以成為變性的條件，如加熱、極端的pH、有機(jī)試劑甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等,均可破壞雙螺旋結(jié)構(gòu)引起核酸分子變性。變性能導(dǎo)致DNA 以下一些理化及生物學(xué)性質(zhì)的改變。
溶液粘度降低。DNA雙螺旋是緊密的"剛性"結(jié)構(gòu),變性后代之以“柔軟” 而松散的無(wú)規(guī)則單股線性結(jié)構(gòu)，DNA粘度因此而明顯下降。
溶液旋光性發(fā)生改變。變性后整個(gè)DNA分子的對(duì)稱性及分子局部的構(gòu)性改變, 使DNA溶液的旋光性發(fā)生變化。
增色效應(yīng)或高色效應(yīng)(hyperchromic effect)。指變性后DNA 溶液的紫外吸收作用增強(qiáng)的效應(yīng)。DNA分子具有吸收250－280nm波長(zhǎng)的紫外光的特性，其吸收峰值在260nm。DNA分子中堿基間電子的相互作用是紫外吸收的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),但雙螺旋結(jié)構(gòu)有序堆積的堿基又"束縛"了這種作用。變 性DNA 的雙鏈解開,堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收,故而產(chǎn)生增色效應(yīng)。一般以260nm下的紫外吸收光密度作為觀測(cè)此效應(yīng)的指標(biāo),變性后該指標(biāo)的觀測(cè)值通常較變性前有明顯增加, 但不同來(lái)源DNA的變化不一,如大腸桿菌DNA經(jīng)熱變性后,其260nm的光密度值可增加40%以上, 其它不同來(lái)源的DNA溶液的增值范圍多在20－30%之間。
以加熱為變性條件時(shí),增色效應(yīng)與溫度有十分密切的關(guān)系,這主要是變性溫度取決于DNA自身的性質(zhì)。熱變性使DNA分子雙鏈解開所需溫度稱為熔解溫度( melting temperature,簡(jiǎn)寫Tm)。因熱變性是在很狹的溫度范圍內(nèi)突發(fā)的躍變過(guò)程, 很像結(jié)晶達(dá)到熔點(diǎn)時(shí)的熔化現(xiàn)象,故名熔解溫度。若以溫度對(duì)DNA溶液的紫外吸光率作圖,得到的典型DNA變性曲線呈S型。S型曲線下方平坦段,表示DNA的氫鍵未被破壞,待加熱到某一溫度處時(shí),次級(jí)鍵突發(fā)斷開,DNA迅速解鏈,同時(shí)伴隨吸光率急劇上升,此后因"無(wú)鏈可解"而出現(xiàn)溫度效應(yīng)喪失的上方平坦段。Tm定義中包含了使被測(cè)DNA的50%發(fā)生變性的意義,即增色效應(yīng)達(dá)到一半的溫度作為Tm,它在S型曲線上,相當(dāng)于吸光率增加的中點(diǎn)處所對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)。不同來(lái)源DNA間的Tm存在差別,在溶劑相同的前提下,這種差別主要是由DNA本身下列兩方面的性質(zhì)所造成的。(1)DNA的均一性。有二種含義，首先是指DNA分子中堿基組成的均一性,如人工合成的只含有一種堿基對(duì)的多核苷酸片段,與天然DNA比較,其Tm值范圍就較窄。因前者在變性時(shí)的氫鏈斷裂幾乎可"齊同"進(jìn)行,故所要求的變性溫度更趨于一致。其次還包含有待測(cè)樣品DNA的組成是否均一的意思,如樣品中只含有一種病毒DNA,其Tm值范圍較窄, 若混雜有其它來(lái)源的DNA,則Tm值范圍較寬。其原因顯然也與DNA的堿基組成有關(guān)。 總的說(shuō),DNA均一性,變性的DNA鏈各部分的氫鍵斷裂所需能量較接近,Tm值范圍較窄,反之亦然。(2)DNA的(G+C)含量。在溶劑固定的前提下，Tm值的高低取決于DNA分子中的(G+C)的含量。(G+C)含量越高,即G-C堿基對(duì)越多,Tm值越高。此點(diǎn)是易于理解的,因G-C堿基對(duì)具有3對(duì)氫鍵,而A-T堿基對(duì)只有2對(duì)氫鍵,DNA中(G+C)含量高顯然更能增強(qiáng)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,破壞G-C間氫鍵需比A-T氫鍵付出更多的能量,故(G+C)含量高的DNA,其變性Tm也高。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明,Tm與DNA中(G+C)含量存在著密切相關(guān)性(圖1-16),從中可看出,變性溫度受到溶液離子強(qiáng)度的影響。Tm與(G+C)含量(X)百分?jǐn)?shù)的這種關(guān)系可用以下經(jīng)驗(yàn)公式表示(DNA溶于0.2mol/L NaCl中):
X%(G+C)=2.44(Tm-69.3)
(2)DNA的復(fù)性：
指變性DNA 在適當(dāng)條件下,二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象,它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過(guò)程。熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性,此過(guò)程稱之為" 退火"(annealing)。這一術(shù)語(yǔ)也用以描述雜交核酸分子的形成(見后)。DNA的復(fù)性不僅受溫度影響,還受DNA自身特性等其它因素的影響。以下簡(jiǎn)要說(shuō)明之。
溫度和時(shí)間。變性DNA溶液在比Tm低25℃的溫度下維持一段長(zhǎng)時(shí)間,其吸光率會(huì)逐漸降低。將此DNA再加熱,其變性曲線特征可以基本恢復(fù)到第一次變性曲線的圖形。這表明復(fù)性是相當(dāng)理想的。一般認(rèn)為比Tm低25℃左右的溫度是復(fù)性的最佳條件,越遠(yuǎn)離此溫度,復(fù)性速度就越慢。在很低的溫度(如4℃以下)下,分子的熱運(yùn)動(dòng)顯著減弱互補(bǔ)鏈結(jié)合的機(jī)會(huì)自然大大減少。從熱運(yùn)動(dòng)的角度考慮,維持在Tm以下較高溫度,更有利于復(fù)性。復(fù)性時(shí)溫度下降必須是一緩慢過(guò)程,若在超過(guò)Tm的溫度下迅速冷卻至低溫(如4℃以下),復(fù)性幾乎是及不可能的,核酸實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常以此方式保持DNA的變性(單鏈)狀態(tài)。這說(shuō)明降溫時(shí)間太短以及溫差大均不利于復(fù)性。
DNA濃度。復(fù)性的第一步是兩個(gè)單鏈分子間的相互作用“成核”。這一過(guò)程進(jìn)行的速度與DNA濃度的平方成正比。即溶液中DNA分子越多，相互碰撞結(jié)合“成核”的機(jī)會(huì)越大。
DNA順序的復(fù)雜性。簡(jiǎn)單順序的DNA分子,如多聚(A)和多聚(U)這二種單鏈序列復(fù)性時(shí),互補(bǔ)堿基的配對(duì)較易實(shí)現(xiàn)。而順序復(fù)雜的DNA,如小牛DNA的非重復(fù)部分,一般以單拷貝存在于基因組中,這種復(fù)雜特定序列要實(shí)現(xiàn)互補(bǔ),顯然要比上述簡(jiǎn)單序列困難得多。在核酸復(fù)性研究中,定義了一個(gè)Cot的術(shù)語(yǔ),(Co為單鏈DNA的起始濃度,t是以秒為單位的時(shí)間),用以表示復(fù)性速度與DNA 順序復(fù)雜性的關(guān)系。在探討DNA順序?qū)?fù)性速度的影響時(shí),將溫度、溶劑離子強(qiáng)度、核酸片段大小等其它影響因素均予以固定,以不同程度的核酸分子重締合部分(在時(shí)間t時(shí)的復(fù)性率)取對(duì)數(shù)后對(duì)Cot作圖,可以得到如圖所示的曲線,用非重復(fù)堿基對(duì)數(shù)表示核酸分子的復(fù)雜性。如多聚(A)的復(fù)雜性為1,重復(fù)的(ATGC)n組成的多聚體的復(fù)雜性為4,分子長(zhǎng)度是105核苷對(duì)的非重復(fù)DNA的復(fù)雜性為105。原核生物基因組均為非重復(fù)順序,故以非重復(fù)核苷酸對(duì)表示的復(fù)雜性直接與基因組大小成正比,對(duì)于真核生物基因組中的非重復(fù)片段也是如此。在標(biāo)準(zhǔn)條件下(一般為0.18ml/L陽(yáng)離子濃度,400核苷酸的長(zhǎng)的片段)測(cè)得的復(fù)性率達(dá)0.5時(shí)的Cot值(稱Cotl/2),與核苷酸對(duì)的復(fù)雜性成正比。對(duì)于原核生物核酸分子，此值可代表基因組的大小及基因組中核苷酸對(duì)的復(fù)雜程度。真核基因組中因含有許多不同程度的重復(fù)序列（repetitive sequence)，所得到的Cot曲線要上圖中的S曲線復(fù)雜。
(3)核酸分子雜交：
分子雜交(簡(jiǎn)稱雜交,hybridization)是核酸研究中一項(xiàng)最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。其基本原理就是應(yīng)用核酸分子的變性和復(fù)性的性質(zhì),使來(lái)源不同的DNA(或RNA)片段,按堿基互補(bǔ)關(guān)系形成雜交雙鏈分子(heteroduplex)。雜交雙鏈可以在DNA與DNA鏈之間,也可在RNA與DNA鏈之間形成。雜交的本質(zhì)就是在一定條件下使互補(bǔ)核酸鏈實(shí)現(xiàn)復(fù)性(加熱或堿處理)使雙螺旋解開成為單鏈,因此,變性技術(shù)也是核酸雜交的一個(gè)環(huán)節(jié)。
若雜交的目的是識(shí)別靶DNA中的特異核苷酸序列,這需要牽涉到另一項(xiàng)核酸操作的基本技術(shù)─探針(probe)的制備。探針是指帶有某些標(biāo)記物(如放射性同位素32P,熒光物質(zhì)異硫氰酸熒光素等)的特異性核酸序列片段。若我們?cè)O(shè)法使一個(gè)核酸序列帶上32P,那么它與靶序列互補(bǔ)形成的雜交雙鏈,就會(huì)帶有放射性。以適當(dāng)方法接受來(lái)自雜交鏈的放射信號(hào),即可對(duì)靶序列DNA的存在及其分子大小加以鑒別。在現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中,探針的制備和使用是與分子雜交相輔相成的技術(shù)手段。核酸分子雜交作為一項(xiàng)基本技術(shù),已應(yīng)用于核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的各個(gè)方面。在醫(yī)學(xué)上,目前已用于多種遺傳性疾病的基因診斷(gene diagnosis),惡性腫瘤的基因分析,傳染病病原體的檢測(cè)等領(lǐng)域中,其成果大大促進(jìn)了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展。
DNA（為英文Deoxyribonucleic acid的縮寫）,又稱脫氧核糖核酸，是染色體的主要化學(xué)成分，同時(shí)也是基因組成的，有時(shí)被稱為“遺傳微?！薄NA是一種分子，可組成遺傳指令，以引導(dǎo)生物發(fā)育與生命機(jī)能運(yùn)作。主要功能是長(zhǎng)期性的資訊儲(chǔ)存，可比喻為“藍(lán)圖”或“食譜”。其中包含的指令，是建構(gòu)細(xì)胞內(nèi)其他的化合物，如蛋白質(zhì)與RNA所需。帶有遺傳訊息的DNA片段稱為基因，其他的DNA序列，有些直接以自身構(gòu)造發(fā)揮作用，有些則參與調(diào)控遺傳訊息的表現(xiàn)。
單體脫氧核糖核酸聚合而成的聚合體——脫氧核糖核酸鏈，也被稱為DNA。在繁殖過(guò)程中，父代把它們自己DNA的一部分（通常一半，即DNA雙鏈中的一條）復(fù)制傳遞到子代中，從而完成性狀的傳播。因此，化學(xué)物質(zhì)DNA會(huì)被稱為“遺傳微?！?。原核細(xì)胞的擬核是一個(gè)長(zhǎng)DNA分子。真核細(xì)胞核中有不止一個(gè)染色體，每條染色體上含有一個(gè)或兩個(gè)DNA。不過(guò)它們一般都比原核細(xì)胞中的DNA分子大而且和蛋白質(zhì)結(jié)合在一起。DNA分子的功能是貯存決定物種性狀的幾乎所有蛋白質(zhì)和RNA分子的全部遺傳信息;編碼和設(shè)計(jì)生物有機(jī)體在一定的時(shí)空中有序地轉(zhuǎn)錄基因和表達(dá)蛋白完成定向發(fā)育的所有程序;初步確定了生物獨(dú)有的性狀和個(gè)性以及和環(huán)境相互作用時(shí)所有的應(yīng)激反應(yīng).除染色體DNA外，有極少量結(jié)構(gòu)不同的DNA存在于真核細(xì)胞的線粒體和葉綠體中。DNA病毒的遺傳物質(zhì)也是DNA,極少數(shù)為RNA.
