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艱難梭菌感染（CDI）是全球醫(yī)院GI感染的主要原因，其在全球范圍內的發(fā)病率呈上升趨勢，而復發(fā)性CDI（rCDI）的一種重要的治療策略是糞便微生物群移植（FMT）。研究人員認為糞便菌群移植（FMT）能有效治療復發(fā)性艱難梭菌感染（rCDI），但其作用機制尚不清楚，而且某些膽汁酸會影響艱難梭菌的發(fā)芽或營養(yǎng)生長。為研究微生物膽汁酸水解酶在治療復發(fā)性艱難梭菌感染中的效果，研究人員在使用FMT之前和之后從患者和供體收集的糞便進行rCDI，隨后進行了管家基因測序和超高效液相色譜質譜（UPLC-MC）膽汁酸譜分析，BSH活性測定以及參與膽汁代謝的bsh/baiCD基因的qPCR分析，最后通過tCDI小鼠模型實驗分析了人類腸道菌群的微生物BSH（膽汁鹽水解酶）。結果表明從元分類學上看，與FMT后相比，FMT之前的糞便顯示產生BSH細菌的比例減少。 FMT前的糞便中富含?；悄懰幔═CA，強效艱難梭菌發(fā)芽劑）； TCA水平與含有BSH的生物的關鍵細菌屬負相關。與預處理相比，FMT后樣品顯示了恢復的BSH活性和bsh/baiCD基因拷貝數（p <0.05）。在分批培養(yǎng)中，相對于野生型（BSH）培養(yǎng)物上清液，來自工程表達bsh的大腸桿菌和天然產生BSH的生物（卵形擬桿菌、擬桿菌、擬桿菌、尋常型桿菌）的上清液可降低TCA介導的艱難梭菌萌發(fā)。與表達BSH陰性大腸桿菌的小鼠相比，在表達高活性BSH的大腸桿菌給藥后，在rCDI小鼠模型中，艱難梭菌的總存活數減少了約70％（p <0.05）。本研究最總揭示了腸道BSH功能的恢復有助于FMT治療rCDI。

本研究收集了共43名參與者的糞便樣品，包括具有rCDI的26名參與者（在FMT之前和FMT之后的8-12周收集的樣本）和FMT供體的17名參與者，依據臨床實驗室的標準診斷出rCDI，并用加拿大的隨機樣本中的rCDI的分析驗證了初步的結果。隨后取這些糞便樣本250mg提取DNA，并進行16s rRNA測序，利用相關軟件初步進行了元分類學分析，并利用Piphillin19預測了微生物群落的膽汁代謝能力。隨后，將處理過的糞便樣品利用超高效液相色譜法分析膽汁酸，同時采用qPCR對BSH特定的基因豐度和活性進行分析。分批培養(yǎng)艱難梭菌，并建立小鼠復發(fā)感染模型，以最終評估微生物膽汁酸水解酶對艱難梭菌的治療效果。

1 FMT對rCDI的成功應用與所有BSH組的BSH生產性腸道微生物群落成員的恢復有關

與FMT前樣品相比，健康供體的糞便微生物群落中富集的細菌種類具有一系列BSH生產性生物，包括第1組（卵形擬桿菌，q=0.017;統(tǒng)一桿菌，q=0.007），第2組（齒狀雙歧桿菌，q=0.014;嗜氣雙歧桿菌，q=0.009;長雙歧桿菌，q=0.011）和第3組（尋常型擬桿菌＝0.003；糞腸桿菌，q＝0.003；直腸真細菌，q＝0.005；歐白布拉提菌，q＝0.014）（圖2A）。同樣，與FMT前相比，FMT后糞便菌群中富集的細菌種類也包括所有BSH組的成員，包括第1組（統(tǒng)一桿菌，q=0.005；卵形擬桿菌，q=0.009；副桿菌屬，q=0.003），第2組（好氧桿菌（柯林塞拉菌），q=0.006;齒狀雙歧桿菌，q=0.029）和第3組（擬桿菌屬，q=0.002;直腸真細菌，q=0.004; 歐白布拉提菌，q=0.009; 糞腸桿菌，q=0.003）（圖2B）。

使用皮菲林從代謝組學數據推斷宏基因組學含量，與FMT之前的樣品相比，預測代表BSH和7-α-脫羥基酶的序列的比例顯著降低。但與FMT之前相比，FMT之后的樣本均顯著增加。

