'巨噬細(xì)胞極化'在心腦血管病、腫瘤等多類(lèi)疾病中都發(fā)揮著重要的作用，是炎癥、免疫相關(guān)研究的熱點(diǎn)之一。在不同的環(huán)境因素影響下，巨噬細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為多種不同的功能表型，最重要的兩種即：
1.經(jīng)典活化性巨噬細(xì)胞(M1型)--主要介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)和維持（促炎作用） 2.選擇活化性巨噬細(xì)胞(M2型)--主要參與炎癥的消退（抗炎作用）巨噬細(xì)胞極化失衡介導(dǎo)炎癥反應(yīng)失調(diào)，進(jìn)而引起局部乃至全身的病理改變。因此，關(guān)于巨噬細(xì)胞極化的研究，一方面可以以發(fā)病機(jī)制角度入手，研究巨噬細(xì)胞極化失衡在某病變中的作用和機(jī)制；另一方面，可以以疾病治療的角度入手，尋找能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的分子，研究其治療作用及分子機(jī)制。
本期文獻(xiàn)解讀我們以一篇巨噬細(xì)胞極化調(diào)控結(jié)合心血管疾病的實(shí)驗(yàn)類(lèi)文章為例，初步學(xué)習(xí)一下巨噬細(xì)胞極化相關(guān)分子實(shí)驗(yàn)類(lèi)文章的設(shè)計(jì)和研究方法。白介素37通過(guò)抑制Notch1/NF-κB通路抑制M1巨噬細(xì)胞極化
題目: Interleukin 37 Suppresses M1 Macrophage Polarization Through Inhibition of the Notch1 and Nuclear Factor Kappa B Pathways
巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥在心血管疾病中起著重要作用，包括加速鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病(CAVD)的發(fā)展。M1、M2型巨噬細(xì)胞極化失衡可以改變炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度。重組人IL-37可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能以減輕炎癥。此研究旨在確定IL-37對(duì) M1極化的特異性調(diào)節(jié)作用并研究其潛在機(jī)制。與正常瓣膜相比，鈣化主動(dòng)脈瓣中M1巨噬細(xì)胞積聚較多，IL-37表達(dá)較少，提示IL-37與M1極化之間可能存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。THP-1細(xì)胞用PMA處理可分化為靜息巨噬細(xì)胞，然后經(jīng)脂多糖(LPS)和干擾素γ(IFN-γ)處理后分化為M1巨噬細(xì)胞。在體外實(shí)驗(yàn)中，重組人IL-37抑制了M1相關(guān)iNOS、CD11c、IL-6和MCP-1的表達(dá)，但上調(diào)了M2相關(guān)CD206和IL-10的表達(dá)。M1極化的抑制與NF-κB和Notch1信號(hào)通路激活受抑制有關(guān)。這些結(jié)果表明，IL-37通過(guò)抑制Notch1和NF-κB途徑抑制巨噬細(xì)胞極化為M1型?？傊?，IL-37通過(guò)調(diào)節(jié)M1極化及其介導(dǎo)的炎癥，可能是進(jìn)行性CAVD的潛在治療候選物。綜上，通過(guò)調(diào)節(jié)M1極化及其介導(dǎo)的炎癥，IL-37可能作為進(jìn)行性CAVD的潛在候選治療藥物。鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病 (CAVD) 被認(rèn)為是一種慢性進(jìn)行性炎癥性疾病，巨噬細(xì)胞可能在鈣化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。巨噬細(xì)胞是協(xié)調(diào)炎癥過(guò)程的髓系免疫細(xì)胞，可以呈現(xiàn)兩種主要的功能表型：經(jīng)典激活表型，也稱(chēng)為 M1 巨噬細(xì)胞；以及替代激活表型，也稱(chēng)為 M2 巨噬細(xì)胞。M1 巨噬細(xì)胞可由 Toll 樣受體 (TLR) 配體和 IFN-γ 誘導(dǎo)，而 M2 可由 IL4/IL13 (M2a)、免疫復(fù)合物 (M2b) 和抗炎細(xì)胞因子 IL-10 或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (M2c)誘導(dǎo)。M1 型巨噬細(xì)胞表達(dá)多種促炎細(xì)胞因子，如 IL-1β、IL-6、IL-23、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 (iNOS) 和腫瘤壞死因子α (TNF-α)，而 M2 巨噬細(xì)胞分泌的分子包括精氨酸酶 1 (Arg1 )、IL-10 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 (TGF-β1)，它們與寄生蟲(chóng)感染、組織重塑和腫瘤進(jìn)展有關(guān)。