DNA是一種長(zhǎng)鏈聚合物，組成單位稱為核苷酸，而糖類與磷酸分子借由酯鍵相連，組成其長(zhǎng)鏈骨架。每個(gè)糖分子都與四種堿基里的其中一種相接，這些堿基沿著DNA長(zhǎng)鏈所排列而成的序列，可組成遺傳密碼，是蛋白質(zhì)氨基酸序列合成的依據(jù)。讀取密碼的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)錄，是根據(jù)DNA序列復(fù)制出一段稱為RNA的核酸分子。多數(shù)RNA帶有合成蛋白質(zhì)的訊息，另有一些本身就擁有特殊功能，例如rRNA、snRNA與siRNA。
【四鏈體DNA】
Sundpuist和Klug在模擬1種原生動(dòng)物棘毛蟲的端粒DNA時(shí),人工合成了1段DNA序列,發(fā)現(xiàn)在一定條件下模擬的富G單鏈DNA可形成四鏈體DNA結(jié)構(gòu)。由此推測(cè)染色體端粒尾的單鏈之間也形成了四鏈體。Kang等人分別用實(shí)驗(yàn)證實(shí)在晶體和溶液中，富G DNA也能夠形成四鏈體DNA結(jié)構(gòu)。
四鏈體DNA的基本結(jié)構(gòu)單位是G-四聯(lián)體，即在四聯(lián)體的中心有1個(gè)由4個(gè)帶負(fù)電荷的羧基氧原子圍成的“口袋”通過(guò)G-四聯(lián)體的堆積可以形成分子內(nèi)或分子間的右手螺旋，與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)比較，G-四聯(lián)體螺旋有2個(gè)顯著的特點(diǎn)：1、它的穩(wěn)定性決定于口袋內(nèi)所結(jié)合的陽(yáng)離子種類，已知k離子的結(jié)合使四聯(lián)體螺旋最穩(wěn)定；2、它的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)都很穩(wěn)定。
就目前對(duì)一些生物的DNA序列分析得知，富鳥嘌呤的DNA序列多見于一些在功能上及進(jìn)化上都相當(dāng)保守的基因組區(qū)域，許多研究表明，富鳥嘌呤DNA鏈所形成的G-DNA可能是作為分子之間相互識(shí)別的元件之一，在生物體細(xì)胞中起著一些特殊作用
【DNA的復(fù)制】
DNA是遺傳信息的載體，故親代DNA必須以自身分子為模板準(zhǔn)確的復(fù)制成兩個(gè)拷貝，并分配到兩個(gè)子細(xì)胞中去，完成其遺傳信息載體的使命。而DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)對(duì)于維持這類遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性和復(fù)制的準(zhǔn)確性都是極為重要的。
（一）DNA的半保留復(fù)制
Waston和Click在提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時(shí)曾就DNA復(fù)制過(guò)程進(jìn)行過(guò)研究，發(fā)現(xiàn)DNA在復(fù)制過(guò)程中堿基間的氫鍵首先斷裂（通過(guò)解旋酶），雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋分開，每條鏈分別作模板合成新鏈。由于每個(gè)子代DNA的一條鏈來(lái)自親代，另一條則是新合成的，故稱之為半保留式復(fù)制(semiconservative replication)。
?。ǘ〥NA復(fù)制過(guò)程
1．DNA雙螺旋的解旋
?。?）單鏈DNA結(jié)合蛋白（single—stranded DNA binding protein, ssbDNA蛋白）
?。?）DNA解鏈酶（DNA helicase）
?。?）DNA解鏈
2．岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制
3．復(fù)制的引發(fā)和終止
?。ㄈ┒肆：投肆Ｃ?
1941年美籍印度人麥克林托克（Mc Clintock）就提出了端粒(telomere)的假說(shuō)，認(rèn)為染色體末端必然存在一種特殊結(jié)構(gòu)——端粒?，F(xiàn)在已知染色體端粒的作用至少有二：① 保護(hù)染色體末端免受損傷，使染色體保持穩(wěn)定；② 與核纖層相連，使染色體得以定位。
【DNA的理化性質(zhì)】
DNA是大分子高分子聚合物，DNA溶液為高分子溶液，具有很高的粘度。DNA對(duì)紫外線有吸收作用，當(dāng)核酸變性時(shí)，吸光值升高；當(dāng)變性核酸可復(fù)性時(shí)，吸光值又會(huì)恢復(fù)到原來(lái)水平。溫度、有機(jī)溶劑、酸堿度、尿素、酰胺等試劑都可以引起DNA分子變性，即使得DNA雙鍵間的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開。
DNA(deoxyribonucleic acid)指脫氧核糖核酸(染色體和基因的組成部分) 脫氧核苷酸的高聚物，是染色體的主要成分。遺傳信息的絕大部分貯存在DNA分子中。
【DNA的酶催化活性】
20世紀(jì)90年代，Cuenoud等發(fā)現(xiàn)DNA也有酶催化活性，他們根據(jù)共有序列設(shè)計(jì)并合成了由47個(gè)核苷酸組成的單鏈DNA——E47，它可以催化兩個(gè)底物DNA片段之間的連接。DNA的雙功能性對(duì)“RNA世界”的進(jìn)化觀點(diǎn)提出了挑戰(zhàn)。
【分布和功能】
原核細(xì)胞的染色體是一個(gè)長(zhǎng)DNA分子。真核細(xì)胞核中有不止一個(gè)染色體，每個(gè)染色體也只含一個(gè)DNA分子。不過(guò)它們一般都比原核細(xì)胞中的DNA分子大而且和蛋白質(zhì)結(jié)合在一起。DNA分子的功能是貯存決定物種的所有蛋白質(zhì)和RNA結(jié)構(gòu)的全部遺傳信息；策劃生物有次序地合成細(xì)胞和組織組分的時(shí)間和空間；確定生物生命周期自始至終的活性和確定生物的個(gè)性。除染色體DNA外，有極少量結(jié)構(gòu)不同的DNA存在于真核細(xì)胞的線粒體和葉綠體中。DNA病毒的遺傳物質(zhì)也是DNA。
【DNA的發(fā)現(xiàn)】
自從孟德爾的遺傳定律被重新發(fā)現(xiàn)以后，人們又提出了一個(gè)問(wèn)題：遺傳因子是不是一種物質(zhì)實(shí)體？為了解決基因是什么的問(wèn)題，人們開始了對(duì)核酸和蛋白質(zhì)的研究。
遺傳學(xué)創(chuàng)始人孟德爾早在1868年，人們就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了核酸。在德國(guó)化學(xué)家霍佩·賽勒的實(shí)驗(yàn)室里，有一個(gè)瑞士籍的研究生名叫米歇爾（1844--1895），他對(duì)實(shí)驗(yàn)室附近的一家醫(yī)院扔出的帶膿血的繃帶很感興趣，因?yàn)樗滥撗悄切榱吮Ｐl(wèi)人體健康，與病菌“作戰(zhàn)”而戰(zhàn)死的白細(xì)胞和被殺死的人體細(xì)胞的“遺體”。于是他細(xì)心地把繃帶上的膿血收集起來(lái)，并用胃蛋白酶進(jìn)行分解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞遺體的大部分被分解了，但對(duì)細(xì)胞核不起作用。他進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞核內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核中含有一種富含磷和氮的物質(zhì)?；襞濉べ惱沼媒湍缸鰧?shí)驗(yàn)，證明米歇爾對(duì)細(xì)胞核內(nèi)物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)是正確的。于是他便給這種從細(xì)胞核中分離出來(lái)的物質(zhì)取名為 “核素”，后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)它呈酸性，因此改叫“核酸”。從此人們對(duì)核酸進(jìn)行了一系列卓有成效的研究。
20世紀(jì)初，德國(guó)科賽爾（1853--1927）和他的兩個(gè)學(xué)生瓊斯（1865--1935）和列文（1869－－1940）的研究，弄清了核酸的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)，認(rèn)為它是由許多核苷酸組成的大分子。核苷酸是由堿基、核糖和磷酸構(gòu)成的。其中堿基有4種（腺瞟吟、鳥嘌吟、胸腺嘧啶和胞嘧啶），核糖有兩種（核糖、脫氧核糖），因此把核酸分為核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）。
列文急于發(fā)表他的研究成果，錯(cuò)誤地認(rèn)為4種堿基在核酸中的量是相等的，從而推導(dǎo)出核酸的基本結(jié)構(gòu)是由4個(gè)含不同堿基的核苷酸連接成的四核苷酸，以此為基礎(chǔ)聚合成核酸，提出了"四核苷酸假說(shuō)"。這個(gè)錯(cuò)誤的假說(shuō)，對(duì)認(rèn)識(shí)復(fù)雜的核酸結(jié)構(gòu)起了相當(dāng)大的阻礙作用，也在一定程度上影響了人們對(duì)核酸功能的認(rèn)識(shí)。人們認(rèn)為，雖然核酸存在于重要的結(jié)構(gòu)--細(xì)胞核中，但它的結(jié)構(gòu)太簡(jiǎn)單，很難設(shè)想它能在遺傳過(guò)程中起什么作用。
美國(guó)遺傳學(xué)家摩爾根蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)比核酸早30年，發(fā)展迅速。進(jìn)入20世紀(jì)時(shí)，組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中已有12種被發(fā)現(xiàn)，到1940年則全部被發(fā)現(xiàn)。
1902年，德國(guó)化學(xué)家費(fèi)歇爾提出氨基酸之間以肽鏈相連接而形成蛋白質(zhì)的理論，1917年他合成了由15個(gè)甘氨酸和3個(gè)亮氨酸組成的18個(gè)肽的長(zhǎng)鏈。于是，有的科學(xué)家設(shè)想，很可能是蛋白質(zhì)在遺傳中起主要作用。如果核酸參與遺傳作用，也必然是與蛋白質(zhì)連在一起的核蛋白在起作用。因此，那時(shí)生物界普遍傾向于認(rèn)為蛋白質(zhì)是遺傳信息的載體。
1928年，美國(guó)科學(xué)家格里菲斯（1877--1941）用一種有莢膜、毒性強(qiáng)的和一種無(wú)莢膜、毒性弱的肺炎雙球菌對(duì)老鼠做實(shí)驗(yàn)。他把有莢病菌用高溫殺死后與無(wú)莢的活病菌一起注人老鼠體內(nèi)，結(jié)果他發(fā)現(xiàn)老鼠很快發(fā)病死亡，同時(shí)他從老鼠的血液中分離出了活的有莢病菌。這說(shuō)明無(wú)莢菌竟從死的有莢菌中獲得了什么物質(zhì)，使無(wú)莢菌轉(zhuǎn)化為有莢菌。這種假設(shè)是否正確呢？格里菲斯又在試管中做實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)把死了的有美菌與活的無(wú)莢菌同時(shí)放在試管中培養(yǎng)，無(wú)莢菌全部變成了有莢菌，并發(fā)現(xiàn)使無(wú)莢菌長(zhǎng)出蛋白質(zhì)莢的就是已死的有莢菌殼中遺留的核酸（因?yàn)樵诩訜嶂?，莢中的核酸并沒(méi)有被破壞）。格里菲斯稱該核酸為"轉(zhuǎn)化因子"。
1944年，美國(guó)細(xì)菌學(xué)家艾弗里（1877--1955）從有美菌中分離得到活性的“轉(zhuǎn)化因子”，并對(duì)這種物質(zhì)做了檢驗(yàn)蛋白質(zhì)是否存在的試驗(yàn)，結(jié)果為陰性，并證明“轉(zhuǎn)化因子”是DNA。但這個(gè)發(fā)現(xiàn)沒(méi)有得到廣泛的承認(rèn)，人們懷疑當(dāng)時(shí)的技術(shù)不能除凈蛋白質(zhì)，殘留的蛋白質(zhì)起到轉(zhuǎn)化的作用。
