Nuclear-Encoded lncRNA MALAT1 Epigenetically Controls Metabolic Reprogramming in HCC Cells
through the Mitophagy Pathway
Mol Ther Nucleic Acids. 2020 Oct 4;23:264-276. IF:8.886（2區(qū)Q1）.
研究背景：細(xì)胞能量學(xué)的失調(diào)一直被認(rèn)為是惡性腫瘤的標(biāo)志之一，包括肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)，因?yàn)榫€粒體生物能學(xué)、生物合成和信號(hào)傳導(dǎo)的變化是腫瘤發(fā)生的必要條件。靶向癌細(xì)胞中異常的能量代謝可能成為開發(fā)新的癌癥治療藥物的重要策略。線粒體相關(guān)的lncRNAs，包括來自mtDNA的RNA和被運(yùn)輸?shù)骄€粒體的核編碼lncRNA，可能與轉(zhuǎn)錄因子和其他表觀遺傳調(diào)控因子協(xié)同工作，調(diào)節(jié)線粒體基因表達(dá)和線粒體功能。線粒體相關(guān)lncRNA的異常調(diào)控可能導(dǎo)致細(xì)胞衰老和腫瘤發(fā)生，核基因組編碼lncRNAs可以作為“順行信號(hào)”調(diào)節(jié)線粒體功能與RNA轉(zhuǎn)運(yùn)體到線粒體，而線粒體基因組轉(zhuǎn)錄lncRNAs可能穿梭通過RNA轉(zhuǎn)運(yùn)體到細(xì)胞核，在那里他們可以調(diào)節(jié)核基因組的功能，作為一個(gè)“逆行信號(hào)”。無論是核基因組編碼還是線粒體基因組轉(zhuǎn)錄，都可能在癌細(xì)胞線粒體代謝異常中發(fā)揮關(guān)鍵作用。核基因組轉(zhuǎn)錄的lncRNA MALAT1在肝細(xì)胞癌細(xì)胞的線粒體中發(fā)現(xiàn)。因此，lncRNA可能作為重要的信使分子，與細(xì)胞核基因組和線粒體基因組的調(diào)控有關(guān)。
結(jié)果分析
Nuclear-Encoded lncRNA MALAT1 Is Aberrantly Enriched in the Mitochondria of Hepatoma Cells
核編碼的lncRNA MALAT1在肝癌細(xì)胞的線粒體中異常富集
為了表征代謝重編程的調(diào)節(jié)成分，從肝癌HepG2細(xì)胞（人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系）和正常肝HL7702細(xì)胞（人正常肝細(xì)胞系）中分離了線粒體。在分離的線粒體RNA中檢測(cè)到MALAT1的富集，進(jìn)行了RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)來鑒定線粒體中的RNA，共鑒定了246個(gè)在HepG2和HL7702細(xì)胞之間差異表達(dá)的RNA（圖A/B）。通過qPCR，證實(shí)了肝癌HepG2細(xì)胞的線粒體MALAT1豐度是正常肝臟HL7702細(xì)胞的大約12倍。此外，該核編碼的lncRNA也大量定位于另外兩種人肝癌細(xì)胞系（Huh751和SMMC-7721）的線粒體中（圖C）。使用RNAFISH驗(yàn)證了HepG2線粒體中MALAT1lncRNA的存在。觀察到MALAT1（紅色）和MitoTracker（綠色）在個(gè)體、蛇形和小片段樣線粒體中的共定位（圖D），RNA FISH的定量也證實(shí)了MALAT1在線粒體中的定位（圖E/F）。這些數(shù)據(jù)表明，在HepG2細(xì)胞中，核編碼的lncRNA MALAT1中可以被轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體。
MALAT1 Binds to mtDNA and Alters Its Epigenotype
MALAT1與mtDNA結(jié)合并改變其表觀基因型
在細(xì)胞核中，MALAT1通過改變lncRNA與DNA結(jié)合的表觀基因型來調(diào)控多個(gè)基因靶標(biāo)。為了確定MALAT1是否利用類似的機(jī)制調(diào)控線粒體基因，進(jìn)行了RNA逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)陷阱測(cè)序（RAT-seq），確定了特定的MALAT1-mtdna相互作用位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)MALAT1與多種mtDNA相互作用，包括MT-RNR1、MT-RNR2、MT-CO2、MT-ND3和MT-CYTB（圖A）。MALAT1-mtDNA的相互作用通過ChIRP檢測(cè)(通過RNA純化進(jìn)行染色質(zhì)分離)進(jìn)行驗(yàn)證，用qPCR對(duì)MALAT1-mtDNA相互作用位點(diǎn)的mtDNA進(jìn)行定量，該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MALAT1與mtDNA在D-loop、MT-CO2和MT-ND3位點(diǎn)的結(jié)合（圖B）。
MALAT1 Is Essential for Mitochondrial Function in HepG2 Cells
