當你的才華還撐不起你的野心時，請潛下心來，腳踏實地，跟著我們慢慢進步。不知不覺在單細胞轉錄組領域做知識分析也快兩年了，通過文獻速遞這個欄目很幸運聚集了一些小伙伴攜手共進，一起成長。
文獻速遞欄目通過簡短介紹，擴充知識面，每天關注，希望你也能有所收獲！
摘要
這篇文章主要是開發(fā)了一種叫做LIGER的算法，這個算法可以靈活快速定義細胞類型。并在四個不容易分析的人鼠腦細胞實驗中測試了該算法的實用性。
最后，我們將小鼠皮質scRNA-seq譜與單細胞DNA甲基化特征整合，揭示了細胞類型特異性基因調控的機制。使用LIGER算法的整合分析有望加速細胞類型定義，基因調控和疾病狀態(tài)的單細胞研究。
LIGER算法簡介
可以做的事：將單細胞數據集與共享和數據集特定因子進行比較和對比
思路：從多組輸入的數據中挑出一組共同的潛在因子，這些因子代表了每個數據集中相同的生物“信號”，但同時也保留了數據集的差異。為的是用這些因子聯(lián)合識別細胞類型，以及識別和保留細胞類型特異性的差異。
做法：LIGER首先采用綜合非負矩陣分解（iNMF）來學習低維空間，獲得一組特異因子，然后采用根據因子的maximum factor loading 構建鄰域圖從而達到降維的目的。
優(yōu)點：可以同時評估同一個數據集中不同細胞集的區(qū)別，以及不同數據集中可能是相同細胞類型的異同。比seurat中的CCA的效果好一丟丟，在數據集之間相似內容越少的時候，LIGER對細胞的聚類分型敏感性越高。
LIGER工作流程(這個是重點)
數據集預處理以生成原始數字基因表達（DGE）矩陣。
可變基因選擇（Saunders等，2018）（https://www.biorxiv.org/content/10.1101/459891v1.full#ref-57），通過UMI的數量標準化，以及個體基因的比例。我們縮放但不以基因表達為中心，因為NMF需要非負值。
通過綜合非負矩陣分解（iNMF）識別共享和數據集特定因子。
聯(lián)合聚類細胞和歸一化因子載荷。
使用t-SNE或UMAP進行可視化并分析共享和數據集特異性標記基因。
LIGER is freely available as an R package: https://github.com/MacoskoLab/liger
具體用于測試LIGER的實驗
1.用10x Chromium V3獲取測序數據，分析了204,737個在BNST的nuclei，初始聚類鑒定出29,547個神經元，其中60.3%是位于BNST區(qū)域的，對BNST區(qū)域的神經元聚類分析，分了28個群
2.通過LIGER發(fā)現了Vipr2的特異表達的集群，Vipr2是涉及晝夜節(jié)律維持和雄性生殖的基因，所以新發(fā)現的ovBNST細胞類型可能具有特異的作用。
3.數據分析：用LIGER分析以鑒定神經元，然后將隨后的分析限制在神經元細胞中，進行了LIGER第二輪分析。然后為了證明差異基因在性別上游顯著差異，進行了bootstrapping procedure(比較復雜的過程，建議自行查看原文~)
1.用10x Chromium V2測量了來自7個個體的黑質（SN）中的43,474個細胞核，確定了24個簇。
2.比較了每個個體組織供體中不同細胞的狀態(tài)，并將細胞類型與小鼠中的細胞類型相關聯(lián)。
3.數據分析：LIGER同樣進行了兩輪聚類，首先鑒定了主要細胞類型（神經元，內皮細胞，星形膠質細胞，少突膠質細胞和小膠質細胞）然后再次聚類每種細胞類型，以確定這些類別中的其他亞結構。而跨物種分析，則使用Jackson Laboratories注釋, 然后使用LIGER分別整合每個廣泛的細胞類別，強調使用的是兩個數據集特定的因子矩陣（每個物種一個）。至于鑒定具有跨物種保守表達的GOtrem，作者們使用GOrilla(默認設置)進行GO富集分析和并用ReviGO總結和可視化結果。
1.使用到了兩個數據集，用Drop-seq檢測的額葉皮質scRNA-seq數據和STARmap生成的同一組織的原位空間轉錄組數據。細胞數量分別是71,000 scRNA-seq對2500 STARmap。
2.聯(lián)合分析得到的細胞亞型的分類與小鼠額葉皮層空間定位存在緊密關聯(lián)。
3.數據分析：使用LIGER進行了兩個級別的分析，首先共同鑒定廣泛的細胞類別，然后對興奮性神經元，抑制性神經元和神經膠質進行第二輪LIGER分析。
1.使用兩個數據集：Drop-seq測了58330細胞的基因表達+ 3,378細胞的genome-wide DNA甲基化
2.與已經報道的整合結果進行比較，揭示了細胞類型特異性基因調控的機制
3.數據分析：通過使用公布的簇分別對甲基化和RNA數據進行Kruskal-Wallis檢驗來選擇基因，然后取得前8000個RNA和甲基化標記的交集。使用methylpy Python軟件包計算甲基化數據原始分析中鑒定的差異甲基化區(qū)域的甲基化水平，使用FIMO(默認設置)進行轉錄因子結合分析， binding motifs用的是最新版本的非冗余JASPAR數據庫中的數據，用annotate R包注釋DMRs。
總結
LIGER首先可以通過非負性約束（即，metagene表達水平從不為負）產生可解釋的因子，使得每個因子通常對應于生物學上有意義的信號，定義特定細胞類型的基因集合；然后可以識別在空間位置具有差異的細胞集群；最后憑借對共享和數據集特定因素的推斷，可以更加透明和細致的定義細胞。總之就是能更加準確穩(wěn)定的結合多組數據對細胞進行分類
臨床意義
可用于鑒定疾病相關的細胞狀態(tài)、表觀基因組和轉錄組數據集的整合分析等
聯(lián)系客服