美籍德國(guó)科學(xué)家德爾布呂克（1906--1981）的噬菌體小組對(duì)艾弗里的發(fā)現(xiàn)堅(jiān)信不移。因?yàn)樗麄冊(cè)陔娮语@微鏡下觀察到了噬菌體的形態(tài)和進(jìn)入大腸桿菌的生長(zhǎng)過(guò)程。噬菌體是以細(xì)菌細(xì)胞為寄主的一種病毒，個(gè)體微小，只有用電子顯微鏡才能看到它。它像一個(gè)小蝌蚪，外部是由蛋白質(zhì)組成的頭膜和尾鞘，頭的內(nèi)部含有DNA，尾鞘上有尾絲、基片和小鉤。當(dāng)噬菌體侵染大腸桿菌時(shí)，先把尾部末端扎在細(xì)菌的細(xì)胞膜上，然后將它體內(nèi)的DNA全部注人到細(xì)菌細(xì)胞中去，蛋白質(zhì)空殼仍留在細(xì)菌細(xì)胞外面，再?zèng)]有起什么作用了。進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后的噬菌體DNA，就利用細(xì)菌內(nèi)的物質(zhì)迅速合成噬菌體的DNA和蛋白質(zhì)，從而復(fù)制出許多與原噬菌體大小形狀一模一樣的新噬菌體，直到細(xì)菌被徹底解體，這些噬菌體才離開死了的細(xì)菌，再去侵染其他的細(xì)菌。
1952年，噬菌體小組主要成員赫爾希（1908一）和他的學(xué)生蔡斯用先進(jìn)的同位素標(biāo)記技術(shù)，做噬菌體侵染大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)。他把大腸桿菌T2噬菌體的核酸標(biāo)記上32P，蛋白質(zhì)外殼標(biāo)記上35S。先用標(biāo)記了的T2噬菌體感染大腸桿菌，然后加以分離，結(jié)果噬菌體將帶35S標(biāo)記的空殼留在大腸桿菌外面，只有噬菌體內(nèi)部帶有32P標(biāo)記的核酸全部注人大腸桿菌，并在大腸桿菌內(nèi)成功地進(jìn)行噬菌體的繁殖。這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明DNA有傳遞遺傳信息的功能，而蛋白質(zhì)則是由 DNA的指令合成的。這一結(jié)果立即為學(xué)術(shù)界所接受。
幾乎與此同時(shí)，奧地利生物化學(xué)家查加夫（1905--）對(duì)核酸中的4種堿基的含量的重新測(cè)定取得了成果。在艾弗里工作的影響下，他認(rèn)為如果不同的生物種是由于DNA的不同，則DNA的結(jié)構(gòu)必定十分復(fù)雜，否則難以適應(yīng)生物界的多樣性。因此，他對(duì)列文的"四核苷酸假說(shuō)"產(chǎn)生了懷疑。在1948－ 1952年4年時(shí)間內(nèi)，他利用了比列文時(shí)代更精確的紙層析法分離4種堿基，用紫外線吸收光譜做定量分析，經(jīng)過(guò)多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)，終于得出了不同于列文的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在DNA大分子中嘌吟和嘧啶的總分子數(shù)量相等，其中腺嘌吟A與胸腺嘧啶T數(shù)量相等，鳥嘌吟G與胞嘧啶C數(shù)量相等。說(shuō)明DNA分子中的堿基A 與T、G與C是配對(duì)存在的，從而否定了"四核苷酸假說(shuō)"，并為探索DNA分子結(jié)構(gòu)提供了重要的線索和依據(jù)。
1953年4月25日，英國(guó)的《自然》雜志刊登了美國(guó)的沃森和英國(guó)的克里克在英國(guó)劍橋大學(xué)合作的研究成果：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的分子模型，這一成果后來(lái)被譽(yù)為20世紀(jì)以來(lái)生物學(xué)方面最偉大的發(fā)現(xiàn)，標(biāo)志著分子生物學(xué)的誕生。
沃森（1928一）在中學(xué)時(shí)代是一個(gè)極其聰明的孩子，15歲時(shí)便進(jìn)入芝加哥大學(xué)學(xué)習(xí)。當(dāng)時(shí)，由于一個(gè)允許較早人學(xué)的實(shí)驗(yàn)性教育計(jì)劃，使沃森有機(jī)會(huì)從各個(gè)方面完整地攻讀生物科學(xué)課程。在大學(xué)期間，沃森在遺傳學(xué)方面雖然很少有正規(guī)的訓(xùn)練，但自從閱讀了薛定愕的《生命是什么？--活細(xì)胞的物理面貌》一書，促使他去"發(fā)現(xiàn)基因的秘密"。他善于集思廣益，博取眾長(zhǎng)，善于用他人的思想來(lái)充實(shí)自己。只要有便利的條件，不必強(qiáng)迫自己學(xué)習(xí)整個(gè)新領(lǐng)域，也能得到所需要的知識(shí)。沃森22歲取得博士學(xué)位，然后被送往歐洲攻讀博士后研究員。為了完全搞清楚一個(gè)病毒基因的化學(xué)結(jié)構(gòu)，他到丹麥哥本哈根實(shí)驗(yàn)室學(xué)習(xí)化學(xué)。有一次他與導(dǎo)師一起到意大利那不勒斯參加一次生物大分子會(huì)議，有機(jī)會(huì)聽英國(guó)物理生物學(xué)家威爾金斯（1916--）的演講，看到了威爾金斯的DNAX射線衍射照片。從此，尋找解開DNA結(jié)構(gòu)的鑰匙的念頭在沃森的頭腦中索回。什么地方可以學(xué)習(xí)分析X射線衍射圖呢？于是他又到英國(guó)劍橋大學(xué)卡文迪什實(shí)驗(yàn)室學(xué)習(xí)，在此期間沃森認(rèn)識(shí)了克里克。
克里克（1916一2004）上中學(xué)時(shí)對(duì)科學(xué)充滿熱情，1937年畢業(yè)于倫敦大學(xué)。1946年，他閱讀了《生命是什么？－活細(xì)胞的物理面貌》一書，決心把物理學(xué)知識(shí)用于生物學(xué)的研究，從此對(duì)生物學(xué)產(chǎn)生了興趣。1947年他重新開始了研究生的學(xué)習(xí)，1949年他同佩魯茲一起使用X射線技術(shù)研究蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，于是在此與沃森相遇了。當(dāng)時(shí)克里克比沃森大12歲，還沒(méi)有取得博士學(xué)位。但他們談得很投機(jī)，沃森感到在這里居然能找到一位懂得DNA比蛋白質(zhì)更重要的人，真是三生有幸。同時(shí)沃森感到在他所接觸的人當(dāng)中，克里克是最聰明的一個(gè)。他們每天交談至少幾個(gè)小時(shí)，討論學(xué)術(shù)問(wèn)題。兩個(gè)人互相補(bǔ)充，互相批評(píng)以及相互激發(fā)出對(duì)方的靈感。他們認(rèn)為解決DNA分子結(jié)構(gòu)是打開遺傳之謎的關(guān)鍵。只有借助于精確的X射線衍射資料，才能更快地弄清DNA的結(jié)構(gòu)。為了搞到DNAX射線衍射資料，克里克請(qǐng)威爾金斯到劍橋來(lái)度周末。在交談中威爾金斯接受了DNA結(jié)構(gòu)是螺旋型的觀點(diǎn)，還談到他的合作者富蘭克林（1920一1958，女）以及實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家們，也在苦苦思索著DNA結(jié)構(gòu)模型的問(wèn)題。從1951年11月至1953年4月的18個(gè)月中，沃森、克里克同威爾金斯、富蘭克林之間有過(guò)幾次重要的學(xué)術(shù)交往。
1951年11月，沃森聽了富蘭克林關(guān)于DNA結(jié)構(gòu)的較詳細(xì)的報(bào)告后，深受啟發(fā)，具有一定晶體結(jié)構(gòu)分析知識(shí)的沃森和克里克認(rèn)識(shí)到，要想很快建立 DNA結(jié)構(gòu)模型，只能利用別人的分析數(shù)據(jù)。他們很快就提出了一個(gè)三股螺旋的DNA結(jié)構(gòu)的設(shè)想。1951年底，他們請(qǐng)威爾金斯和富蘭克林來(lái)討論這個(gè)模型時(shí)，富蘭克林指出他們把DNA的含水量少算了一半，于是第一次設(shè)立的模型宣告失敗。
有一天，沃森又到國(guó)王學(xué)院威爾金斯實(shí)驗(yàn)室，威爾金斯拿出一張富蘭克林最近拍制的“B型”DNA的X射線衍射的照片。沃森一看照片，立刻興奮起來(lái)、心跳也加快了，因?yàn)檫@種圖像比以前得到的“A型”簡(jiǎn)單得多，只要稍稍看一下“B型”的X射線衍射照片，再經(jīng)簡(jiǎn)單計(jì)算，就能確定DNA分子內(nèi)多核苷酸鏈的數(shù)目了。
克里克請(qǐng)數(shù)學(xué)家?guī)椭?jì)算，結(jié)果表明源吟有吸引嘧啶的趨勢(shì)。他們根據(jù)這一結(jié)果和從查加夫處得到的核酸的兩個(gè)嘌吟和兩個(gè)嘧啶兩兩相等的結(jié)果，形成了堿基配對(duì)的概念。
他們苦苦地思索4種堿基的排列順序，一次又一次地在紙上畫堿基結(jié)構(gòu)式，擺弄模型，一次次地提出假設(shè)，又一次次地推翻自己的假設(shè)。
沃森(左)和克里克有一次，沃森又在按著自己的設(shè)想擺弄模型，他把堿基移來(lái)移去尋找各種配對(duì)的可能性。突然，他發(fā)現(xiàn)由兩個(gè)氫鍵連接的腺膘吟一胸腺嘧啶對(duì)竟然和由3個(gè)氫鍵連接的鳥嘌吟一胞嘧啶對(duì)有著相同的形狀，于是精神為之大振。因?yàn)猷岩鞯臄?shù)目為什么和嘧啶數(shù)目完全相同這個(gè)謎就要被解開了。查加夫規(guī)律也就一下子成了 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的必然結(jié)果。因此，一條鏈如何作為模板合成另一條互補(bǔ)堿基順序的鏈也就不難想象了。那么，兩條鏈的骨架一定是方向相反的。
經(jīng)過(guò)沃森和克里克緊張連續(xù)的工作，很快就完成了DNA金屬模型的組裝。從這模型中看到，DNA由兩條核苷酸鏈組成，它們沿著中心軸以相反方向相互纏繞在一起，很像一座螺旋形的樓梯，兩側(cè)扶手是兩條多核苷酸鏈的糖一磷基因交替結(jié)合的骨架，而踏板就是堿基對(duì)。由于缺乏準(zhǔn)確的X射線資料，他們還不敢斷定模型是完全正確的。
威爾金斯富蘭克林下一步的科學(xué)方法就是把根據(jù)這個(gè)模型預(yù)測(cè)出的衍射圖與X射線的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作一番認(rèn)真的比較。他們又一次打電話請(qǐng)來(lái)了威爾金斯。不到兩天工夫，威爾金斯和富蘭克林就用X射線數(shù)據(jù)分析證實(shí)了雙螺旋結(jié)構(gòu)模型是正確的，并寫了兩篇實(shí)驗(yàn)報(bào)告同時(shí)發(fā)表在英國(guó)《自然》雜志上。1962年，沃森、克里克和威爾金斯獲得了諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)，而富蘭克林因患癌癥于1958年病逝而未被授予該獎(jiǎng)。
20世紀(jì)30年代后期，瑞典的科學(xué)家們就證明DNA是不對(duì)稱的。第二次世界大戰(zhàn)后，用電子顯微鏡測(cè)定出DNA分子的直徑約為2nm。
DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被發(fā)現(xiàn)后，極大地震動(dòng)了學(xué)術(shù)界，啟發(fā)了人們的思想。從此，人們立即以遺傳學(xué)為中心開展了大量的分子生物學(xué)的研究。首先是圍繞著4 種堿基怎樣排列組合進(jìn)行編碼才能表達(dá)出20種氨基酸為中心開展實(shí)驗(yàn)研究。1967年，遺傳密碼全部被破解，基因從而在DNA分子水平上得到新的概念。它表明：基因?qū)嶋H上就是DNA大分子中的一個(gè)片段，是控制生物性狀的遺傳物質(zhì)的功能單位和結(jié)構(gòu)單位。在這個(gè)單位片段上的許多核苷酸不是任意排列的，而是以有含意的密碼順序排列的。一定結(jié)構(gòu)的DNA，可以控制合成相應(yīng)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)是組成生物體的重要成分，生物體的性狀主要是通過(guò)蛋白質(zhì)來(lái)體現(xiàn)的。因此，基因?qū)π誀畹目刂剖峭ㄟ^(guò)DNA控制蛋白質(zhì)的合成來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在此基礎(chǔ)上相繼產(chǎn)生了基因工程、酶工程、發(fā)酵工程、蛋白質(zhì)工程等，這些生物技術(shù)的發(fā)展必將使人們利用生物規(guī)律造福于人類?，F(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，愈來(lái)愈顯示出它將要上升為帶頭學(xué)科的趨勢(shì)。