研究表明 M1 和 M2 存在于動(dòng)脈粥樣硬化和鈣化病變的中心部分，并隨著微環(huán)境變化而相互轉(zhuǎn)化。M1巨噬細(xì)胞在主動(dòng)脈瓣病變中積累這一發(fā)現(xiàn)表明M1巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥在心血管鈣化中起關(guān)鍵作用。 巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制涉及多種信號(hào)通路，如 Akt2 、激活蛋白 1 (AP-1) 、干擾素調(diào)節(jié)因子 (IRF)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPAR-γ）、缺氧誘導(dǎo)因子 -2alpha (HIF-2α）、核因子 kappa B (NF-κB）和 Notch1 信號(hào)通路。IL-37，也稱(chēng)為 IL-1F7，是 IL-1 家族的一員，是潛在的炎癥抑制因子。該研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)證明 IL-37 轉(zhuǎn)基因小鼠可免受炎癥引起的主動(dòng)脈瓣病變的影響，然而，IL-37 是否抑制巨噬細(xì)胞極化以抑制炎癥尚未明確確定。此研究旨在確定 IL-37 是否抑制 M1 極化以抑制炎癥，并探索 IL-37 發(fā)揮其作用的機(jī)制。檢測(cè)了 M1/M2 巨噬細(xì)胞表型在鈣化和非鈣化主動(dòng)脈瓣中的表達(dá)，評(píng)估了重組 IL-37 對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響，并研究了 IL-37 是否通過(guò) NF-κB 、 Notch1 通路調(diào)節(jié) M1 巨噬細(xì)胞極化。THP-1 細(xì)胞：獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (ATCC)。
重組人 IL-37：Abcam。
細(xì)胞培養(yǎng)：THP-1 細(xì)胞以 5 ×10 6細(xì)胞/孔接種在 6 孔板中，在含有 10% FBS 的 RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，
巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)：
誘導(dǎo)M0：100 ng/ml PMA孵育THP-1 細(xì)胞 24h分化為靜息（M0）巨噬細(xì)胞。誘導(dǎo)M1：繼續(xù)培養(yǎng)M0巨噬細(xì)胞 48 小時(shí)后，用 PBS 洗滌細(xì)胞，然后用LPS（100 ng/ml） IFN-γ（20ng/ml）處理 24 h以極化為 M1 巨噬細(xì)胞。研究IL-37 對(duì) M1 極化的影響：IL-37 (0.1 ng/ml)預(yù)處理 M0 巨噬細(xì)胞1 h，而后 LPS IFN-γ處理誘導(dǎo)M1。
研究NF-κB 和 Notch1對(duì)M1 極化的影響：先使用 NF-κB 特異性抑制劑 BAY11-7082（5 μM）和γ-分泌酶抑制劑 DAPT（50 μM) 到培養(yǎng)基中預(yù)處理M0巨噬細(xì)胞1 h，而后LPS IFN-γ處理誘導(dǎo)M1。
研究Notch1 對(duì) NF-κB 磷酸化的影響： DAPT (50μM) 預(yù)處理M1巨噬細(xì)胞1h后，LPS IFN-γ處理誘導(dǎo)M1。
5.1 “巨噬細(xì)胞與疾病的關(guān)聯(lián)” 鈣化主動(dòng)脈瓣中M1巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增多， IL-37水平下降
鈣化的主動(dòng)脈瓣來(lái)自接受主動(dòng)脈瓣置換術(shù)的患者和來(lái)自接受心臟移植手術(shù)的患者的正常主動(dòng)脈瓣。① 瓣膜HE染色：與非鈣化瓣膜相比，鈣化瓣膜顯示出明顯的纖維化和新生血管形成 (圖1A)，表明了 CAVD 中組織損傷和纖維化修復(fù)的病理進(jìn)程。② 檢測(cè)鈣化和未鈣化瓣膜中的 M1 和 M2 巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況對(duì) CD11c (M1 的表面標(biāo)志物）(圖1B) 和 CD206 (M2 的表面標(biāo)志物) (圖 1C) 進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示：M1巨噬細(xì)胞（CD11c ）在鈣化主動(dòng)脈瓣浸潤(rùn)增加（P < 0.01），而M2巨噬細(xì)胞（CD206 ）浸潤(rùn)減少（P< 0.05）（圖 1E）。此外，鈣化的主動(dòng)脈瓣中CD11c 細(xì)胞（M1 巨噬細(xì)胞）浸潤(rùn)豐度高于CD206 細(xì)胞（M2 巨噬細(xì)胞），而在非鈣化的主動(dòng)脈瓣中相反（圖 S1A）。注：細(xì)胞核用 Hoechst 33258 染色，細(xì)胞膜用3，30-二十八烷基氧基氰基高氯酸鹽(DiO)染色。陰性對(duì)照通過(guò)單獨(dú)與第二抗體孵育來(lái)進(jìn)行(省略第一抗體)。使用熒光顯微鏡(徠卡TCS-SP8共焦顯微鏡)捕獲圖像。