MALAT1對(duì)HepG2細(xì)胞的線粒體功能至關(guān)重要
研究了MALAT1是否參與了線粒體生物發(fā)生和能量學(xué)的調(diào)控，MALAT1基因敲低的細(xì)胞表現(xiàn)出基礎(chǔ)呼吸、ATP產(chǎn)生能力、最大呼吸和備用呼吸能力下降，MALAT1消耗后，與對(duì)照組細(xì)胞相比，HepG2細(xì)胞的基礎(chǔ)呼吸能力降低（圖A）。然而，根據(jù)細(xì)胞外酸化率(ECAR)來評(píng)估，糖酵解功能沒有顯著變化（圖B）。定量分析線粒體產(chǎn)生ATP的能力。與對(duì)照組相比，MALAT1基因的敲低顯著降低了ATP的合成（圖C）。癌細(xì)胞增加了線粒體來源的活性氧(mROS)的產(chǎn)生，這是線粒體電子傳遞鏈的副產(chǎn)品，可能導(dǎo)致致瘤信號(hào)通路的激活和代謝重編程。使用MitoSOX測(cè)量了mROS，發(fā)現(xiàn)shMALAT1-1/2細(xì)胞中的mROS明顯低于對(duì)照組細(xì)胞（圖D/F）。還測(cè)量了線粒體Mn-SOD的活性，這是一種消除mROS的抗氧化酶。發(fā)現(xiàn)敲除shMALAT1顯著提高了其在線粒體中的特異性酶活性（圖E）。
Enrichment of MALAT1 Affects Mitochondrial Apoptosis
MALAT1的富集影響線粒體凋亡
在shMALAT1處理的HepG2細(xì)胞中，線粒體凋亡增加，觀察到線粒體腫脹，泡基質(zhì)室增大，腫脹的泡質(zhì)室周圍的小泡基質(zhì)室，內(nèi)邊界膜缺失（圖A）。MALAT1敲低誘導(dǎo)了一系列與線粒體凋亡相關(guān)的事件，包括caspase-3激活、細(xì)胞色素C表達(dá)增加、Bcl-2表達(dá)減弱。在shMALAT1處理的細(xì)胞中，線粒體凋亡激活因子BAX被下調(diào)，提示shMALAT1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能不是來自于激活的BAX寡聚物孔的形成（圖B/C）。采用AnnexinV/7-AAD熒光活化細(xì)胞分選(FACS)染色對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步定量。流式細(xì)胞儀的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)圖說明了細(xì)胞死亡的進(jìn)程，Q1、Q2、Q3分別代表健康細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)下調(diào)MALAT1可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡（圖D/E）。這些發(fā)現(xiàn)表明，MALAT1是通過抑制線粒體特異性凋亡來維持正常線粒體功能所必需的。使用JC-1染色測(cè)量了線粒體膜電位，發(fā)現(xiàn)，MALAT1的敲低增加了線粒體膜電位的丟失，證實(shí)了HepG2中MALAT1的敲低觸發(fā)了細(xì)胞凋亡的早期事件（圖F）。
MALAT1 Functions via the Mitochondrial Autophagy Pathway
MALAT1通過線粒體自噬途徑發(fā)揮作用
使用蛋白印跡法來測(cè)量這些線粒體吞噬途徑蛋白。經(jīng)shMALAT1處理的細(xì)胞顯示出線粒體吞噬事件的顯著減少。與對(duì)照組細(xì)胞相比，MALAT1敲低細(xì)胞的線粒體自噬標(biāo)志物表達(dá)減少，特別是PINK1、SQSTM1/p62、NDP52、BNIP3和LC3B-I/II（圖A/B）。當(dāng)自噬被誘導(dǎo)時(shí)，LC3B-II/I比值（是監(jiān)測(cè)細(xì)胞自噬的敏感定量指標(biāo)）增加。MALAT1基因敲除后，LC3B-II/I比值顯著降低（圖C）提示MALAT1在這個(gè)自噬過程中起著關(guān)鍵作用。使用溶酶追蹤器標(biāo)記溶酶體，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組細(xì)胞相比，MALAT1處理的細(xì)胞中紅色（酸性）溶酶體的數(shù)量顯著減少，表明在MALAT缺陷的細(xì)胞中溶酶體功能受損（圖D）。
Effect of MALAT1 on the Biological Behavior of Hepatocellular Carcinoma Cells
MALAT1對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
MALAT1與肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。使用Transwell檢測(cè)了shMALAT1-1/2細(xì)胞的侵襲情況，發(fā)現(xiàn)侵襲MALAT1敲低細(xì)胞的平均數(shù)量明顯低于HepG2隨機(jī)載體細(xì)胞(shCT)（圖A）。類似地，MALAT1基因的敲低也改變了細(xì)胞的增殖（圖B）、傷口愈合（圖C）、細(xì)胞周期的進(jìn)展和克隆的形成。
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