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近年來，基于大量腫瘤樣本的基因表達(dá)譜研究已經(jīng)確定了多個(gè)用于靶向治療的特異性標(biāo)記物。然而，由于乳腺癌腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性，其特定靶向治療的治療反應(yīng)和臨床結(jié)果往往受到限制。單細(xì)胞RNA測序技術(shù)可以在單細(xì)胞分辨率下評估腫瘤細(xì)胞的遺傳異質(zhì)性，從而有助于闡明腫瘤的生物學(xué)復(fù)雜性。

乳腺癌腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性(VilmaPetrikait?, et al. Life Sciences. 2019)

例如，Chung W, et al.(2017)通過分析11例乳腺癌患者(包括luminal A型、luminal B型、HER2陽性以及三陰乳腺癌)的515個(gè)乳腺腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本后發(fā)現(xiàn)，從HER2陽性腫瘤中分離出的細(xì)胞高度多樣化，主要表現(xiàn)為HER2和三陰性乳腺癌(TNBC)表型。此外，從ER/HER2雙陽性腫瘤中分離出的細(xì)胞通常是ER亞型，這是因?yàn)镠ER2模塊基因的低表達(dá)和ER信號通路的激活。因此，單細(xì)胞分子圖譜可以幫助識別ER途徑顯著激活的ER/HER2雙陽性腫瘤，并且該腫瘤類型可能受益于強(qiáng)化內(nèi)分泌治療。

另外，Wagner J, et al.(2019)研究發(fā)現(xiàn)，所有臨床亞型的腫瘤都由多個(gè)表型不同的細(xì)胞組成，盡管其中一種特定的表型通常是占主導(dǎo)優(yōu)勢的。并且，表型優(yōu)勢對腫瘤進(jìn)展和治療耐藥至關(guān)重要。例如，占主導(dǎo)地位的ERa^?HER2^?Survivin^high表型與新輔助化療耐藥有關(guān)；luminal B亞型腫瘤中，ER⁺細(xì)胞的頻率與乳腺癌腫瘤微環(huán)境中的PD-L1⁺腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞以及耗竭T細(xì)胞的表性相關(guān)，并且影響免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效。因此，通過單細(xì)胞測序技術(shù)了解患者的腫瘤異質(zhì)性，可以選擇合適的治療方案并改善患者預(yù)后。 

此外，單細(xì)胞分析還可用于探索抗腫瘤治療后耐藥細(xì)胞亞群，為后續(xù)抗腫瘤治療提供指導(dǎo)。

眾所周知，三陰乳腺癌(TNBC)的特點(diǎn)是廣泛的腫瘤內(nèi)多樣性。目前研究發(fā)現(xiàn)，對新輔助化療未能達(dá)到病理完全應(yīng)答(pCR)的患者通常預(yù)后較差，這表明存在一小部分對常規(guī)化療有耐藥性的細(xì)胞亞群。根據(jù)這一假設(shè)，Karaayvaz et al.(2018)通過scRNA-seq技術(shù)分析了6個(gè)原發(fā)TNBC腫瘤，并從中鑒定出5個(gè)不同的上皮細(xì)胞亞群。并且這些細(xì)胞亞群與患者的生存預(yù)后密切相關(guān)。其中最具代表性的是富含鞘糖脂和天然免疫途徑特征的細(xì)胞亞群，該亞群與患者不良結(jié)局有關(guān)。

Wang et al.(2019)最近在CDK4/6抑制劑耐藥腫瘤中發(fā)現(xiàn)了一種獨(dú)特的免疫抑制不成熟髓系細(xì)胞(immature myeloid cell, IMC)群體。通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，研究者證明IMC靶向酪氨酸激酶抑制劑cabozantinib和免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合治療可提高抗腫瘤免疫能力，并克服耐藥性。

還有，Jang et al.(2020)研究發(fā)現(xiàn)抗放射性治療的腫瘤細(xì)胞與較高的PD-L1陽性率及腫瘤突變負(fù)荷(TMB)相關(guān)。此外，與luminal和HER2陽性亞型相比，三陰乳腺癌細(xì)胞表達(dá)更高水平的免疫檢查點(diǎn)分子，因此，采用放療和免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合治療的方法可有效治療對輻射敏感且PD-L1過表達(dá)及高TMB的三陰乳腺癌患者。