【DNA重組技術(shù)的發(fā)展】
20世紀(jì)50年代，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被闡明，揭開了生命科學(xué)的新篇章，開創(chuàng)了科學(xué)技術(shù)的新時(shí)代。隨后，遺傳的分子機(jī)理――DNA復(fù)制、遺傳密碼、遺傳信息傳遞的中心法則、作為遺傳的基本單位和細(xì)胞工程藍(lán)圖的基因以及基因表達(dá)的調(diào)控相繼被認(rèn)識(shí)。至此，人們已完全認(rèn)識(shí)到掌握所有生物命運(yùn)的東西就是DNA和它所包含的基因，生物的進(jìn)化過(guò)程和生命過(guò)程的不同，就是因?yàn)镈NA和基因運(yùn)作軌跡不同所致。
知道DNA的重大作用和價(jià)值后，生命科學(xué)家首先想到能否在某些與人類利益密切相關(guān)的方面打破自然遺傳的鐵律，讓患病者的基因改邪歸正以達(dá)治病目的，把不同來(lái)源的基因片段進(jìn)行“嫁接”以產(chǎn)生新品種和新品質(zhì)……于是，一個(gè)充滿了誘惑力的科學(xué)幻想奇跡般地成為現(xiàn)實(shí)。這是發(fā)生在20世紀(jì)70年代初的事情。
實(shí)現(xiàn)這一科學(xué)奇跡的科技手段就是DNA重組技術(shù)。1972年，美國(guó)科學(xué)家保羅?伯格首次成功地重組了世界上第一批DNA分子，標(biāo)志著DNA重組技術(shù)――基因工程作為現(xiàn)代生物工程的基礎(chǔ)，成為現(xiàn)代生物技術(shù)和生命科學(xué)的基礎(chǔ)與核心
DNA重組技術(shù)的具體內(nèi)容就是采用人工手段將不同來(lái)源的含某種特定基因的DNA片段進(jìn)行重組，以達(dá)到改變生物基因類型和獲得特定基因產(chǎn)物的目的的一種高科學(xué)技術(shù)。
到了20世紀(jì)70年代中后期，由于出現(xiàn)了工程菌以及實(shí)現(xiàn)DNA重組和后處理都有工程化的性質(zhì)，基因工程或遺傳工程作為DNA重組技術(shù)的代名詞被廣泛使用?，F(xiàn)在，基因工程還包括基因組的改造、核酸序列分析、分子進(jìn)化分析、分子免疫學(xué)、基因克隆、基因診斷和基因治療等內(nèi)容?？梢哉f(shuō)，DNA重組技術(shù)創(chuàng)立近 30多年來(lái)所獲得的豐碩成果已經(jīng)把人們帶進(jìn)了一個(gè)不可思議的夢(mèng)幻般的科學(xué)世界，使人類獲得了打開生命奧秘和防病治病“魔盒”的金鑰匙。
目前，DNA重組技術(shù)已經(jīng)取得的成果是多方面的。到20世紀(jì)末，DNA重組技術(shù)最大的應(yīng)用領(lǐng)域在醫(yī)藥方面，包括活性多肽、蛋白質(zhì)和疫苗的生產(chǎn)，疾病發(fā)生機(jī)理、診斷和治療，新基因的分離以及環(huán)境監(jiān)測(cè)與凈化。
許多活性多肽和蛋白質(zhì)都具有治療和預(yù)防疾病的作用，它們都是從相應(yīng)的基因中產(chǎn)生的。但是由于在組織細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)量極微，所以采用常規(guī)方法很難獲得足夠量供臨床應(yīng)用。
基因工程則突破了這一局限性，能夠大量生產(chǎn)這類多肽和蛋白質(zhì)，迄今已成功地生產(chǎn)出治療糖尿病和精神分裂癥的胰島素，對(duì)血癌和某些實(shí)體腫瘤有療效的抗病毒劑――干擾素，治療侏儒癥的人體生長(zhǎng)激素，治療肢端肥大癥和急性胰腺炎的生長(zhǎng)激素釋放抑制因子等100多種產(chǎn)品。
基因工程還可將有關(guān)抗原的DNA導(dǎo)入活的微生物，這種微生物在受免疫應(yīng)激后的宿主體內(nèi)生長(zhǎng)可產(chǎn)生弱毒活疫苗，具有抗原刺激劑量大、且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。目前正在研制的基因工程疫苗就有數(shù)十種之多，在對(duì)付細(xì)菌方面有針對(duì)麻風(fēng)桿菌、百日咳桿菌、淋球菌、腦膜炎雙球菌等的疫苗；在對(duì)付病毒方面有針對(duì)甲型肝炎、乙型肝炎、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹、流感、人體免疫缺陷病毒等的疫苗……。我國(guó)乙肝病毒攜帶者和乙肝患者多達(dá)一二億，這一情況更促使了我國(guó)科學(xué)家自行成功研制出乙肝疫苗，取得了巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
抗體是人體免疫系統(tǒng)防病抗病的主要武器之一，20世紀(jì)70年代創(chuàng)立的單克隆抗體技術(shù)在防病抗病方面雖然發(fā)揮了重要作用，但由于人源性單抗很難獲得，使得單抗在臨床上的應(yīng)用受到限制。為解決此問(wèn)題，近年來(lái)科學(xué)家采用DNA重組技術(shù)已獲得了人源性抗體，這種抗體既可保證它與抗原結(jié)合的專一性和親合力，又能保證正常功能的發(fā)揮。目前，已有多種這樣的抗體進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，如抗HER-2人源化單抗治療乳腺癌已進(jìn)入Ⅲ期試驗(yàn)，抗IGE人源化單抗治療哮喘病已進(jìn)入Ⅱ期試驗(yàn)。
抗生素在治療疾病上起到了重要作用，隨著抗生素?cái)?shù)量的增加，用傳統(tǒng)方法發(fā)現(xiàn)新抗生素的幾率越來(lái)越低。為了獲取更多的新型抗生素，采用DNA重組技術(shù)已成為重要手段之一。目前人們已獲得數(shù)十種基因工程“雜合”的抗生素，為臨床應(yīng)用開辟了新的治療途徑。
值得指出的是，以上所述基因工程多肽、蛋白質(zhì)、疫苗、抗生素等防治藥物不僅在有效控制疾病，而且在避免毒副作用方面也往往優(yōu)于以傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的同類藥品，因而更受人們青睞。
人類疾病都直接或間接與基因相關(guān)，在基因水平上對(duì)疾病進(jìn)行診斷和治療，則既可達(dá)到病因診斷的準(zhǔn)確性和原始性，又可使診斷和治療工作達(dá)到特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速的目的。于基因水平進(jìn)行診斷和治療在專業(yè)上稱為基因診斷和基因治療。目前基因診斷作為第四代臨床診斷技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于對(duì)遺傳病、腫瘤、心腦血管疾病、病毒細(xì)菌寄生蟲病和職業(yè)病等的診斷；而基因治療的目標(biāo)則是通過(guò)DNA重組技術(shù)創(chuàng)建具有特定功能的基因重組體，以補(bǔ)償失去功能的基因的作用，或是增加某種功能以利對(duì)異常細(xì)胞進(jìn)行矯正或消滅。
在理論上，基因治療是治本治愈而無(wú)任何毒副作用的療法。不過(guò)，盡管至今國(guó)際上已有100多個(gè)基因治療方案正處于臨床試驗(yàn)階段，但基因治療在理論和技術(shù)上的一些難題仍使這種治療方法離大規(guī)模應(yīng)用還有一段很長(zhǎng)的距離。不論是確定基因病因還是實(shí)施基因診斷、基因治療、研究疾病發(fā)生機(jī)理，關(guān)鍵的先決條件是要了解特定疾病的相關(guān)基因。隨著“人類基因組計(jì)劃”的臨近完成，科學(xué)家們對(duì)人體全部基因?qū)?huì)獲得全面的了解，這就為運(yùn)用基因重組技術(shù)造逼于人類健康事業(yè)創(chuàng)造了條件。
不過(guò)，雖然基因技術(shù)向人類展示了它奇妙的“魔術(shù)師”般的魅力，但也有大量的科學(xué)家對(duì)這種技術(shù)的發(fā)展予以人類倫理和生態(tài)演化的自然法則的沖擊表示出極大的擔(dān)憂。從理論上來(lái)講，這種技術(shù)發(fā)展的一個(gè)極致就是使人類擁有了創(chuàng)造任何生命形態(tài)或從未有過(guò)的生物的能力。人們能夠想像這將是怎樣的結(jié)果嗎?
科學(xué)家在DNA中發(fā)現(xiàn)除基因密碼之外的新密碼
據(jù)臺(tái)灣媒體報(bào)道，美國(guó)與以色列科學(xué)家相信，他們已在DNA(去氧核醣核酸)之中找到除了基因密碼之外的第二種密碼。新發(fā)現(xiàn)的密碼負(fù)責(zé)決定核體─亦即DNA所環(huán)繞的微型蛋白質(zhì)線軸─之位置。這些線軸同時(shí)保護(hù)與控制通往DNA本身的途徑。
這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)若獲得證實(shí)，可能開啟有關(guān)控制基因更高位階的機(jī)制新知。譬如，每一種人體細(xì)胞得以激活其所需基因，卻又無(wú)法觸及其它種類細(xì)胞所使用的基因等既關(guān)鍵又神秘的過(guò)程。
以色列魏茲曼研究院的塞格爾與美國(guó)西北大學(xué)的威頓及其同僚，在這一期“自然”科學(xué)期刊中，撰文描述這種DNA新密碼。
每一個(gè)人體細(xì)胞里都有約三千萬(wàn)個(gè)核體。之所以需要這么多的核體，是因?yàn)镈NA線包覆每一個(gè)核體僅一.六五次，每個(gè)DNA螺旋就包含一百四十七個(gè)單位，而且單一染色體里的DNA分子在長(zhǎng)度上可能就有高達(dá)二億二千五百萬(wàn)個(gè)單位。
生物學(xué)家多年來(lái)一直懷疑，DNA上的某些位置，特別是DNA最容易彎曲的那些位置，可能比其它位置更有利于核體的存在，但整體模式并不顯而易見。如今，塞格爾與威頓博士分析了酵母菌基因內(nèi)約二百個(gè)位置的序列，這些都是既知核體糾結(jié)在一起的地方，兩人發(fā)現(xiàn)其中確實(shí)隱含一個(gè)模式存在。
透過(guò)了解此一模式，他們成功預(yù)測(cè)其它有機(jī)體大約五成核體的位置。這個(gè)模式乃是能讓DNA更容易彎曲，以及緊密包復(fù)核體的兩種序列結(jié)合而成。但在此一模式中，每一個(gè)核體糾結(jié)的位置僅需若干序列出現(xiàn)即可，因此并不明顯。正由于其形成條件松散，因此并不與基因密碼沖突。
【DNA親子鑒定】
鑒定親子關(guān)系目前用得最多的是DNA分型鑒定。人的血液、毛發(fā)、唾液、口腔細(xì)胞等都可以用于用親子鑒定，十分方便。 一個(gè)人有23對(duì)（46條）染色體，同一對(duì)染色體同一位置上的一對(duì)基因稱為等位基因，一般一個(gè)來(lái)自父親，一個(gè)來(lái)自母親。如果檢測(cè)到某個(gè)DNA位點(diǎn)的等位基因，一個(gè)與母親相同，另一個(gè)就應(yīng)與父親相同，否則就存在疑問(wèn)了。
利用DNA進(jìn)行親子鑒定，只要作十幾至幾十個(gè)DNA位點(diǎn)作檢測(cè)，如果全部一樣，就可以確定親子關(guān)系，如果有3個(gè)以上的位點(diǎn)不同，則可排除親子關(guān)系，有一兩個(gè)位點(diǎn)不同，則應(yīng)考慮基因突變的可能，加做一些位點(diǎn)的檢測(cè)進(jìn)行辨別。DNA親子鑒定，否定親子關(guān)系的準(zhǔn)確率幾近100%，肯定親子關(guān)系的準(zhǔn)確率可達(dá)到99.99%。
DNA親子鑒定測(cè)試的常見問(wèn)題
什么是DNA親子鑒定測(cè)試?