鈣化主動(dòng)脈瓣組中CD11c /CD206 細(xì)胞的比值明顯高于非鈣化主動(dòng)脈組（P < 0.01）（圖 1F）。
③ 檢測(cè)瓣膜中IL-37的表達(dá)情況
在非鈣化主動(dòng)脈瓣中，IL-37 在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外均表達(dá)（圖S1B）。瓣膜組織抗 IL-37 抗體免疫組化染色 (圖 1D) 結(jié)果表明，鈣化主動(dòng)脈瓣中 IL-37 的表達(dá)降低 (圖 1E）。非鈣化和鈣化主動(dòng)脈瓣組織的免疫印跡也顯示出相同的趨勢(shì)（圖 S2B、S2C）。該部分的結(jié)果表明，與非鈣化主動(dòng)脈瓣相比，鈣化人主動(dòng)脈瓣中 M1 巨噬細(xì)胞水平增加而M2 巨噬細(xì)胞水平降低，這可能與 IL-37 水平降低有關(guān)。 5.2 “細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證IL-37對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用” ① IL-37 下調(diào) M1 表型標(biāo)志物和促炎細(xì)胞因子水平
為了確定 IL-37 是否抑制 M1 巨噬細(xì)胞分化，用 PMA (100 ng/ml) 處理 THP-1 細(xì)胞將其誘導(dǎo)分化為靜止 (M0) 巨噬細(xì)胞，然后在重組 IL-37 存在或不存在的條件下用 LPS (100 ng/ml) IFN-γ (20 ng/ml)處理上述M0巨噬細(xì)胞。LPS IFN-γ處理后，M1 巨噬細(xì)胞標(biāo)記分子iNOS和CD11c的水平顯著增加，而IL-37 (IL-37 LPS IFN-γ組) 可顯著抑制 iNOS (圖 2A) 和 CD11c (圖 2B) 的表達(dá)。此外，在M1 巨噬細(xì)胞中用 IL-37 處理后，促炎細(xì)胞因子 MCP-1 和 IL-6的水平在細(xì)胞裂解物(圖 2C、D) 和上清液 (圖 2E、F) 中顯著降低。這些結(jié)果表明 IL-37 能夠抑制巨噬細(xì)胞向M1表型極化并減輕炎癥。② IL-37 上調(diào) M2 表型標(biāo)志物表達(dá)
為了確定 IL-37 在 M2 極化中的作用，進(jìn)一步分析了 M2 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物 CD206 和 IL-10 的細(xì)胞水平。M0巨噬細(xì)胞在LPS IFN-γ 處理后表達(dá)較少的 CD206，而 經(jīng)IL-37 預(yù)處理后 CD206 的表達(dá)上調(diào)（圖 3A）。ELISA結(jié)果顯示IL-37 處理組（IL-37 LPS IFN-γ）上清液中抗炎因子 IL-10的水平較高，而未經(jīng) IL-37 處理的LPS IFN-γ組中 IL-10 的水平極低 (圖 3B)。該部分的結(jié)果提示 IL-37 能夠以某種方式抑制巨噬細(xì)胞M1型極化、促進(jìn) M2 型極化。 5.3 “進(jìn)一步研究 IL-37調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制” ① IL-37 通過(guò) NF-κB 通路抑制 M1 巨噬細(xì)胞極化
NF-κB 是一種調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的重要信號(hào)分子，研究者進(jìn)一步檢測(cè)了 M1巨噬細(xì)胞（LPS IFN-γ誘導(dǎo)）中 NF-κB 的激活情況（磷酸化），結(jié)果：如圖4A所示，NF-κB p65磷酸化在0.5小時(shí)時(shí)顯著增強(qiáng)，在4、8和24小時(shí)時(shí)也檢測(cè)到明顯增強(qiáng)的NF-κB p65磷酸化。為了進(jìn)一步證實(shí) NF-κB 在調(diào)節(jié) M1 巨噬細(xì)胞極化中的作用，用NF-κB 抑制劑 BAY11-7082 預(yù)處理M0巨噬細(xì)胞1h后，LPS IFN-γ 處理前一小時(shí)用 PMA 處理的 THP-1 細(xì)胞 24 H。如圖所示圖 4B，用BAY11-7082處理后iNOS表達(dá)降低。進(jìn)一步在重組 IL-37 存在或不存在的情況下，用 LPS IFN-γ處理M0巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)重組 IL-37 在不同時(shí)間點(diǎn)降低了 NF-κB 磷酸化，除了 0.5 h（圖 4C和圖S3）。這些結(jié)果表明IL-37 可以通過(guò)抑制 NF-κB 通路來(lái)抑制 M1 極化。② IL-37 通過(guò) Notch1 信號(hào)通路調(diào)節(jié) M1 巨噬細(xì)胞極化如圖5A所示, M0巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS IFN-γ 刺激后 Notch1 細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域 (NICD1) 的表達(dá)在 4 小時(shí)后顯著上調(diào)。