圖1 BSH對rCDI小鼠模型的影響

圖2 rCDI患者與供體或FMT后的16S rRNA基因測序數據的物種差異

2 FMT治療rCDI的成功與恢復正常腸道膽汁酸前體有關，包括TCA的持續(xù)降低

在對UPLC-MS膽汁酸譜數據進行多變量分析時，無監(jiān)督主要成分分析表明供體和FMT后樣品聚類，但兩組均與FMT前樣品清晰分離（圖3A）。在對潛在結構判別分析（OPLSDA）進行正交投影的情況下進行監(jiān)督分析，以確定造成供體與FMT前組之間差異的特征以及FMT前與FMT后組之間的差異（圖3B））。由OPLS-DA模型數據可知，與FMT后和健康人相比，FMT之前的樣品顯示出初級膽汁酸（包括共軛和非共軛形式）的富集，以及次級膽汁酸的損失。

單變量分析驗證了這些現象。與健康的供體樣品相比，FMT之前的樣品顯示出TCA富集和DCA丟失（p <0.01，Mann-Whitney U檢驗），而FMT之后的樣品的特征是兩種膽汁酸均恢復到與供體可比的水平（p <0.001，Wilcoxon進行秩和檢驗。

圖3 FMT CDI對大便膽汁酸譜的影響

3 整合元分類學和膽汁酸分析數據

rCCA模型用于整合元分類學和膽汁酸分析數據。單位表示圖顯示了FMT之前和FMT之后樣品的明顯分離，但供體和FMT之后樣品之間有相當大的重疊（圖4A）。相關圓圖表明，TCA水平與細菌屬和擬桿菌屬的豐度之間呈負相關，在代謝組學數據中，這兩個都已知包括代表性的產生BSH的生物，在FMT后顯著增加（圖4B）。此外，梭狀芽孢桿菌簇XIVa（已知含有產生7-α-脫羥基酶的生物）與仲膽汁酸DCA和石膽酸之間存在正相關關系（圖4B）。

圖4 關聯16S rRNA基因測序數據（屬水平）和膽汁酸數據的有序化CCA（rCCA）模型

4 成功進行rCDI的FMT可以恢復腸道bsh基因的拷貝數和BSH酶活性

與健康供體相比，在一系列bsh基因組中，FMT前樣品中的bsh基因拷貝數顯著減少（p<0.001，Mann-Whitney U檢驗，圖5A–C）。成功的FMT與測定的所有bsh基因組的拷貝數顯著增加（p<0.05，Wilcoxon簽名秩和檢驗，圖5A-C）相關，達到與健康供體相似的水平。同樣，FMT前樣品中baiCD操縱子（編碼有助于7-α-脫羥基化的酶）的拷貝數比健康供體的拷貝數顯著低（p<0.01），但在FMT后也顯著富集（p＜0.05，圖5D）。注意到供體和FMT后baiCD的基因拷貝數明顯低于相同參與者測定的每個bsh基因的拷貝數。糞便中的BSH酶活性顯示出與bsh基因拷貝數相同的模式（圖5E）。

為了進一步探討FMT后腸道膽汁酸/BSH變化的時間尺度，研究人員分析了在結腸鏡檢查與膠囊FMT的隨機試驗中從患者收集的系列糞便樣本作為rCDI的治療，以及供體樣本和FMT漿液本身。這表明BSH活性在FMT成功后的一周內恢復到了與供體相當的水平（糞便中TCA水平大大降低），并在FMT后4周和12周保持在這些水平（圖6A，B）。同樣，與供體糞便或FMT漿液相比，FMT前樣品中的BSH活性顯著降低（圖6B）。

圖5 FMT對膽汁代謝酶基因拷貝數和BSH酶活性的影響

圖6 FMT后rCDI?；悄懰岷虰SH活性的變化

5 單獨的BSH活性足以在體外完全抑制TCA介導的艱難梭菌萌發(fā)

實驗數據表明，成功的FMT、TCA分解和腸道BSH產生微生物的恢復與BSH功能之間存在關聯。為了進一步探討這些變化是否純粹是關聯性的或代表真實的機理途徑，研究人員進行了艱難梭菌分批培養(yǎng)發(fā)芽實驗。

通過將肉湯中的目標細菌與1％w/v TCA孵育來制備用過的培養(yǎng)上清液。過夜溫育后，將培養(yǎng)物離心并過濾滅菌。艱難梭菌孢子在補充了用過的培養(yǎng)上清液的sBHI肉湯中孵育。使用此設置，與無BSH活性的用過的培養(yǎng)上清液一起培養(yǎng)的艱難梭菌孢子將具有可用的TCA刺激萌發(fā)并因此生長，而與具有BSH活性的用過的培養(yǎng)上清液一起培養(yǎng)的艱難梭菌孢子將沒有可用于刺激萌芽的TCA，并且不會增長。