DNA(脫氧核糖核酸)是人身體內(nèi)細(xì)胞的原子物質(zhì)。 每個(gè)原子有46個(gè)染色體,另外,男性的精子細(xì)胞和女性的卵子, 各有23個(gè)染色體,當(dāng)精子和卵子結(jié)合的時(shí)候。這46個(gè)原子染色體就制造一個(gè)生命, 因此,每人從生父處繼承一半的分子物質(zhì), 而另一半則從生母處獲得。
DNA親子鑒定測(cè)試與傳統(tǒng)的血液測(cè)試有很大的不同。 它可以在不同的樣本上進(jìn)行測(cè)試, 包括血液,腮腔細(xì)胞, 組織細(xì)胞樣本和精液樣本。 由于血液型號(hào), 例如A型, B型, O型或RH型, 在人群中的運(yùn)用比較普遍, 用來(lái)分辨每一個(gè)人的血緣關(guān)系, 但不如DNA親子鑒定測(cè)試有效。除了真正雙胞胎外, 每人的DNA是獨(dú)一無(wú)二的. 由于它是這樣獨(dú)特, 就好像指紋一樣, 用于親子鑒定, DNA是最為有效的方法。我們的結(jié)果通常是比法庭上要求的還準(zhǔn)確10到100倍。
親子鑒定的準(zhǔn)確性
DNA親子鑒定是目前最準(zhǔn)確的親權(quán)鑒定方法，如果小孩的遺傳位點(diǎn)和被測(cè)試男子的位點(diǎn)（至少1個(gè)）不一致，那么該男子便100％被排除血緣關(guān)系之外，即他絕對(duì)不可能是孩子的父親。如果孩子與其父母親的位點(diǎn)都吻合，我們就能得出親權(quán)關(guān)系大于99．99％的可能性，即證明他們之間的血緣親子關(guān)系。
親子鑒定須知（1） 被鑒定人應(yīng)由母－子－可疑父親或父母－子組成，只要求父子或母子二人鑒定者一般不予受理；（2） 成年被鑒定人均應(yīng)自愿同意鑒定，12歲以上的青少年應(yīng)適當(dāng)求其對(duì)鑒定的意見；（3） 被鑒定人應(yīng)了解自己或近親屬有無(wú)遺傳病史；（4） 被鑒定子女年齡一般在半歲以上為好；（5） 羊水或絨毛作親子鑒定應(yīng)孕婦及可疑父親簽定委托鑒定協(xié)議書。
【DNA超速離心】
近代質(zhì)粒DNA分離純化以從大腸桿菌中分離為代表，鑒于大局桿菌（E.coli）在分子生物學(xué)研究中的重要地位，從E.coli中分離純化質(zhì)控DNA〈Piasmid DNA〉成為近年來(lái)超離心技術(shù)中一個(gè)重要課題。而質(zhì)粒DNA的快速分離純化又對(duì)超離心設(shè)備（超速離心機(jī)、轉(zhuǎn)頭和附屬設(shè)備）提出了更高要求。
E.coli是典型的原核細(xì)胞生物，由于原核細(xì)胞缺乏其核細(xì)胞所具有的那種由單位膜組成的可把多種功能組分分隔為專一化的和局部獨(dú)立區(qū)域的內(nèi)膜系統(tǒng)，因而沒(méi)有其核細(xì)胞所包含的細(xì)胞器（核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線拉體、溶酶體等等）。電鏡顯微照片顯示E.coli有兩個(gè)可以區(qū)別的內(nèi)部區(qū)域一一細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)，在它們外面圍著一層較薄的細(xì)胞質(zhì)膜和很厚的細(xì)胞壁，在細(xì)胞壁外部附著一些一端游離的鞭毛。質(zhì)粒DNA位于核區(qū)，以細(xì)絲狀存在，這種細(xì)絲狀物在多種情況下是極長(zhǎng)的環(huán)狀DNA的一些片斷所折疊起來(lái)的聚密體。
針對(duì)E.coli的顯微結(jié)構(gòu)待點(diǎn)，在進(jìn)行超離心分離純化質(zhì)粒DNA之前的預(yù)處理順序是：
E.coli→用溶菌酶去細(xì)胞壁→用表面活性劑如SDS、Trit X-100等EE細(xì)胞膜→用乙酸鍋使DNA、RNA及蛋白質(zhì)大部分沉淀(90%以上)。
沉淀物可以在加入TE緩沖液(10m-MTris-HCL lmMEDTA,pH8.0)后分子篩上住去蛋白,去RNA;也可以用超速離心法去蛋白質(zhì),去RNA，去級(jí)狀DNA或DNA斷片。
【質(zhì)粒DNA超速離心的分離方法】
傳統(tǒng)的分離方法：數(shù)年前，由于受設(shè)備條件限制，質(zhì)粒DNA的分離一般用CsCl平衡等密度離心法，自形成梯度。以10~12ml單管容量為例，用甩平轉(zhuǎn)頭分離，36.000rpm×60小時(shí)，用角式轉(zhuǎn)頭分離45,OOOrpm×36小時(shí)，前者包括加減速在內(nèi)共用去1.3億轉(zhuǎn)驅(qū)動(dòng)部壽命，后者也要用去1億轉(zhuǎn)驅(qū)動(dòng)部壽命，這對(duì)當(dāng)時(shí)超速離心機(jī)總壽命為100~200億轉(zhuǎn)來(lái)看，無(wú)疑每次實(shí)驗(yàn)費(fèi)用過(guò)高，加上CsCl用量多、價(jià)格貴等因素，使這類分離純化工作成為非常昂貴的實(shí)驗(yàn)。
?。?）超速垂直管轉(zhuǎn)頭的離心分離（欽合金或碳纖維制造的）：從1975年垂直管轉(zhuǎn)頭向世后，近年來(lái)各主要離心機(jī)生產(chǎn)商開發(fā)的垂直管轉(zhuǎn)頭，單管容量0.2ml到4Oml，最高轉(zhuǎn)速?gòu)?0,000rpm到120,000rpm,RCFmax可達(dá)700,OOOXg，90年代開發(fā)的新機(jī)型和轉(zhuǎn)頭己能夠使質(zhì)粒DNA垂直管離心分離實(shí)驗(yàn)做起來(lái)得心應(yīng)手。
?。?）近垂直管轉(zhuǎn)頭離心分離：為了消除垂直管轉(zhuǎn)頭用于質(zhì)粒DNA離心在壁部形成的RNA沉淀對(duì)已形成的DNA區(qū)帶的污染，同時(shí)也為了改進(jìn)一般斜角式轉(zhuǎn)頭（傾角25?——35?）由于沉降距離較長(zhǎng)，因而分離時(shí)間也較長(zhǎng)的缺點(diǎn)，近幾年開發(fā)了多種近垂直管轉(zhuǎn)頭（即Near VerticalTube Rot時(shí),簡(jiǎn)稱NVT轉(zhuǎn)頭或Neo Angle Rotor,小假角轉(zhuǎn)頭,簡(jiǎn)稱NT).它們的離心管縱剖面中心軸線與離心機(jī)驅(qū)動(dòng)軸線之間夾角在7.5?——10?之間,轉(zhuǎn)速?gòu)?5,000rpm到120,OOOrpm，RCFmax可達(dá)646,000×g單管容量從2ml至13.5ml。NVT（或NT）轉(zhuǎn)頭的開發(fā)主要是為質(zhì)粒DNA分離而設(shè)計(jì)，當(dāng)然它也適用于線粒體DNA、染色體DNA、RNA及血清脂蛋白的分離?純化。
?。?）不連續(xù)階梯梯度分離:質(zhì)校DNA分離純化傳統(tǒng)方法是采用金管CsCl自形成梯度平衡等密度離心法，離心開始時(shí)金管CsCl密度均一，樣品均勻分布其中。
【人類基因組計(jì)劃】
人類基因組計(jì)劃(human genome project, HGP)是由美國(guó)科學(xué)家于1985年率先提出，于1990年正式啟動(dòng)的。美國(guó)、英國(guó)、法蘭西共和國(guó)、德意志聯(lián)邦共和國(guó)、日本國(guó)和我國(guó)科學(xué)家共同參與了這一價(jià)值達(dá)30億美元的人類基因組計(jì)劃。這一計(jì)劃旨在為30多億個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成的人類基因組精確測(cè)序，發(fā)現(xiàn)所有人類基因并搞清其在染色體上的位置，破譯人類全部遺傳信息。與曼哈頓原子彈計(jì)劃和阿波羅登月計(jì)劃并稱為三大科學(xué)計(jì)劃。
2000年6月26日，參加人類基因組工程項(xiàng)目的美國(guó)、英國(guó)、法蘭西共和國(guó)、德意志聯(lián)邦共和國(guó)、日本國(guó)國(guó)和中國(guó)的6國(guó)科學(xué)家共同宣布，人類基因組草圖的繪制工作已經(jīng)完成。最終完成圖要求測(cè)序所用的克隆能忠實(shí)地代表常染色體的基因組結(jié)構(gòu)，序列錯(cuò)誤率低于萬(wàn)分之一。 95%常染色質(zhì)區(qū)域被測(cè)序，每個(gè)Gap小于150kb。完成圖將于2003年完成，比預(yù)計(jì)提前2年。
美國(guó)和英國(guó)科學(xué)家2006年5月18日在英國(guó)《自然》雜志網(wǎng)絡(luò)版上發(fā)表了人類最后一個(gè)染色體——1號(hào)染色體的基因測(cè)序。
在人體全部22對(duì)常染色體中，1號(hào)染色體包含基因數(shù)量最多，達(dá)3141個(gè)，是平均水平的兩倍，共有超過(guò)2.23億個(gè)堿基對(duì)，破譯難度也最大。一個(gè)由150名英國(guó)和美國(guó)科學(xué)家組成的團(tuán)隊(duì)歷時(shí)10年，才完成了1號(hào)染色體的測(cè)序工作。
科學(xué)家不止一次宣布人類基因組計(jì)劃完工，但推出的均不是全本，這一次殺青的“生命之書”更為精確，覆蓋了人類基因組的99．99％。解讀人體基因密碼的“生命之書”宣告完成，歷時(shí)16年的人類基因組計(jì)劃書寫完了最后一個(gè)章節(jié)。
【“垃圾DNA”】
酵母和蠕蟲之類的簡(jiǎn)單生物是如何進(jìn)化為鳥和哺乳動(dòng)物這樣的復(fù)雜生物的呢？一項(xiàng)針對(duì)基因組進(jìn)行的廣泛比較研究顯示，問(wèn)題的答案可能就隱藏在生物的垃圾脫氧核糖核酸（DNA）中。美國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，生物越復(fù)雜，其攜帶的垃圾DNA就越多，而恰恰是這些沒(méi)有編碼的“無(wú)用”DNA幫助高等生物進(jìn)化出了復(fù)雜的機(jī)體。
自從第一個(gè)真核生物——包括從酵母到人類的有細(xì)胞核的生物——的基因組被破譯以來(lái)，科學(xué)家一直想知道，為什么生物的大多數(shù)DNA并沒(méi)有形成有用的基因。從突變保護(hù)到染色體的結(jié)構(gòu)支撐，對(duì)于這種所謂的垃圾DNA的可能解釋有許多種。但是去年從人類、小鼠和大鼠身上得到的完全一致的關(guān)于垃圾DNA的研究結(jié)果卻表明，在這一區(qū)域中可能包含有重要的調(diào)節(jié)機(jī)制，從而能夠控制基礎(chǔ)的生物化學(xué)反應(yīng)和發(fā)育進(jìn)程，這將幫助生物進(jìn)化出更為復(fù)雜的機(jī)體。與簡(jiǎn)單的真核生物相比，復(fù)雜生物有更多的基因不會(huì)發(fā)生突變的事實(shí)無(wú)疑極大地強(qiáng)化了這一發(fā)現(xiàn)。
為了對(duì)這一問(wèn)題有更深的了解，由美國(guó)加利福尼亞大學(xué)圣塔克魯斯分校(UCSC)的計(jì)算生物學(xué)家David Haussler領(lǐng)導(dǎo)的一個(gè)研究小組，對(duì)5種脊椎動(dòng)物——人、小鼠、大鼠、雞和河豚——的垃圾DNA序列與4種昆蟲、兩種蠕蟲和7種酵母的垃圾DNA序列進(jìn)行了比較。研究人員從對(duì)比結(jié)果中得到了一個(gè)驚人的模式：生物越復(fù)雜，垃圾DNA似乎就越重要。
這其中暗含的可能性在于，如果不同種類的生物具有相同的DNA，那么這些DNA必定是用來(lái)解決一些關(guān)鍵性的問(wèn)題的。酵母與脊椎動(dòng)物共享了一定數(shù)量的DNA，畢竟它們都需要制造蛋白質(zhì)，但是只有15%的共有DNA與基因無(wú)關(guān)。研究小組在7月14日的《基因組研究》雜志網(wǎng)絡(luò)版上報(bào)告說(shuō)，他們將酵母與更為復(fù)雜的蠕蟲進(jìn)行了比較，后者是一種多細(xì)胞生物，發(fā)現(xiàn)有40%的共有DNA沒(méi)有被編碼。隨后，研究人員又將脊椎動(dòng)物與昆蟲進(jìn)行了對(duì)比，這些生物比蠕蟲更為復(fù)雜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有超過(guò)66%的共有DNA包含有沒(méi)有編碼的DNA。
參與該項(xiàng)研究工作的UCSC計(jì)算生物學(xué)家Adam Siepel指出，有關(guān)蠕蟲的研究結(jié)果需要慎重對(duì)待，這是由于科學(xué)家僅僅對(duì)其中的兩個(gè)基因組進(jìn)行了分析。盡管如此，Siepel還是認(rèn)為，這一發(fā)現(xiàn)有力地支持了這樣一種理論，即脊椎動(dòng)物和昆蟲的生物復(fù)雜性的增加主要是由于基因調(diào)節(jié)的精細(xì)模式。
【DNA探針】
DNA探針是最常用的核酸探針，指長(zhǎng)度在幾百堿基對(duì)以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針?，F(xiàn)已獲得DNA探針數(shù)量很多，有細(xì)菌、病毒、原蟲、真菌、動(dòng)物和人類細(xì)胞DNA探針。這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。這些DNA片段須是特異的，如細(xì)菌的毒力因子基因探針和人類Alu探針。這些DNA探針的獲得有賴于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。以細(xì)菌為例，目前分子雜交技術(shù)用于細(xì)菌的分類和菌種鑒定比之G+C百分比值要準(zhǔn)確的多，是細(xì)菌分類學(xué)的一個(gè)發(fā)展方向。加之分子雜交技術(shù)的高敏感性，分子雜交在臨床微生物診斷上具有廣闊的前景。細(xì)菌的基因組大小約5×106bp，約含3000個(gè)基因。各種細(xì)菌之間絕大部分DNA是相同的，要獲得某細(xì)菌特異的核酸探針，通常要采取建立細(xì)菌基因組DNA文庫(kù)的辦法，即將細(xì)菌DNA切成小片段后分別克隆得到包含基因組的全信息的克隆庫(kù)。然后用多種其它菌種的DNA作探針來(lái)篩選，產(chǎn)生雜交信號(hào)的克隆被剔除，最后剩下的不與任何其它細(xì)菌雜交的克隆則可能含有該細(xì)菌特異性DNA片段。將此重組質(zhì)粒標(biāo)記后作探針進(jìn)一步鑒定，亦可經(jīng)DNA序列分析鑒定其基因來(lái)源和功能。因此要得到一種特異性DNA探針，常常是比較繁瑣的。探針DNA克隆的篩選也可采用血清學(xué)方法，所不同的是所建DNA文庫(kù)為可表達(dá)性，克隆菌落或噬斑經(jīng)裂解后釋放出表達(dá)抗原，然后用來(lái)源細(xì)菌的多克隆抗血清篩選陽(yáng)性克隆，所得到多個(gè)陽(yáng)性克隆再經(jīng)其它細(xì)菌的抗血清篩選，最后只與本細(xì)菌抗血清反應(yīng)的表達(dá)克隆即含有此細(xì)菌的特異性基因片段，它所編碼的蛋白是該菌種所特有的。用這種表達(dá)文庫(kù)篩選得到的顯然只是特定基因探針。