最后，Vu et al.(2019)等開發(fā)了一種從scRNA-seq分析中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞水平突變信息的新技術(shù)，而特定的體細(xì)胞突變往往與乳腺癌的臨床治療效率有關(guān)。例如，GATA3突變預(yù)示著對芳香化酶抑制有更好的反應(yīng)；PI3K或ERBB2突變可能使HER2陽性乳腺腫瘤對新輔助化療(多西紫杉醇、卡鉑)與抗HER2治療(曲妥珠單抗、拉帕替尼)聯(lián)合治療敏感，該技術(shù)拓展了scRNA-seq在腫瘤研究中的應(yīng)用。

綜上，我們可以發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞測序技術(shù)是一種很有應(yīng)用前景的工具，可用于識別與TMB或免疫檢查點(diǎn)相關(guān)的新標(biāo)記物，為臨床用藥提供指導(dǎo)，另外也能夠更加準(zhǔn)確地預(yù)測個(gè)體化藥物反應(yīng)。

腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中是一個(gè)異質(zhì)性群體，根據(jù)其特定的表面標(biāo)志可以被分為不同的亞群。然而，它們的起源以及在腫瘤內(nèi)的發(fā)生、發(fā)展和治療反應(yīng)中的作用還不是很清楚。scRNA-seq技術(shù)已在乳腺癌腫瘤中鑒定出不同的CAF類型，它們可能起源于不同的親本細(xì)胞，且主要參與免疫細(xì)胞向腫瘤的募集和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。

乳腺癌兩種主要腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞亞型及其功能(Xueqi Yan, et al. J Exp Clin Cancer Res. 2021)

最近，有研究者根據(jù)成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)、α平滑肌肌動蛋白(αSMA)、整合素β1(CD29)將乳腺癌中的CAF分為CAF-S1、CAF-S2、CAF-S3和CAF-S4四個(gè)亞群。其中CAF-S1可以通過招募Treg細(xì)胞促進(jìn)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制，但其異質(zhì)性及其對免疫治療反應(yīng)的影響尚不清楚。

為了探索CAF-S1細(xì)胞亞群的功能，Kieffer et al.(2020)使用scRNA-seq技術(shù)分析了乳腺癌中超過19000個(gè)單一的CAF-S1細(xì)胞，確定了8個(gè)CAF-S1細(xì)胞簇。其中3個(gè)為炎癥性CAF(iCAF)(1，2，5)，5個(gè)為纖維母細(xì)胞性CAF(myCAF)(0，3，4，6，7)。其中第0簇增加了FOXP3⁺Treg細(xì)胞表面PD-1和CTLA4的表達(dá)，而CD4⁺CD25⁺T細(xì)胞促進(jìn)了第0簇向第3簇的轉(zhuǎn)化。這表明免疫抑制的CAF-S1亞群和Treg細(xì)胞之間存在正反饋循環(huán)，可能介導(dǎo)了免疫治療耐藥。相反，第4簇與高T細(xì)胞浸潤相關(guān)，但在免疫治療無效的腫瘤中富集。因此，在高T細(xì)胞浸潤的腫瘤中，簇4是一個(gè)潛在的免疫耐藥的替代標(biāo)記物。綜上所述，在乳腺癌診斷過程中，CAF-S1圖譜分析可以增加浸潤C(jī)D8⁺T細(xì)胞和Treg細(xì)胞數(shù)量用以區(qū)分有反應(yīng)者和無反應(yīng)者的預(yù)測價(jià)值。另外PD-1和/或CTLA4抑制劑聯(lián)合CAF-S1靶向治療乳腺癌值得研究者進(jìn)行進(jìn)一步的探索。

此外，CAF還有很多其他類型分類。Bartoschek et al.(2018)通過對乳腺癌基因工程小鼠模型的768個(gè)CAF細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析后，將其定義為3個(gè)不同的亞群：血管CAF(vascular CAF, vCAF)，基質(zhì)CAF(matrix CAF, mCAF)，周期CAF(cycling CAF, cCAF)和發(fā)育CAF(developmental CAF, dCAF)，且這三種亞群可能分別來自血管周圍位置、駐留的成纖維細(xì)胞以及發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的惡性細(xì)胞。其中，vCAF或mCAF信號可以預(yù)測患者預(yù)后，另外，mCAF還可以預(yù)測乳腺癌對新輔助化療的耐藥性。

