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該研究團隊發(fā)現(xiàn)：在缺氧條件（危險信號）下，MBD2的不同剪接體表達受到影響，即缺氧條件使得具有促進腫瘤轉(zhuǎn)移的、長鏈剪接體MBD2a高表達，而具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的、短鏈剪接體MBD2c低表達（現(xiàn)象）。如圖1所示，缺氧條件下，活化的缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1通過抑制剪接因子SRSF2介導(dǎo)的選擇性剪接促進MBD2a的產(chǎn)生，MBD2a與MBD2c競爭性結(jié)合啟動子CpG島，導(dǎo)致FZD1啟動子區(qū)域甲基化的CpG（mCpG）島減少、非甲基化的CpG島增加，F(xiàn)ZD1的表達不再受抑制，從而促進EMT和腫瘤轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)移機制）。臨床數(shù)據(jù)也顯示：MBD2兩種剪接體在調(diào)節(jié)人乳腺癌轉(zhuǎn)移方面的作用也是相反的（臨床數(shù)據(jù)支持）。

圖 1

其一，分子機制研究可以通過高通量如測序、質(zhì)譜、芯片等方法初步篩選，或者從文獻中尋找思路，如果能從目的基因結(jié)構(gòu)和蛋白功能結(jié)構(gòu)域來闡釋實際的臨床現(xiàn)象，往往會更具說服力。文章所涉及的目的基因MBD2是甲基化的CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域（methyl-CpG binding domain，MBD）家族成員之一，是影響DNA甲基化的閱讀器（reader）。

MBD2包含在靶向腫瘤抑制基因、超甲基化啟動子的核小體重構(gòu)和脫乙酰酶（nucleosome remodeling and deacetylase，NuRD）復(fù)合物中，以介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄沉默（圖2）²。從蛋白結(jié)構(gòu)分析，NuRD復(fù)合物包含6個核心亞基。其中兩個具有酶促功能亞基為：具有ATP依賴的染色質(zhì)重塑活性的Mi-2α和Mi-2β亞基；具有催化蛋白質(zhì)脫乙酰基作用的組蛋白脫乙?；窰DAC1、HDAC2。非酶亞基包括mCpG結(jié)構(gòu)域MBD2、MBD3，轉(zhuǎn)移相關(guān)亞基MTA1、MTA2和MTA3，成視網(wǎng)膜細胞瘤結(jié)合蛋白RBBP4、RBBP7（也稱為RBAp46、RBAp48）以及GATAD2A、GATAD2B（也稱為p66α、p66β）。MBD長鏈亞型MBD2a在N端有一個甘氨酸-精氨酸（GR）富集區(qū)域和MBD結(jié)構(gòu)域，C端有一個招募HDAC的轉(zhuǎn)錄抑制域（TRD），而短鏈亞型MBD2c擁有相同的MBD結(jié)構(gòu)域，但在C端有所不同（如圖1，MBD2結(jié)構(gòu)示意圖所示）。MBD2a與NuRD復(fù)合物相互作用，MBD2c缺少TRD結(jié)構(gòu)域而不具有上述與NuRD 復(fù)合物的相互作用³。

圖2  MBD2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制²

其二，已有文獻報道³雖然MBD2a和MBD2c均富集于OCT4和NANOG啟動子，但是兩個剪接體在多能干細胞自我更新及纖維母細胞重編程過程中所起的作用不同：MBD2a通過與抑制性NuRD染色質(zhì)重塑因子相互作用促進hPSC分化，而MBD2c促進成纖維細胞重編程為多能性。這兩個剪接體在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中的作用是怎樣的，有待進一步探究。

其三，前期的乳腺癌細胞實驗發(fā)現(xiàn)，在侵襲水平高的乳腺癌細胞系較中等侵襲水平的乳腺癌細胞系MBD2a高表達、而MBD2c低表達。

1. MBD2亞型結(jié)構(gòu)域功能已較為明確，結(jié)合已有研究得知：TRD是MBD2a唯一區(qū)別于MBD2c的結(jié)構(gòu)域（圖3），通過招募HDAC參與轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)控；FZD1是Wnt/β-catenin通路和EMT的調(diào)節(jié)因子，在此作者只證明了MBD2a、MBD2c是否競爭性結(jié)合FZD1 mCpG區(qū)域。

