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1986年，世界上首個(gè)單克隆抗體藥物——抗CD3單抗OKT3獲得美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）的上市批準(zhǔn)，單克隆抗體藥物產(chǎn)業(yè)化從此拉開序幕。作為主要應(yīng)用于惡性腫瘤、自身免疫性疾病、炎癥性疾病等治療領(lǐng)域的抗體類藥物，目前，全球已經(jīng)批準(zhǔn)的單克隆抗體藥物超過了80個(gè)，年銷售額增長(zhǎng)率超過30%，單克隆抗體在生物制藥領(lǐng)域發(fā)展得越來(lái)越快。隨著抗體工程的發(fā)展，嵌合單克隆抗體以及人源化單克隆抗體相繼問世，而以B淋巴細(xì)胞cDNA庫(kù)和噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展使全人源單克隆抗體成為可能，第一支全人源單克隆抗體——阿達(dá)木單抗(adalimumab)已成功研制并于2002年由FDA批準(zhǔn)上市。全人源單克隆抗體具有良好的功效，且無(wú)副作用，已成為當(dāng)前發(fā)展最迅速的一類單克隆抗體藥物。

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單克隆抗體是蛋白類大分子，具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)特征，主要由Fab和Fc兩大功能區(qū)組成，在Fab段和Fc段特定的位點(diǎn)存在糖基化修飾。糖基化修飾形成的糖鏈僅僅占整個(gè)單克隆抗體的3%，盡管比例不高，但糖鏈結(jié)構(gòu)卻發(fā)揮著極其重要的作用：能夠維持抗體的空間構(gòu)象、穩(wěn)定抗體的結(jié)構(gòu)，研究表明抗體脫糖基化后對(duì)熱的穩(wěn)定性大大降低；糖鏈結(jié)構(gòu)還能保護(hù)抗體不受某些蛋白酶水解；糖鏈中特別的糖型還與免疫效應(yīng)功能密切相關(guān)，糖型并非在人體內(nèi)生物合成，因此可能具有一定的免疫原性，可加速單抗的血漿清除?？偟膩?lái)說，糖基化修飾不僅對(duì)維持單克隆抗體的結(jié)構(gòu)有重要作用，同時(shí)一些特定的糖基化修飾類型以及不同的糖基化修飾程度均會(huì)影響抗體的安全性特征，而且，糖基化修飾也影響藥物的有效性。

單克隆抗體藥物的糖基化具有高度的異質(zhì)性，在單克隆抗體的糖基化中，由于糖基化種類的多樣性以及連接方式的多樣性，因而形成了自然界中最復(fù)雜和最多樣化的蛋白結(jié)構(gòu)。單克隆抗體藥物的糖基化結(jié)構(gòu)對(duì)于藥物的療效和安全具有重要意義。

圖1：IgG的結(jié)構(gòu)示意圖

有趣的是，盡管單克隆抗體藥物的輕鏈和重鏈的氨基酸序列是對(duì)稱的，但是Fc片段上N端糖基化修飾并非全部都為對(duì)稱。單抗藥物的N端糖基化修飾通常是復(fù)雜的雙天線糖鏈結(jié)構(gòu)，可能發(fā)生巖藻糖化和唾液酸化。通過表1，也可以看到單克隆抗體藥物常見糖基化修飾對(duì)抗體藥物結(jié)構(gòu)和功能有著很大的的影響。

表1：抗體藥物常見糖基化修飾及其對(duì)抗體藥物結(jié)構(gòu)和功能的影響

研究發(fā)現(xiàn)糖鏈中不同末端糖基化對(duì)IgG功能有不同的影響，IgG因不同的連接方式存在3種不同類型的N端糖型，分別為高甘露糖型、甘露糖雜合型、甘露糖復(fù)雜型，大多數(shù)的雜合型和復(fù)雜型存在核心巖藻糖基化，少數(shù)沒有。

圖2 3種不同類型的N端糖型

所以說單克隆抗體藥物糖基化對(duì)于其療效及生產(chǎn)就顯得極為重要，各大生產(chǎn)商都非常重視單克隆抗體藥物糖基化的質(zhì)量監(jiān)控。在抗體藥物生產(chǎn)過程中首選哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中因其具有天然蛋白的加工機(jī)制，當(dāng)然也包括了抗體蛋白的糖基化修飾，這樣所生產(chǎn)出來(lái)的單克隆藥物就與天然的蛋白十分接近，并且保證了治療效果。單克隆藥物的糖基化修飾主要是由寡糖連接到天冬酰胺的側(cè)鏈，即N-連接，或者連接到絲氨酸/蘇氨酸連接，即O-連接，如上文中提到的連接形式及種類。N端或者O端的多糖會(huì)影響單克隆抗體藥物的蛋白活性，同時(shí)也決定了此種單克隆抗體藥物在體內(nèi)的半衰期。正是因?yàn)檫@些特點(diǎn)，抗體藥物的糖型及糖基化修飾備受藥品監(jiān)管部門的重視，力求達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以確保其有效性和安全性。