為了確定 Notch1 信號(hào)通路是否調(diào)節(jié) M1 巨噬細(xì)胞極化，進(jìn)一步使用 γ分泌酶抑制劑DAPT來(lái)抑制Notch1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD1)的產(chǎn)生(圖5B)。有趣的是，用DAPT預(yù)處理后M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子iNOS的水平明顯降低(圖5C)，提示Notch1途徑在介導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極化中具有重要作用。為了進(jìn)一步探索 IL-37 是否通過(guò) Notch1 通路抑制 M1 巨噬細(xì)胞極化，在 LPS IFN-γ 刺激前1h用重組 IL-37（0.1 ng/ml）進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果顯示 IL-37 在不同時(shí)間點(diǎn)顯著降低了 NICD1 的產(chǎn)生，抑制了 Notch1 通路的激活(圖 5D)。這些發(fā)現(xiàn)表明 IL-37 可通過(guò) Notch1 通路調(diào)節(jié) M1 巨噬細(xì)胞極化。③ IL-37 通過(guò) Notch1 /NF-κB 信號(hào)通路調(diào)節(jié) M1 巨噬細(xì)胞極化之前的研究表明，Notch1 可通過(guò) NF-κB 通路調(diào)節(jié)LPS 誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng) ( Zeng et al., 2012 )。為了確定Notch1在NF-κB激活中的作用，在LPS IFN-γ誘導(dǎo)極化前，用DAPT預(yù)處理M0巨噬細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制Notch1，NF-κB磷酸化顯著降低(圖5E)。此外，如圖4A，5A所示，在LPS IFN-γ處理后，從4–24小時(shí)開(kāi)始，NF-κB激活與Notch1激活一致。這些證據(jù)表明Notch1信號(hào)通路調(diào)節(jié)NF-κB通路激活進(jìn)而調(diào)控M1巨噬細(xì)胞極化。因此，IL-37可以通過(guò)抑制Notch1通路降低NF-κB的活化。該部分實(shí)驗(yàn)闡明了三個(gè)基礎(chǔ)問(wèn)題，IL-37可通過(guò)調(diào)控 Notch1 通路影響巨噬細(xì)胞極化、IL-37可通過(guò)調(diào)控 NF-κB 通路影響巨噬細(xì)胞極化、Notch1通路可通過(guò)NF-κB通路調(diào)控巨噬細(xì)胞極化。綜合結(jié)果，證實(shí)了IL-37通過(guò)Notch1/NF-κB通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制。
該研究表明，與正常主動(dòng)脈瓣相比，鈣化主動(dòng)脈瓣中呈現(xiàn) IL-37 表達(dá)下調(diào)、 M1巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增多，處于促炎狀態(tài)。重組IL-37可通過(guò)Notch1-NF-κB軸通路抑制M1巨噬細(xì)胞極化，發(fā)揮抗炎作用?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明 IL-37 具有通過(guò)抑制 M1 巨噬細(xì)胞極化來(lái)減弱 CAVD 進(jìn)展的潛力。整體來(lái)看，本文的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并不算復(fù)雜，首先通過(guò)免疫組化等實(shí)驗(yàn)的結(jié)果引出疾病進(jìn)展、巨噬細(xì)胞極化、以及IL-37之間可能存在關(guān)聯(lián)的假設(shè)，而后通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證'IL-37可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化'，最后進(jìn)一步探索調(diào)控機(jī)制，結(jié)合既往研究和文獻(xiàn)，將IL-37與巨噬細(xì)胞極化相關(guān)的經(jīng)典通路聯(lián)系起來(lái)，一步步驗(yàn)證“IL-37通過(guò)Notch1/NF-κB軸通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化”。
本文涉及的實(shí)驗(yàn)技術(shù)大多為生物醫(yī)學(xué)常用的技術(shù)，有興趣入門(mén)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的小伙伴們可以參考學(xué)習(xí)~
本站僅提供存儲(chǔ)服務(wù)，所有內(nèi)容均由用戶(hù)發(fā)布，如發(fā)現(xiàn)有害或侵權(quán)內(nèi)容，請(qǐng)
點(diǎn)擊舉報(bào)。