【DNA修復(fù)】
DNA修復(fù)（DNA repairing）是細(xì)胞對(duì)DNA受損傷后的一種反應(yīng)，這種反應(yīng)可能使DNA結(jié)構(gòu)恢復(fù)原樣，重新能執(zhí)行它原來(lái)的功能；但有時(shí)并非能完全消除DNA的損傷，只是使細(xì)胞能夠耐受這DNA的損傷而能繼續(xù)生存。也許這未能完全修復(fù)而存留下來(lái)的損傷會(huì)在適合的條件下顯示出來(lái)（如細(xì)胞的癌變等），但如果細(xì)胞不具備這修復(fù)功能，就無(wú)法對(duì)付經(jīng)常在發(fā)生的DNA損傷事件，就不能生存。所以研究DNA修復(fù)也是探索生命的一個(gè)重要方面，而且與軍事醫(yī)學(xué)、腫瘤學(xué)等密切相關(guān)。對(duì)不同的DNA損傷，細(xì)胞可以有不同的修復(fù)反應(yīng)。
DNA含有A、C、G、T四種堿基，通常情況下A——T，C——G組合堿基對(duì)構(gòu)成DNA鏈的橫檔?；蚓褪峭ㄟ^(guò)解讀DNA中這些堿基排列順序來(lái)傳達(dá)給細(xì)胞指令，控制細(xì)胞工作。
很多因素會(huì)引起DNA鏈斷裂，DNA鏈在重組中堿基要重新排列，導(dǎo)致基因解讀的堿基排列和原來(lái)不同，發(fā)出錯(cuò)誤指令，造成細(xì)胞錯(cuò)誤的生長(zhǎng)及工作狀態(tài)，因此發(fā)生了細(xì)胞變異，也就會(huì)產(chǎn)生了腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞會(huì)吸收大量的人體養(yǎng)份或正常細(xì)胞而快速成長(zhǎng)，因此腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞要大的多，細(xì)胞核比正常大1-5倍，并且多發(fā)生畸形等情況。同時(shí)腫瘤DNA鏈在同樣的情況也會(huì)發(fā)生斷裂，因?yàn)镈NA具有自身修復(fù)和半保留復(fù)制的功能，DNA連接酶可將DNA片段再次連接起來(lái)，在旋轉(zhuǎn)酶的作用下重新形成螺旋狀。并且一小段DNA就可遺傳腫瘤細(xì)胞的特性生成新的腫瘤細(xì)胞?，F(xiàn)在科學(xué)家常常提到的克隆，就是利用了DNA的這一特性。所以大部分情況下腫瘤DNA鏈的重組是一變二或一變多的過(guò)程，這就形成腫瘤細(xì)胞的復(fù)制和繁殖，由此就造成腫瘤的擴(kuò)大、擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移及惡化，最終威脅人類的健康和生命。
【單鏈DNA】
單鏈DNA（single－stranded DNA）大部分DNA以雙螺旋結(jié)構(gòu)存在，但一經(jīng)熱或堿處理就會(huì)變?yōu)閱捂湢顟B(tài)。單鏈DNA就是指以這種狀態(tài)存在的DNA。單鏈DNA在分子流體力學(xué)性質(zhì)、吸收光譜、堿基反應(yīng)性質(zhì)等方面都和雙鏈DNA不同。某些噬菌體粒子內(nèi)含有單鏈環(huán)狀的DNA，這樣的噬菌體DNA在細(xì)胞內(nèi)增殖時(shí)則形成雙鏈DNA。
【閉環(huán)DNA】
閉環(huán)DNA（closed circular DNA）沒(méi)有斷口的雙鏈環(huán)狀DNA，亦稱為超螺旋DNA。由于具有螺旋結(jié)構(gòu)的雙鏈各自閉合，結(jié)果使整個(gè)DNA分子進(jìn)一步旋曲而形成三級(jí)結(jié)構(gòu)。另外如果一條或二條鏈的不同部位上產(chǎn)生一個(gè)斷口，就會(huì)成為無(wú)旋曲的開環(huán)DNA分子。從細(xì)胞中提取出來(lái)的質(zhì)?；虿《綝NA都含有閉環(huán)和開環(huán)這二種分子?？筛鶕?jù)兩者與色素結(jié)合能力的不同，而將兩者分離開來(lái)。
【連接DNA】
連接DNA (Linker DNA)：核小體中除146bp核心DNA 外的所有DNA。
【模板DNA】
模板DNA可以是單鏈分子,也可以是雙鏈分子,可以是線狀分子,也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴(kuò)增效果稍好).就模板DNA而言,影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度。
【互補(bǔ)DNA】
互補(bǔ)DNA（cDNA, complementary DNA ）構(gòu)成基因的雙鏈DNA分子用一條單鏈作為模板，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生與其序列互補(bǔ)的信使RNA分子,然后在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下,以mRNA分子為模板,合成一條與mRNA序列互補(bǔ)的單鏈DNA,最后再以單鏈DNA為模板合成另一條與其互補(bǔ)的單鏈DNA,兩條互補(bǔ)的單鏈DNA分子組成一個(gè)雙鏈cDNA分子.因此,雙鏈cDNA分子的序列同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA分子的基因是相同的.所以一個(gè)cDNA分子就代表一個(gè)基因.但是cDNA仍不同于基因,因?yàn)榛蛟谵D(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA時(shí),一些不編碼的序列即內(nèi)含子被刪除了,保留的只是編碼序列,即外顯子.所以cDNA序列都比基因序列要短得多,因?yàn)閏DNA中不包括基因的非編碼序列---內(nèi)含子。
【DNA限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析】
在人類基因組中，平均約200對(duì)堿基可發(fā)生一對(duì)變異（稱為中性突變），中性突變導(dǎo)致個(gè)體間核苷酸序列的差異，稱為DNA多態(tài)性。不少DNA多態(tài)性發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上，酶解該DNA片段就會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的片斷，稱為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)。RFLR按孟德爾方式遺傳，在某一特定家族中，如果某一致病基因與特異的多態(tài)性片斷緊密連鎖，就可用這一多態(tài)性片段為一種“遺傳標(biāo)志”，來(lái)判斷家庭成員或胎兒是否為致病基因的攜帶者。甲型血友病、囊性纖維病變和苯丙酮尿癥等均可借助這一方法得到診斷。
核酸分解的第一步是水解核苷酸之間的磷酸二酯鍵，在高等動(dòng)植物中都有作用于磷酸二酯鍵的核酸酶。不同來(lái)源的核酸酶，其專一性、作用方式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，稱為核糖核酸酶（RNase），有些核酸酶只能作用于DNA，稱為脫氧核糖核酸酶（DNase），有些核酸酶專一性較低，既能作用于RNA也能作用于DNA，因此統(tǒng)稱為核酸酶（nuclease）。根據(jù)核酸酶作用的位置不同，又可將核酸酶分為核酸外切酶（exonuclease）和核酸內(nèi)切酶（endonuclease）。
一、核酸外切酶
有些核酸酶能從DNA或RNA鏈的一端逐個(gè)水解下單核苷酸，所以稱為核酸外切酶。只作用于DNA的核酸外切酶稱為脫氧核糖核酸外切酶，只作用于RNA的核酸外切酶稱為核糖核酸外切酶；也有一些核酸外切酶可以作用于DNA或RNA。核酸外切酶從3′端開始逐個(gè)水解核苷酸，稱為3′→5′外切酶，例如，蛇毒磷酸二酯酶即是一種3′→5′外切酶，水解產(chǎn)物為5′核苷酸；核酸外切酶從5′端開始逐個(gè)水解核苷酸，稱為5′→3′外切酶，例如：牛脾磷酸二酯酶即是一種5′→3′外切酶，水解產(chǎn)物為3′核苷酸。
二、核酸內(nèi)切酶
核酸內(nèi)切酶催化水解多核苷酸內(nèi)部的磷酸二酯鍵。有些核酸內(nèi)切酶僅水解5′磷酸二酯鍵，把磷酸基團(tuán)留在3′位置上，稱為5′-內(nèi)切酶；而有些僅水解3′-磷酸二酯鍵，把磷酸基團(tuán)留在5′位置上，稱為3′-內(nèi)切酶。還有一些核酸內(nèi)切酶對(duì)磷酸酯鍵一側(cè)的堿基有專一要求，例如胰臟核糖核酸酶（RNaseA）即是一種高度專一性核酸內(nèi)切酶，它作用于嘧啶核苷酸的C′3上的磷酸根和相鄰核苷酸的C′5之間的鍵，產(chǎn)物為3′嘧啶單核苷酸或以3′嘧啶核苷酸結(jié)尾的低聚核苷酸
20世紀(jì)70年代，在細(xì)菌中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一類核酸內(nèi)切酶，能專一性地識(shí)別并水解雙鏈DNA上的特異核苷酸順序，稱為限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease，簡(jiǎn)稱限制酶）。當(dāng)外源DNA侵入細(xì)菌后，限制性內(nèi)切酶可將其水解切成片段，從而限制了外源DNA在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，而細(xì)菌本身的DNA由于在該特異核苷酸順序處被甲基化酶修飾，不被水解，從而得到保護(hù)。
近年來(lái)，限制性核酸內(nèi)切酶的研究和應(yīng)用發(fā)展很快，目前已提純的限制性核酸內(nèi)切酶有100多種，許多已成為基因工程研究中必不可少的工具酶。
限制性核酸內(nèi)切酶可被分成三種類型。Ⅰ型和Ⅲ型限制酶水解DNA需要消耗ATP，全酶中的部分亞基有通過(guò)在特殊堿基上補(bǔ)加甲基基團(tuán)對(duì)DNA進(jìn)行化學(xué)修飾的活性。
Ⅰ型和Ⅲ型酶具有限制和修飾兩種作用，而特異性弱，切割位點(diǎn)的序列不固定，不已知，不宜用于基因克隆中。
?、蛐拖拗泼杆釪NA不需要ATP也不以甲基化或其它方式修飾DNA，能在所識(shí)別的特殊核苷酸順序內(nèi)或附近切割DNA。因此，被廣泛用于DNA分子克隆和序列測(cè)定。
LNA-Locked Nucleic Acid 一種類寡核苷酸衍生物，結(jié)構(gòu)中β-D-呋喃核糖的2'-O、
4’-C位通過(guò)縮水作用形成剛性的結(jié)構(gòu)。LNA核苷酸包括A,C,G,T,U,mC六種堿基.
鎖核酸（Locked nucleic acid，LNA）是一種經(jīng)過(guò)修飾的RNA，LNA中一部分核糖上的2'與4'碳連結(jié)在一起。一般可見于A-DNA或RNA。
這類核酸可以增加引子或探針（probe）的融解溫度（Tm值），加強(qiáng)這些實(shí)驗(yàn)用物質(zhì)的穩(wěn)定性，可應(yīng)用在即時(shí)聚合酶連鎖反應(yīng)（real-time PCR）等技術(shù)中。
鎖核酸(locked nucleic acid,LNA)作為一種新穎的核苷酸衍生物在藥學(xué)研究領(lǐng)域引起了人們的廣泛關(guān)注,有希望成為分子水平治療各種疾病的新突破口.它是一種特殊的雙環(huán)狀核苷酸衍生物,結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)或多個(gè)2 ′-O,4′-C-亞甲基-β-D-呋喃核糖核酸單體,核糖的2′-O位和4′-C位通過(guò)不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋,并連接成環(huán)形,這個(gè)環(huán)形橋鎖定了呋喃糖C3′-內(nèi)型的N構(gòu)型,降低了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性,增加了磷酸鹽骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性.由于LNA與DNA/RNA在結(jié)構(gòu)上具有相同的磷酸鹽骨架,故其對(duì)DNA、RNA有很好的識(shí)別能力和強(qiáng)大的親和力.與其他寡核苷酸類似物相比,LNA有很多優(yōu)點(diǎn):a.和DNA、RNA互補(bǔ)的雙鏈有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性(ΔTm=3～8℃);b.抗3′脫氧核苷酸酶降解的穩(wěn)定性;c.LNA-DNA雜交物能激活RNase H;d.水溶性好,自由穿入細(xì)胞膜,易被機(jī)體吸收;e.體內(nèi)無(wú)毒性作用;f.高效的自動(dòng)寡聚化作用,合成方法相對(duì)簡(jiǎn)單,部分或完全修飾的LNA寡核酸鏈可用氨基磷酸法在DNA自動(dòng)合成儀上合成。
反義RNA是指與靶RNA(多為mRNA)具有互補(bǔ)序列的RNA分子,通過(guò)與靶RNA進(jìn)行堿基配對(duì)結(jié)合的方式.參與基因的表達(dá)調(diào)控.