除上述研究外，Wu et al.(2020)對5個(gè)三陰乳腺癌患者的間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序，發(fā)現(xiàn)4種不同狀態(tài)的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞亞群：myCAFs、iCAFs、分化的血管周樣細(xì)胞(differentiated perivascular-like, dPVL)和未成熟的血管周樣細(xì)胞(immature perivascular-like, dPVL)。在三陰乳腺癌患者隊(duì)列中，iCAFs基因特征與毒性T淋巴細(xì)胞功能障礙密切相關(guān)。另外研究者還發(fā)現(xiàn)iCAFs和dPVL亞群在多個(gè)獨(dú)立的三陰乳腺癌隊(duì)列中與免疫逃避密切相關(guān)，因此可以作為乳腺癌潛在的治療靶點(diǎn)。

綜上所述，scRNA-seq技術(shù)可以顯著提高CAF的細(xì)胞分辨率，并證明至少存在三個(gè)空間上和功能上不同的乳腺癌CAF亞群。iCAF、vCAF和mCAF信號在乳腺癌腫瘤樣本中高度保守，且這些細(xì)胞亞群與患者的細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能障礙以及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，同時(shí)也為開發(fā)更高分辨率的新型靶向藥物或生物標(biāo)記物提供了可能性。

越來越多的研究表明，免疫細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展和治療反應(yīng)中起著重要作用。針對CTLA-4和PD-1的免疫治療的療效在乳腺癌患者間存在很大的差異，這歸因于腫瘤間免疫細(xì)胞的異質(zhì)性。T細(xì)胞和髓樣細(xì)胞是腫瘤中含量最豐富的細(xì)胞亞群，因此其與患者的臨床治療反應(yīng)可能最為相關(guān)。已有研究表明，實(shí)體瘤中過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的 Treg細(xì)胞顯著增加；同樣，與抑制腫瘤進(jìn)展的促炎M1型巨噬細(xì)胞相比，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的M2型巨噬細(xì)胞的比例相對較高；此外，B細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞等也在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮著重要作用。然而，正常組織和腫瘤組織之間的免疫細(xì)胞狀態(tài)是否不同仍有待進(jìn)一步闡明。

免疫細(xì)胞與免疫治療(Zemin Zhang, et al. Nature. 2020)

3.1 T細(xì)胞

對于乳腺癌患者尤其是三陰乳腺癌患者，浸潤腫瘤的T細(xì)胞數(shù)量和類型是決定治療和預(yù)后的關(guān)鍵因素。腫瘤內(nèi)的T細(xì)胞群體往往存在異質(zhì)性，表現(xiàn)為Tregs細(xì)胞富集，CD8⁺T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楹慕呋蚪M織駐留記憶(T_RM)表型。與此同時(shí)，抗炎、耗竭、缺氧和無變應(yīng)性基因表達(dá)上調(diào)，免疫治療靶基因差異表達(dá)。因此，腫瘤內(nèi)T細(xì)胞的狀態(tài)是預(yù)測患者預(yù)后狀態(tài)以及治療反應(yīng)的潛在標(biāo)志物。

Azizi et al.(2018)使用scRNA-seq分析了來自8個(gè)乳腺癌患者的45000個(gè)免疫細(xì)胞，以及與之匹配的正常乳腺組織、血液和淋巴結(jié)。與正常組織相比，細(xì)胞毒性T細(xì)胞、Treg細(xì)胞和活化的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在腫瘤組織中更為豐富，初始T細(xì)胞在血液中高度富集，B細(xì)胞在淋巴結(jié)中更為普遍。此外，腫瘤內(nèi)的T細(xì)胞被組成性地激活，并在分化過程中以多個(gè)瞬時(shí)群體的形式存在，而不是幾個(gè)離散和穩(wěn)定的狀態(tài)。這些發(fā)現(xiàn)對乳腺腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞的表型多樣性提供了一些新的見解，并可能有助于更好地理解癌癥進(jìn)展的機(jī)制和治療反應(yīng)。