最初，將艱難梭菌孢子與已經與TCA一起孵育的表達BSH的微生物用過的上清液一起孵育。所選擇的微生物是與供體或FMT后樣品相比在FMT前患者腸道菌群中平均比例降低的微生物，這些微生物共同代表了大多數BSH組。對于所有測定的艱難梭菌核型，來自每個產生BSH的微生物肉湯的上清液均顯著降低了艱難梭菌的發(fā)芽率（p<0.0001）（圖7A）。作為對照，研究人員使用了來自TCA補充肉湯的無花上清液，其中已培養(yǎng)了營養(yǎng)艱難梭菌（菌株DS1864）；這未能影響艱難梭菌的發(fā)芽。

研究人員評估了僅BSH能否介導這種抑制作用，還是它反映了培養(yǎng)物中細菌代謝的另一個方面。對于后續(xù)的分批培養(yǎng)，目的菌株包括野生型大腸桿菌（缺少bsh基因）或已克隆了bsh基因的兩種形式的大腸桿菌（例如，包含bsh的大腸桿菌BSHlow'帶有針對共軛膽汁酸的底物范圍較窄的基因；以及“大腸桿菌BSHhigh”，包含具有高甘氨酸和?；撬崛ソY合活性的bsh基因。盡管來自野生型/ BSH陰性大腸桿菌培養(yǎng)的廢上清液不影響艱難梭菌的發(fā)芽能力，但兩種表達bsh基因的大腸桿菌的艱難梭菌都顯著降低了所有受試核糖體的艱難梭菌發(fā)芽率（p <0.0001，t檢驗）（圖7B）。與大腸桿菌BSHlow相比，在添加有BCAhigh批次大腸桿菌的TCA上清液中孵育時，所有三種核糖型的艱難梭菌發(fā)芽率均顯著降低（p<0.05）。

艱難梭狀芽孢桿菌的芽孢也培養(yǎng)在已經與TCA一起孵育或與表達BSH的大腸桿菌共培養(yǎng)的來自中華梭狀芽孢桿菌的廢上清液中。枯萎梭菌的上清液本身并不影響艱難梭菌的萌發(fā)能力，但是當梭菌與表達BSH的大腸桿菌共同孵育時，發(fā)芽率顯著降低（p <0.01）（圖7C）。

通過UPLC-MS進行的分析證實，補充了TCA的分批培養(yǎng)基（包括來自野生型/BSH陰性大腸桿菌，艱難梭菌和梭狀芽胞桿菌培養(yǎng)物的上清液）具有較高的TCA：CA比，這些分批培養(yǎng)物中沒有BSH活性。對于所有其他分批培養(yǎng)，TCA：CA比值均較低，表明存在BSH活性。所有其中艱難梭狀芽胞桿菌發(fā)芽被抑制的分批培養(yǎng)實驗均以上清液中DCA的水平未檢測到為特征（除了含有艱難梭狀芽孢桿菌和表達BSH的大腸桿菌的分批培養(yǎng)，其中可檢測到DCA）。發(fā)現來自第1、2和3組的產生BSH的微生物的分批培養(yǎng)物的無菌過濾廢上清液具有與健康人糞便中相當的BSH活性。

圖7 艱難梭菌分批培養(yǎng)

6 BSH限制了rCDI小鼠模型中CDI的進一步復發(fā)

為了研究BSH產生細菌限制rCDI受試者疾病進一步復發(fā)的假說，研究人員對野生型/BSH陰性大腸桿菌施用了約10⁹CFU萬古霉素后不久，將大腸桿菌BSHhigh（兩組均n = 5）轉入rCDI小鼠模型（圖1A）。研究人員使用此特定協議旨在描述對rCDI患者進行FMT管理的動態(tài)。3天后證明所有艱難梭菌在小鼠定植。艱難梭菌的孢子給藥，平板計數用于確認對小鼠給藥的大腸桿菌的效價。通過在選擇性培養(yǎng)基上的板計數來評估小鼠腸道的大腸桿菌定植；研究人員確定，在第12天（即首次施用大腸桿菌后3天），兩組小鼠中的大腸桿菌定植水平處于可比的高水平（施用大腸桿菌的小鼠每克糞便中的平均CFU為1.49×10⁹）在給予野生型大腸桿菌的小鼠中（圖1B）。與給予野生型/BSH陰性大腸桿菌的小鼠相比，給予大腸桿菌BSHhigh的小鼠中的艱難梭菌TVC顯著降低（圖1C；每克糞便的平均CFU為6.92×10⁷對2.70。×10⁸；p <0.05，Mann-Whitney U檢驗），相當于艱難梭菌營養(yǎng)植物總計數減少約70％。