詳細(xì)：反義核酸是指能與特定mRNA精確互補(bǔ)、特異阻斷其翻譯的RNA或DNA分子。利用反義核酸特異地封閉某些基因表達(dá)，使之低表達(dá)或不表達(dá)，這種技術(shù)即為反義核酸技術(shù)[1-3]。它包括反義RNA、反義DNA和核酶(ribozymes)三大技術(shù)。反義核酶作為一種基因下向調(diào)節(jié)作用因子，在抑制一些有害基因的表達(dá)和失控基因的過(guò)度表達(dá)上發(fā)揮著重要作用。隨著反義核酶技術(shù)的發(fā)展和成熟，已逐漸應(yīng)用于抗某些人體寄生蟲病的研究。本文擬就反義核酸技術(shù)的作用原理和特點(diǎn)作一簡(jiǎn)要概述，著重闡述其在寄生蟲領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)展。
反義核酸的作用原理
反義核酸目前有三種來(lái)源：一是利用固相亞磷酰胺法人工合成的短小反義寡聚核苷酸(antisense oligodeoxyncleotides，AON)，這是反義核酸最普遍的應(yīng)用方式，包括未修飾AON和硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(PO)和甲基化等修飾AON二類，其中以PSAON應(yīng)用最廣泛。ANO設(shè)計(jì)合成簡(jiǎn)單，只要其順序與靶mRNA部分順序互補(bǔ)即可，而對(duì)基因的讀碼框無(wú)要求；二是更具有實(shí)用價(jià)值的工人表達(dá)載體，包括單個(gè)基因和多個(gè)基因的聯(lián)合反義表達(dá)載體[3]，它是利用基因重組技術(shù)將靶基因序列反向持插入到載體的啟動(dòng)子和終止子之間，通過(guò)轉(zhuǎn)錄可源源不斷產(chǎn)生反義RNA分子；三是天然存在的反義核酸分子，但目前分離純化尚存在困難。
反義RNA和反義DNA
反義RNA是指能和mRNA完全互補(bǔ)的一段小分子RNA或寡聚核苷酸片段，反義DNA是指能與基因DNA雙鏈中的有義鏈互補(bǔ)結(jié)合的短小DNA分子。反義RNA和反義DNA主要是通過(guò)mRNA的翻譯和基因DNA的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用[10]：1)抑制翻譯。反義核酸一方面通過(guò)與靶mRNA結(jié)合形成空間位阻效應(yīng)，阻止核糖體與mRNA結(jié)合，另一方面其與mRNA結(jié)合后激活內(nèi)源性RNase或ribozyme，降解mRNA[3]；2)抑制轉(zhuǎn)錄。反義DNA與基因DNA雙螺旋的調(diào)控區(qū)特異結(jié)合形成DNA三聚體(triplex),或與DNA編碼區(qū)結(jié)合，終止正在轉(zhuǎn)錄的mRNA鏈延長(zhǎng)[3]。此外，反義核酸還可抑制轉(zhuǎn)錄后mRNA的加工修飾，如5'端加帽、3'端加尾(poly a)、中間剪接和內(nèi)部堿基甲基化等，并阻止成熟mRNA由細(xì)胞核向細(xì)胞漿內(nèi)運(yùn)輸。
核酶
Cech等發(fā)現(xiàn)四膜蟲核糖體RNA前體在成熟過(guò)程中，可精確地自我切除某些片段并重新連接，這種具有酶催化活性的RNA稱之為核酶。
核酶廣泛存在于生物細(xì)胞中，有錘頭狀和發(fā)夾二種結(jié)構(gòu)。酶活性中心由兩個(gè)臂和中間的功能區(qū)組成[13]。兩個(gè)臂序列高度保守，與靶RNA特異互補(bǔ)結(jié)合，相當(dāng)于一種反義RNA，而功能區(qū)則可通過(guò)降解RNA的磷酸二酯鍵而分解消化靶RNA，而核酶本身在作用過(guò)程中并不消耗。核酶裂解分子依賴嚴(yán)格的空間結(jié)構(gòu)形成，裂解部位總是位于靶RNA分子中GUX三聯(lián)體(X：C、U、A)下游方向即3'端。
核酶除天然存在外，也可人工合成。根據(jù)核酶的作用位點(diǎn)、靶mRNA周圍的序列和核酶本身高度保守序列，可方便地人工設(shè)計(jì)合成核酶的特異性序列。此外，利用基因工程將核酶的編碼基因克隆在SP6或T7等啟動(dòng)子下游，通過(guò)轉(zhuǎn)錄合所需核酶。核酶能特異切割RNAA分子，使阻斷基因表達(dá)，特別是阻斷有害基因的表達(dá)成為可能。如果已知靶mRNA中GUX三聯(lián)體的位置，可將核酶的編碼基因插入反義表達(dá)載體的適當(dāng)位置，這樣轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的含有核酶的反義RNA具有雙重功能：一方面具有反義抑制作用，另一方面具有切割靶mRNA的催化作用。核酶在抗腫瘤、抗病毒方面具有十分誘人的前景，第一個(gè)應(yīng)用核酶進(jìn)行艾滋病基因治療的臨床計(jì)劃已獲準(zhǔn)，核酶作為一種遺傳信息藥物，在腫瘤基因治療中必將日益受到重視。
反義核酸的作用特點(diǎn)
反義核酸作為基因治療藥物之一，與傳統(tǒng)藥物相比具有諸多優(yōu)點(diǎn)。1)高度特異性：反義核酸藥物通過(guò)特異的堿基互補(bǔ)配對(duì)作用于靶RNA或DNA，猶如“生物導(dǎo)彈”。2)高生物活性、豐富的信息量；反義核酸是一種攜帶特定遺傳信息的信息體，堿基排列順序可千變?nèi)f化，不可窮盡。3)高效性：直接阻止疾病基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。4)最優(yōu)化的藥物設(shè)計(jì)：反義核酸技術(shù)從本質(zhì)上是應(yīng)用基因的天然順序信息，實(shí)際上是最合理的藥物設(shè)計(jì)。5)低毒、安全：反義核酸尚未發(fā)現(xiàn)其有顯著毒性，盡管其在生物體內(nèi)的存留時(shí)間有長(zhǎng)有短，但最終都將被降解消除，這避免了如轉(zhuǎn)基因療法中外源基因整合到宿主染色體上的危險(xiǎn)性。
化學(xué)及生物學(xué)意義上的探針(probe)，是指與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子?？贵w-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生長(zhǎng)因子-受體的相互作用都可以看作是探針與靶分子的相互作用。
核酸探針技術(shù)原理是堿基配對(duì)?；パa(bǔ)的兩條核酸單鏈通過(guò)退火形成雙鏈，這一過(guò)程稱為核酸雜交。核酸探針是指帶有標(biāo)記物的已知序列的核酸片段，它能和與其互補(bǔ)的核酸序列雜交，形成雙鏈，所以可用于待測(cè)核酸樣品中特定基因序列的檢測(cè)。每一種病原體都具有獨(dú)特的核酸片段，通過(guò)分離和標(biāo)記這些片段就可制備出探針，用于疾病的診斷等研究。
(一) 核酸探針的種類
1.按來(lái)源及性質(zhì)劃分 可將核酸探針?lè)譃榛蚪MDNA探針、cDNA探針、RNA探針和人工合成的寡核苷酸探針等幾類。
作為診斷試劑，較常使用的是基因組DNA探針和cDNA探針。其中，前者應(yīng)用最為廣泛，它的制備可通過(guò)酶切或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從基因組中獲得特異的DNA后將其克隆到質(zhì)?；蚴删w載體中，隨著質(zhì)粒的復(fù)制或噬菌體的增殖而獲得大量高純度的DNA探針。將 RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所獲得的產(chǎn)物即為cDNA。cDNA探針適用于RNA病毒的檢測(cè)。cDNA探針序列也可克隆到質(zhì)?；蚴删w中，以便大量制備。
將信息RNA(mRNA)標(biāo)記也可作為核酸分子雜交的探針。但由于來(lái)源極不方便，且RNA極易被環(huán)境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此應(yīng)用較少。
用人工合成的寡聚核苷酸片段做為核酸雜交探針應(yīng)用十分廣泛，可根據(jù)需要隨心所欲合成相應(yīng)的序列，可合成僅有幾十個(gè)bp的探針序列，對(duì)于檢測(cè)點(diǎn)突變和小段堿基的缺失或插入尤為適用
2.按標(biāo)記物劃分 有放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針兩大類。放射性標(biāo)記探針用放射性同位素做為標(biāo)記物。放射性同位素是最早使用，也是目前應(yīng)用最廣泛的探針標(biāo)記物。常用的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P應(yīng)用最普遍。放射性標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，可以檢測(cè)到Pg級(jí)；缺點(diǎn)是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不穩(wěn)定、成本高等。因此，放射性標(biāo)記的探針不能實(shí)現(xiàn)商品化。目前，許多實(shí)驗(yàn)室都致力于發(fā)展非放射性標(biāo)記的探針。
目前應(yīng)用較多的非放射性標(biāo)記物是生物素(Biotin)和地高辛(digoxigenin)。二者都是半抗原。生物素是一種小分子水溶性維生素，對(duì)親和素有獨(dú)特的親和力，兩者能形成穩(wěn)定的復(fù)合物，通過(guò)連接在親和素或抗生物素蛋白上的顯色物質(zhì)(如酶、熒光素等)進(jìn)行檢測(cè)。地高辛是一種類固醇半抗原分子，可利用其抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)，原理類似于生物素的檢測(cè)。地高辛標(biāo)記核酸探針的檢測(cè)靈敏度可與放射性同位素標(biāo)記的相當(dāng)，而特異性優(yōu)于生物素標(biāo)記，其應(yīng)用日趨廣泛。
(二) 核酸探針的標(biāo)記
1.放射性同位素標(biāo)記法 常將放射性同位素如32 P連接到某種脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)上做為標(biāo)記物，然后通過(guò)切口平移法標(biāo)記探針。
切口平移法(nick translation)是利用大腸桿菌DNA聚合酶I (E.coli DNA polymerase I) 的多種酶促活性將標(biāo)記的dNTP摻入到新形成的DNA鏈中去，形成均勻標(biāo)記的高比活DNA探針。其操作方法如下：
(1) 取1?g DNA溶于少量無(wú)菌雙蒸水中，加入5?l距離大約10×切口平移緩沖液 ( 0.5mol/L Tris－HCl，PH7.2；0.1 mol/L MgSO4 ；1mmol/L二硫蘇糖醇；500?g/mL牛血清白蛋白)，加入除標(biāo)記物(如?-32 p-dATP)外的其它三種dNTP(如dCTP，dGTP，dTTP)溶液，20mmol/L溶液各1?l。
(2) 加入100?ci(10?l)標(biāo)記物溶液，加入無(wú)菌雙蒸水至終體積為46.5?l,混勻，加入0.5?l稀釋的DNaseI溶液，混勻；加入1?l(約5單位)E.coli DNA polymerase I，混勻。
(3) 置14-16℃反應(yīng)1-2小時(shí)。
2.非放射性標(biāo)記法 可將生物素、地高辛連接在dNTP上，然后象放射性標(biāo)記一樣用酶促聚合法摻入到核酸鏈中制備標(biāo)記探針。也可讓生物素、地高辛等直接與核酸進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)而連接上核酸鏈。其中，生物素的光化學(xué)標(biāo)記法較為常用。其原理是利用能被可見光激活的生物素衍生物-光敏生物素(photobiotin)，光敏生物素與核酸探針混合后，在強(qiáng)的可見光照射下，可與核酸共價(jià)相連，形成生物素標(biāo)記的核酸探針?？蛇m用于單、雙鏈DNA及RNA的標(biāo)記，探針可在-20℃下保存8-10個(gè)月以上。具體操作方法如下：
(1) 將雙鏈DNA變性或用NaOH處理形成缺口，單鏈DNA或RNA毋需處理，將核酸樣品溶于水。
(2) 暗室下在微量離心管中加入10?g DNA，1mg/ml光敏生物素20?l，加水至50?l，混勻。
(3) 冰浴中打開離心管蓋，在300-500瓦燈下照射10分鐘(液面距燈泡10cm)。
(4) 加入100?l 0.1mol/L Tris－HCl，pH8.0，加入100?l 2-丁醇抽提兩次，離心，棄上層。
(5) 乙醇沉淀核酸探針；用70％乙醇漂洗真空抽干，備用。
除上述標(biāo)記法外，探針的制備和標(biāo)記還可通過(guò)PCR反應(yīng)直接完成。
(三) 核酸雜交 雜交技術(shù)有固相雜交和液相雜交之分。固相雜交技術(shù)目前較為常用，先將待測(cè)核酸結(jié)合到一定的固相支持物上，再與液相中的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。固相支持物常用硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，簡(jiǎn)稱NC膜)或尼龍膜(nylon membrane)。
固相雜交包括膜上印跡雜交和原位雜交。前者包括三個(gè)基本過(guò)程：第一，通過(guò)印跡技術(shù)將核酸片段轉(zhuǎn)移到固相支持物上；第二，用標(biāo)記探針與支持物上的核酸片段進(jìn)行雜交；第三，雜交信號(hào)的檢測(cè)。