 另外，不同乳腺癌亞型腫瘤細(xì)胞內(nèi)的T細(xì)胞狀態(tài)也存在明顯的差異。例如，在luminal B型乳腺癌患者的原發(fā)部位處，T細(xì)胞表現(xiàn)出幼稚/早期共刺激信號特征，而在淋巴結(jié)中，T細(xì)胞普遍表現(xiàn)出共刺激信號特征。相反，HER2陽性和三陰乳腺癌患者腫瘤細(xì)胞內(nèi)的T細(xì)胞往往表達(dá)IL2RA等調(diào)節(jié)信號。此外，在三陰乳腺癌腫瘤浸潤的免疫細(xì)胞中也檢測到高表達(dá)細(xì)胞因子和趨化因子的T細(xì)胞，且表現(xiàn)為免疫抑制耗竭或調(diào)節(jié)性表型。雖然這些細(xì)胞只表達(dá)適度水平的PD-1，但其他抑制性受體，如TIGIT和LAG3，已經(jīng)被頻繁檢測到，并且是檢查點(diǎn)抑制劑的潛在靶點(diǎn)。 

盡管T細(xì)胞是腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的主要群體，但T細(xì)胞亞群的定量和定性差異與患者預(yù)后之間的關(guān)系仍不清楚。Savas et al.(2018)從人乳腺癌組織中分離出6311個(gè)T細(xì)胞，并鑒定出一個(gè)新的組織駐留記憶CD8⁺T細(xì)胞亞類(T_RM)，并且TRM基因特征在TNBC組織中比在其他乳腺癌亞型中更為豐富。之前有研究報(bào)道，乳腺癌中的CD3⁺CD8⁺T細(xì)胞主要為效應(yīng)記憶T細(xì)胞(T_EM，CCR7^?CD45RA^?)和重新表達(dá)CD45RA的效應(yīng)記憶(T_EMRA，CCR7^?CD45RA+)表型(Azizi E, et al.(2018))。但是通過TCR測序顯示，T_RM和T_EM細(xì)胞的TCR譜系并不重疊，表明其具有不同的抗原特異性。另外，T_RM細(xì)胞還是免疫檢查點(diǎn)抑制劑的潛在靶點(diǎn)，晚期乳腺癌患者高T_RM細(xì)胞頻率可能預(yù)示著對抗PD-1治療有較好的反應(yīng)。最后，T_RM細(xì)胞的富集程度還與早期三陰乳腺癌患者的預(yù)后改善和總生存期(OS)的延長有關(guān)。總而言之，進(jìn)一步了解T_RM細(xì)胞的發(fā)育、維持和調(diào)控對于乳腺癌免疫治療的成功發(fā)展至關(guān)重要。

 Wagner et al.(2019)使用單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)破譯了不同乳腺癌亞型的免疫狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)錄分析一致的是，腫瘤相關(guān)的T細(xì)胞簇以連續(xù)分化表型的形式存在于CD4⁺和CD8⁺T細(xì)胞中，其中大多數(shù)具有CD197^lowCD45RA^low記憶效應(yīng)表型。此外，在ER^?和高級別ER⁺腫瘤中，Treg細(xì)胞和耗竭T細(xì)胞的頻率較高，這可能是這類患者對免疫檢查點(diǎn)抑制劑反應(yīng)較好的細(xì)胞基礎(chǔ)。因此更好地了解乳腺癌免疫微環(huán)境中腫瘤與免疫的關(guān)系有助于免疫治療的患者分層。

3.2 髓系細(xì)胞

 髓系細(xì)胞是一個(gè)異質(zhì)性群體，包括粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞，它們在抗腫瘤免疫中起著關(guān)鍵作用。單核/巨噬細(xì)胞，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，通過識別和吞噬病原體在先天免疫中發(fā)揮作用，并通過向T細(xì)胞遞呈抗原在獲得性免疫中發(fā)揮輔助作用。另外多項(xiàng)靶向髓系免疫細(xì)胞如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophage, TAM)和樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell, DC)的治療策略已進(jìn)入臨床前試驗(yàn)。然而這些細(xì)胞在乳腺癌腫瘤微環(huán)境中的特征，其與T細(xì)胞等其他細(xì)胞的相互作用關(guān)系，以及其靶向藥物的作用機(jī)理尚未得到全面闡釋。