在這項研究中，研究人員首次證明了FMT治療rCDI功效的關鍵機制是腸道菌群BSH功能的恢復。對人體樣品的分析表明，該功能在FMT早期得以恢復，并在整個過程中得以保持。此外，來自分批培養(yǎng)和小鼠模型的數據表明，主要艱難梭菌萌發(fā)劑TCA的BSH介導的水解足以完全抑制艱難梭菌萌發(fā)，并在rCDI范圍內限制了疾病的進一步復發(fā)。腸道BSH功能的靶向修復是rCDI的一種新型治療方法，可避免與FMT相關的風險。

腸道微生物群-宿主膽汁酸相互作用在CDI發(fā)病機理中的潛在作用一直是人們關注的領域，因為體外初步研究表明，各種膽汁酸會差異地影響艱難梭菌的發(fā)芽和營養(yǎng)生長能力。此外，研究人員最近還證明，成功進行rCDI的FMT與X受體（FXR）信號的刺激有關，它本身似乎影響膽汁酸環(huán)境，進而影響小腸的腸道菌群。隨后的研究表明無菌和經抗生素治療的小鼠的腸道，以及CDI8或具有rCDI39 的人類的恒化器模型，糞便中的初級膽汁酸（特別是共軛形式）富集，而次級膽汁酸的損失與膽汁酸rFDI患者通過FMT恢復體內穩(wěn)態(tài)。艱難梭菌孢子暴露于螞蟻的膽汁酸環(huán)境中經抗生素治療的小鼠盲腸或FMT41的人類糞便足以引起孢子萌發(fā)，而未經抗生素治療的小鼠盲腸或FMT41以后的人類糞便足以阻止艱難梭菌的萌發(fā)和營養(yǎng)生長。

嚙齒動物研究表明，產生7-α-脫羥酶的生物（特別是閃爍梭狀芽孢桿菌）可以部分保護宿主免受CDI的侵害。然而，迄今為止，尚無足夠證據證明7-α-脫羥酶脫羥基酶負責FMT對rCDI的功效。例如，用六種細菌的混合物成功治療了CDI小鼠模型，其中沒有一種細菌被認為具有7-α-脫羥基酶活性。此外，在CDI和C病患者的糞便中baiCD基因的豐度沒有差異。艱難梭菌陰性患者（校正總細菌負荷后），成功進行rCDI FMT后，糞便中不能始終檢測到baiCD基因；一項使用微生物測序和培養(yǎng)的研究顯示了可比的結果。這項研究的重點是關于rCDI中BSH的動力學以及FMT對BSH功能的影響。Allegretti及其合作者先前證明，與健康對照或首次使用CDI的患者相比，rCDI患者的糞便菌群中預測的BSH功能顯著降低。先前的數據表明，成功進行rCDI的FMT后，產生BSH的微生物和相關的BSH功能得以恢復。從FMT前的極低水平回落到類似于捐助者的水平。該結果與共軛膽汁酸的損失，尤其是發(fā)芽的TCA的損失有關。

在患有rCDI的動物模型中，萬古霉素治療后，艱難梭菌的營養(yǎng)細胞很少保留在腸道中。為了進一步復發(fā)，TCA介導的艱難梭菌萌發(fā)可能是關鍵的促成因素。分批培養(yǎng)和小鼠模型數據表明BSH水解TCA足以顯著限制rCDI中的艱難梭菌計數。迄今為止，尚未在小鼠中報告過任何研究表明單獨恢復7-α-脫羥基酶活性可以降低艱難梭菌的生長。雖然已經表明，TCA的降解是恢復BSH限制rCDI進一步復發(fā)的主要機制，但另一個機制可能是BSH產生了更大的去結合的初級膽汁酸庫，這是進一步腸道細菌酶降解和轉化的底物考慮到結腸內目前存在的缺點。

本研究首次提供了微生物BSH是FMT對rCDI功效的關鍵介質的證據。這論證了其他最近的數據，表明FMT通過逆轉“代謝性營養(yǎng)不良”發(fā)揮作用，包括通過恢復短戊酸脂肪酸酯來有效地抑制艱難梭菌的生長，而對腸道共生細菌沒有任何明顯的不利影響。此外，這些數據進一步提供了越來越多的證據，證明了腸道菌群-膽汁酸相互作用在定植抗性中的重要意義，并證明了BSH的靶向修復可能是針對CDI的新型療法或預防策略，可避免CDI的風險。