用探針對(duì)細(xì)胞或組織切片中的核酸雜交并進(jìn)行檢測(cè)的方法稱之為核酸原位雜交。某特點(diǎn)是靶分子固定在細(xì)胞中，細(xì)胞固定在載玻片上，以固定的細(xì)胞代替純化的核酸，然后將載玻片浸入溶有探針的溶液里，探針進(jìn)入組織細(xì)胞與靶分子雜交，而靶分子仍固定在細(xì)胞內(nèi)。例如。可用特異性的細(xì)菌、病毒的核酸做為探針對(duì)組織、細(xì)胞進(jìn)行原位雜交，以確定有無(wú)該病原體的感染等。原位雜交不需從組織中提取核酸，對(duì)于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，在臨床應(yīng)用上有獨(dú)特的意義。
近年來(lái)液相雜交技術(shù)有所發(fā)展。液相雜交與固相雜交的主要區(qū)別是不用純化或固定的靶分子，探針與靶序列直接在溶液里作用。液相雜交步驟有所簡(jiǎn)化，雜交速度有所提高，增加了特異性和敏感性，但與臨床診斷所要求的特異性和敏感性還有一定的距離。
各種雜交技術(shù)中，膜上印跡雜交技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，它由以下三個(gè)基本過(guò)程組成。
1.核酸印跡技術(shù)
(1) 斑點(diǎn)印跡(Dot-blot) 將待測(cè)核酸樣品變性后直接點(diǎn)樣在膜上，稱之為斑點(diǎn)印跡。為使核酸牢固結(jié)合在膜上，通常還將點(diǎn)樣后的膜進(jìn)行80℃真空烘烤2h。
應(yīng)用斑點(diǎn)印跡技術(shù)，可在一張膜上同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便、快速，在臨床診斷中應(yīng)用較廣。適合進(jìn)行特定基因的定性及定量研究，但不能鑒定所測(cè)基因的分子量。
(2) Southern印跡(Southern blot) 這是指將DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過(guò)程。
常規(guī)處理如下，先用限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA樣品進(jìn)行酶切處理，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳將所得DNA片段按分子量大小分離，接著對(duì)凝膠進(jìn)行變性處理，使雙鏈DNA解離成單鏈，并將其轉(zhuǎn)移到NC膜或其它固相支持物上，轉(zhuǎn)移后各DNA片段的相對(duì)位置保持不變。用探針與經(jīng)Southern印跡處理的DNA樣品雜交，可鑒定待測(cè)DNA的大小、進(jìn)行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)等。
Southern印跡的操作方法有三種：
?、?毛細(xì)管轉(zhuǎn)移(或虹吸印跡)。這是一傳統(tǒng)方法，進(jìn)行毛細(xì)管轉(zhuǎn)移時(shí)，DNA片段由液流攜帶從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物表面。安放裝置時(shí)，在轉(zhuǎn)移槽中央的平臺(tái)上由下到上依次疊放變性凝膠、濾膜、一疊干的吸水紙巾；凝膠與轉(zhuǎn)移緩沖液通過(guò)一紙橋連接；濾膜上的紙巾吸水而產(chǎn)生并維持毛細(xì)管作用，液體由于毛細(xì)管作用抽吸通過(guò)凝膠，并將DNA片段攜帶聚集在濾膜上。DNA片段的大小和瓊脂的濃度決定了轉(zhuǎn)移的速度。小片段DNA(＜1kb)在1小時(shí)內(nèi)可從 0.7％瓊脂糖凝膠上幾乎定量轉(zhuǎn)移，而大片段DNA的轉(zhuǎn)移較慢且效率較低，如大于15kb的 DNA片段需要18小時(shí)而轉(zhuǎn)移尚不完全。
② 電轉(zhuǎn)移。利用電場(chǎng)的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上，可達(dá)到簡(jiǎn)單、迅速、高效的目的。一般2-3小時(shí)內(nèi)可轉(zhuǎn)移完畢。電轉(zhuǎn)法不宜采用NC膜，因?yàn)镹C膜結(jié)合 DNA依賴高鹽溶液，而高鹽溶液在電泳過(guò)程中會(huì)破壞緩沖體系，使DNA損傷。一般使用化學(xué)活化膜和正電荷修飾的尼龍膜。此外，電轉(zhuǎn)過(guò)程中轉(zhuǎn)移體系的溫度升高，必須使用循環(huán)冷卻水。商業(yè)化的電轉(zhuǎn)儀一般附有冷卻設(shè)備，也可在冷室中進(jìn)行。具體操作時(shí)，按儀器使用說(shuō)明安裝電轉(zhuǎn)裝置，將變性凝膠夾在轉(zhuǎn)移膜內(nèi)平行電極內(nèi)側(cè)的多孔板之間，排除夾層間氣泡，加入轉(zhuǎn)移緩沖液并通電進(jìn)行電轉(zhuǎn)。
?、?真空印跡法 這是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種簡(jiǎn)單、快速、高效的DNA和RNA印跡法。其基本原理是利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從凝膠上層的容器抽到下層，凝膠中的核酸片段將隨緩沖液移置到凝膠下面的固相支持物上。這一方法的最大優(yōu)點(diǎn)是快速高效，可在轉(zhuǎn)膜的同時(shí)進(jìn)行DNA的變性與中和，30分鐘至1小時(shí)可完成，適合檢疫工作的要求。已有商業(yè)化的真空轉(zhuǎn)移儀提供，可按商品使用說(shuō)明進(jìn)行操作。
Southern印跡后的濾膜仍需進(jìn)行固定處理，對(duì)NC膜可用80℃真空烘烤2小時(shí)，對(duì)尼龍膜還可用短波紫外線(波長(zhǎng)254nm)照射幾分鐘。
(3) Northern印跡(Northern blot) Northern印跡是指將RNA片段變性及電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過(guò)程。RNA樣品經(jīng)Northern印跡后進(jìn)行雜交反應(yīng)可鑒定其中特異 mRNA分子的量與大小。
Northern印跡的方法與Southern印跡基本相同，可參照進(jìn)行。但RNA的變性方法與 DNA不同。DNA樣品可先通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行分離，再用堿處理凝膠使DNA變性。而RNA不能用堿變性,因?yàn)閴A會(huì)導(dǎo)致RNA水解。因此，在Northern印跡前，須進(jìn)行RNA變性電泳，在電泳過(guò)程中使RNA解離形成單鏈分布在凝膠上，再進(jìn)行印跡轉(zhuǎn)移。
RNA變性電泳的原理，是用一定劑量的乙二醛-二甲基亞礬，或甲醛和甲基氫氧化汞等處理RNA樣品和凝膠，使雙鏈RNA在電泳過(guò)程中變性而完全解離形成單鏈。
2.雜交反應(yīng)的基本過(guò)程 雜交反應(yīng)包括預(yù)雜交、雜交和漂洗幾步操作。
預(yù)雜交的目的是用非特異性DNA分子(鮭精DNA或小牛胸腺DNA)及其它高分子化合物(Denhart’s溶液)將待測(cè)核酸分子中的非特異性位點(diǎn)封閉，以避免這些位點(diǎn)與探針的非特異性結(jié)合。雜交反應(yīng)是使單鏈核酸探針與固定在膜上的待測(cè)核酸單鏈在一定溫度和條件下進(jìn)行復(fù)性反應(yīng)的過(guò)程。雜交反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)進(jìn)行洗膜處理以洗去非特異性雜交以及未雜交的標(biāo)記探針，以避免干擾特異性雜交信號(hào)的檢測(cè)。膜洗凈后,將繼續(xù)進(jìn)行雜交信號(hào)的檢測(cè)。
(1) 以放射性標(biāo)記探針與固定在NC膜上的核酸進(jìn)行雜交為例，雜交反應(yīng)操作如下：
① 配制所需試劑
SSC溶液(20×)：3mol/L NaCl，0.3mol/L檸檬酸鈉。
Denhardt’s溶液(50×)：聚蔗糖5g，聚乙烯吡咯烷酮5g，牛血清白蛋白(BSA)5g加水至500ml。
預(yù)雜交液：6×SSC，5×Denhardt’s溶液，0.5％SDS，100?g/ml經(jīng)變性或斷裂成片段的鮭精DNA。
?、?將含靶核酸的NC膜漂浮于6×SSC液面，使其由下至上完全濕潤(rùn)，并繼續(xù)浸泡2分鐘。
?、?將濕潤(rùn)NC膜裝入塑料袋中，按0.2ml/cm2的量加入預(yù)雜交液，盡可能擠出氣泡，將袋封口，置68℃水浴1-2小時(shí)或過(guò)夜。
?、?將雙鏈探針做變性處理使成單鏈，即于100℃加熱5分鐘，然后立即置冰浴使驟冷。
?、?從水浴中取出雜交袋，剪去一角，將單鏈探針加入，盡可能將袋內(nèi)空氣擠出去，重新封口，并將雜交袋裝入另一個(gè)干凈的袋內(nèi)，封閉，以防放射性污染。
⑥ 將雜交袋浸入68℃水浴，溫育8-16小時(shí)。
?、?取出雜交袋，剪開，取出濾膜迅速浸泡于大量2×SSC和0.5％SDS中，室溫振蕩5分鐘，勿使濾膜干燥。
?、?將NC膜移入盛有大量2×SSC和0.1％SDS溶液的容器中，室溫漂洗15分鐘。
?、?將NC膜移入一盛有大量0.1×SSC和0.5％SDS溶液的容器中，37℃漂洗30分鐘至1小時(shí)。
?、?將NC膜移入一盛有新配0.1×SSC和0.5％SDS溶液的容器中，68℃漂洗30分鐘至1小時(shí)。
⑾ 取出濾膜，用0.1×SSC室溫稍稍漂洗，然后置濾紙上吸去大部分液體，待做雜交信號(hào)的檢測(cè)。
3雜交信號(hào)的檢測(cè) 當(dāng)探針是放射性標(biāo)記時(shí)，雜交信號(hào)的檢測(cè)通過(guò)放射自顯影進(jìn)行。即利用放射線在X光片上的成影作用來(lái)檢測(cè)雜交信號(hào)。操作時(shí)，在暗室內(nèi)將濾膜與增感屏、X光片依序放置暗盒中，再將暗盒置-70℃曝光適當(dāng)時(shí)間，取出X光片，進(jìn)行顯影和定影處理。
對(duì)于非放射性標(biāo)記的探針，則需將非放射性標(biāo)記物與檢測(cè)系統(tǒng)偶聯(lián)，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)的顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)雜交信號(hào)。以地高辛的堿性磷酸酶檢測(cè)反應(yīng)為例，地高辛(Dig)是一種半抗原，雜交反應(yīng)結(jié)束后，可加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗Dig抗體，使之在膜上的雜交位點(diǎn)形成酶標(biāo)抗體Dig復(fù)合物，再加入酶底物如氮藍(lán)四唑鹽(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚酚磷酸甲苯胺鹽(BCIP)，在酶促作用下，底物開始顯藍(lán)紫色。其基本反應(yīng)程序類似ELISA，雜交信號(hào)的強(qiáng)弱，通過(guò)底物顯色程度的深淺、有無(wú)來(lái)確定。
核酸雜交是從核酸分子混合液中檢測(cè)特定大小的核酸分子的傳統(tǒng)方法。其原理是核酸變性和復(fù)性理論。即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開，而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對(duì)規(guī)律形成雙邊結(jié)構(gòu)。雜交通常在一支持膜上進(jìn)行，因此又稱為核酸印跡雜交。根據(jù)檢測(cè)樣品的不同又被分為DNA印跡交（Southern blot hybridization ）和RNA印跡雜交（Northern blot hybridization）。其基本過(guò)程包括下列幾個(gè)步驟。
?。?）制備樣品：首先需要從待檢測(cè)組織樣品提取DNA或RNA。DNA應(yīng)先用限制性內(nèi)切酶消化以產(chǎn)生特定長(zhǎng)度的片段，然后通過(guò)凝膠電泳將消化產(chǎn)物按分子大小進(jìn)行分離。一般來(lái)說(shuō)DNA分子有其獨(dú)特的限制性內(nèi)切酶圖譜，所以經(jīng)酶切消化和電泳分離后可在凝膠上形成特定的區(qū)帶。再將含有DNA片段的凝膠進(jìn)行變性處理后，直接轉(zhuǎn)印到支持膜上并使其牢固結(jié)合。這樣等檢測(cè)片段在凝膠上的位置就直接反映在了轉(zhuǎn)印在膜上。RNA樣品則可直接在變性條件下電泳分離，然后轉(zhuǎn)印并交聯(lián)固定。
?。?）制備探針：探針是指一段能和待檢測(cè)核酸分子依堿基配對(duì)原則而結(jié)合的核酸片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。在核酸雜交實(shí)驗(yàn)中，探針需要被標(biāo)記上可直接檢測(cè)的元素或分子。這樣，通過(guò)檢疫與恩印膜上的核酸分子結(jié)合上的探針?lè)肿?，既可知道被檢測(cè)的核酸片段在膜上的位置，也就是在電泳凝膠上的位置，也就知道了它的分子大小。
（3）雜交：首先要進(jìn)行預(yù)雜交，即用非特異的核酸溶液封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。由于轉(zhuǎn)印在膜上的核酸分子已經(jīng)是變性的分子，所以雜交過(guò)程中只需變性標(biāo)記好的探針，再讓探針與膜在特定的溫度下反應(yīng)，然后洗去未結(jié)合的探針?lè)肿蛹纯伞?br> ?。?）檢測(cè)：檢測(cè)的方法依標(biāo)記探針的方法而異。用放射性同位素標(biāo)記的探針需要用放射自顯影來(lái)檢測(cè)其在膜上的位置；而如果是用生物素等非同位素方法標(biāo)記的探針則需要用相應(yīng)的免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)行檢測(cè)。
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