3.3 NK細(xì)胞

NK細(xì)胞是典型的先天淋巴樣細(xì)胞，它可以通過產(chǎn)生溶細(xì)胞顆粒直接消滅腫瘤細(xì)胞，或者通過分泌促炎細(xì)胞因子和趨化因子間接激活其他免疫細(xì)胞。B?tttcher等人研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤駐留的NK細(xì)胞招募cDC1細(xì)胞來促進(jìn)抗腫瘤免疫，而腫瘤細(xì)胞可以通過釋放前列腺素E2削弱NK細(xì)胞的功能，從而導(dǎo)致免疫逃避。因此，NK細(xì)胞也是免疫治療的潛在靶點(diǎn)。然而，在乳腺癌腫瘤微環(huán)境內(nèi)，研究者對于NK細(xì)胞在單細(xì)胞水平的功能仍知之甚少，因此，需要進(jìn)一步的研究和探索。

3.4 B細(xì)胞

B細(xì)胞是適應(yīng)性體液免疫的中介細(xì)胞，在抗原刺激下分化為記憶B細(xì)胞或分泌免疫球蛋白的漿細(xì)胞。

目前研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤性B細(xì)胞(TIB)表現(xiàn)出相當(dāng)大的表型和功能多樣性，并且可通過作用于髓系細(xì)胞或癌細(xì)胞的旁分泌介質(zhì)抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展(Ammirante M, et al.(2010))。

為了了解乳腺癌化療誘導(dǎo)的B細(xì)胞抗腫瘤免疫反應(yīng)，Lu et al.（2020）對乳腺腫瘤治療前后腫瘤浸潤的B細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq分析后發(fā)現(xiàn)，在新輔助化療后，出現(xiàn)了ICOSL⁺B細(xì)胞亞群，且部分或完全緩解組ICOSL⁺B細(xì)胞數(shù)量明顯高于穩(wěn)定期或進(jìn)展期患者，提示此亞群與療效改善有關(guān)。另外，ICOSL⁺B細(xì)胞富集是乳腺癌患者無病生存期和總生存期的獨(dú)立的積極預(yù)后因素。

B細(xì)胞在乳腺癌化療誘導(dǎo)免疫治療中的作用(Yiwen Lu, et al. Cell. 2020)

此外，Hollern et al.(2019)研究發(fā)現(xiàn)，免疫檢查點(diǎn)抑制劑可誘導(dǎo)三陰乳腺癌患者中濾泡輔助T細(xì)胞和B細(xì)胞的激活，激活的B細(xì)胞通過分泌抗體和向T細(xì)胞呈遞抗原來促進(jìn)抗腫瘤反應(yīng)。因此，作為檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)答機(jī)制的B細(xì)胞驅(qū)動的T細(xì)胞活化可以增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效。然而，盡管這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了B細(xì)胞在抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵作用，但是其是否可以作為免疫治療的靶點(diǎn)還尚不清楚，因此研究者還需要進(jìn)一步的探索來揭示其潛在的作用機(jī)制。

 目前，臨床工作者迫切需要尋找新的乳腺癌預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，以改善患者的預(yù)后和生存期。單細(xì)胞檢測技術(shù)，包括scRNA-seq、scDNAseq以及質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)，有助于剖析復(fù)雜的乳腺癌微環(huán)境，揭示影響抗腫瘤反應(yīng)的不同細(xì)胞亞群。單細(xì)胞檢測還可以用來檢測治療后耐藥細(xì)胞亞群的出現(xiàn)，這可能對現(xiàn)有或新的靶向藥物的二線治療決策具有重要的臨床意義?？傮w而言，將單細(xì)胞檢測整合到基礎(chǔ)和臨床轉(zhuǎn)化研究中，可以通過確定潛在的治療靶點(diǎn)來開發(fā)新藥，并揭示有希望的生物標(biāo)志物來監(jiān)測治療效果和指導(dǎo)治療決策，從而促進(jìn)個(gè)性化治療。

參考文獻(xiàn)

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