圖3.MBD2的外顯子和MBD2蛋白亞型的結(jié)構(gòu)域³

通過在MDA-MB-231細胞中過表達Flag-MBD2a，同時在有或沒有GFP-MBD2c過表達的情況下，采用ChIP-seq的方法，用Flag抗體下拉，計算功能元件區(qū)域富集信號豐度；用相反的方式驗證MBD2a是否影響MBD2c的豐度。熱圖（圖4 A）、富集輪廓圖（圖4 B）表明，MBD2a和MBD2c存在競爭性結(jié)合。進一步地，ChIP-seq發(fā)現(xiàn)與兩種剪接體都存在結(jié)合關(guān)系的基因3138個，RNA-seq找到調(diào)節(jié)兩個剪接體的共同基因1390個，取交集后得到174個基因（圖4 C）。說明二者有著許多相同的基因結(jié)合區(qū)域。

圖 4

為了明確FZD1具體的啟動子結(jié)合區(qū)域，采用IGV（Integrative Genomics Viewer）工具對FZD1基因組進行可視化，IGV分析顯示MBD2c過表達顯著降低了FZD1基因高CpG密度區(qū)域上MBD2a的結(jié)合，同時MBD2a過表達也顯著降低FZD1基因高CpG密度區(qū)域上MBD2c的結(jié)合。并初步選擇3個潛在的作用位點，用ChIP-qPCR方法驗證三位點的有效性（圖5 D、E）。

圖 5

2. 我們不妨去思考下，當上述乳腺癌轉(zhuǎn)移的蛋白亞型功能結(jié)構(gòu)域并不明確時，如何證明？常規(guī)思路是采用基因工程的方法構(gòu)建突變體蛋白/截短蛋白，結(jié)合功能實驗確定功能性結(jié)構(gòu)域。如下圖6，另一篇文章中，通過基因插入、插入/刪除終止子、基因敲除的方法構(gòu)建基因突變體，細胞轉(zhuǎn)染或感染后檢測細胞某種功能，以此判斷蛋白亞型的功能性結(jié)構(gòu)域⁴。

圖 6

前面介紹了MBD2是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子。但是，實驗結(jié)果卻表明MBD2a在轉(zhuǎn)錄水平上正調(diào)控FZD1，該如何理解呢？已有報道證明MBD2a作為DNA去甲基酶，通過去除抑制性甲基殘基而上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子uPA和Foxp3的表達，從而引起啟動子特異性基因轉(zhuǎn)錄激活。此外，據(jù)推測MBD2募集了激活因子來啟動基因表達。MBD2與CEBPA、MBDin、TACC3、FAK / PYK2、NGFI684 A等蛋白形成復(fù)合物，在多數(shù)情況下，上述激活因子與含HDAC的復(fù)合物互斥，因此即使在最終去甲基之前也可解除MBD2的抑制作用。目前，MBD2a直接去甲基化還是通過募集去甲基化酶促進FZD1的表達還不明確。

作者通過BSP克隆測序法或甲基化特異性PCR（MSP）檢測到MBD2a敲減或MBD2c過表達時，F(xiàn)ZD1的甲基化水平增加。而在培養(yǎng)基中加入DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑DAC后，F(xiàn)ZD1的甲基化水平升高被逆轉(zhuǎn)，這導(dǎo)致FZD1 mRNA水平升高。因此，當MBD2剪接變體的表達變化時，F(xiàn)ZD1啟動子的甲基化狀態(tài)改變可能是導(dǎo)致FZD1 mRNA表達變化的原因。

與MBD2a相比，關(guān)于MBD2c在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用或MBD2c如何調(diào)節(jié)基因表達作用的研究相對較少。通過該研究發(fā)現(xiàn)：1）MBD2c是轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移性乳腺癌潛在的分子標記物；2）提出MBD2c與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的新見解并初步闡明機制。

但不足的是，該研究并未闡釋MBD2c在乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的詳細機理信息，例如MBD2a/c對mCpG的競爭性結(jié)合、FZD1甲基化、FZD1表達、FZD1介導(dǎo)的β-catenin、Snail1表達等發(fā)生的先后順序。有待采用晶體結(jié)構(gòu)分析和其他實驗進一步闡明，對于臨床干預(yù)具有重要的參考價值。

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