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，決定單克隆抗體糖基化的主要因素有細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、培養(yǎng)模式、生產(chǎn)工藝、培養(yǎng)基等，這幾個(gè)方面都會(huì)改變抗體糖基化修飾，對(duì)單克隆抗體研究及生產(chǎn)等相關(guān)研究帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。表2列舉了細(xì)胞培養(yǎng)過程中影響抗體蛋白糖基化的各種變量。 

表2 細(xì)胞培養(yǎng)過程中影響抗體蛋白糖基化的變量匯總

接下來(lái)我們將重點(diǎn)對(duì)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、培養(yǎng)模式、 生產(chǎn)工藝、 培養(yǎng)基等影響蛋白藥物糖基化的研究進(jìn)行總結(jié)。

2.1 表達(dá)系統(tǒng)對(duì)抗體藥物糖基化修飾的影響

在抗體藥物研發(fā)階段，研究細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)對(duì)糖基化的影響十分關(guān)鍵。目前，商業(yè)化生產(chǎn)抗體藥物的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)主要是CHO細(xì)胞，少部分使用SP2/0、人纖維肉瘤細(xì)胞、人類淋巴母細(xì)胞、小鼠骨髓瘤細(xì)胞等。有報(bào)道表明CHO懸浮細(xì)胞表達(dá)人β-干擾素與微載體貼壁CHO細(xì)胞表達(dá)的干擾素具有相同的糖型。由相同組織分離的細(xì)胞表達(dá)的功能性酶種類也是多樣化的，從而表達(dá)糖基化蛋白的能力也不同。CHO細(xì)胞中CHO-K1和 DUKX-B11都含有未激活的α(1,3)GalT基因，同樣都有低水平的NGNA，CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在生產(chǎn)抗體藥物時(shí)對(duì)糖基化修飾的影響是最普遍的。

CHO細(xì)胞表達(dá)糖基化的機(jī)制同人類的IgG糖基化作用機(jī)制十分相似，僅有一些微小的不同之處。據(jù)報(bào)道，人的IgG末端唾液酸殘基以α-2,6連接，CHO細(xì)胞來(lái)源的抗體以α-2,3連接。無(wú)論是人的IgG，還是CHO細(xì)胞表達(dá)來(lái)源的抗體，末端唾液酸殘基的含量都很低。因此，唾液酸殘基連接的不同對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量可能不會(huì)造成影響。而且，許多人類血清糖蛋白也含有α-2,3連接的唾液酸殘基。

因此可見，宿主細(xì)胞系極大地影響了單克隆抗體的糖基化修飾類型，進(jìn)而影響單克隆抗體治療相關(guān)的安全性。對(duì)于生物制藥產(chǎn)業(yè)來(lái)說，選擇合適的宿主細(xì)胞系可以優(yōu)化并控制糖基化修飾，進(jìn)而提高產(chǎn)品的質(zhì)量。

2.2 培養(yǎng)模式對(duì)抗體藥物糖基化修飾的影響

細(xì)胞培養(yǎng)方式常見的有三種：批次培養(yǎng)、分批補(bǔ)料培養(yǎng)、灌流培養(yǎng)。不同的細(xì)胞培養(yǎng)方式會(huì)明顯影響單克隆抗體藥物的糖基化修飾，在灌流培養(yǎng)模式下糖基化總體水平較分批補(bǔ)料培養(yǎng)模式下的唾液酸化有所增加?？傮w來(lái)說，連續(xù)灌流培養(yǎng)的糖基化程度較批次培養(yǎng)要高，而批次培養(yǎng)模式下的細(xì)胞增長(zhǎng)速度快，灌流培養(yǎng)模式下細(xì)胞生長(zhǎng)速度越慢糖基化程度越高。當(dāng)然選擇哪一種培養(yǎng)方式取決于所生產(chǎn)的抗體藥物自身糖基化情況。

2.3 生產(chǎn)工藝對(duì)抗體藥物糖基化修飾的影響

細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)參數(shù)對(duì)細(xì)胞表達(dá)的抗體藥物糖基化影響也十分顯著。pH值在6.8～7.8變化時(shí)，半乳糖基化及唾液酸化程度達(dá)到近50%。氧不足同樣會(huì)對(duì)抗體糖基化產(chǎn)生復(fù)雜的影響，溶氧變化在10%～90%時(shí)，半乳糖基化的變化量最大可達(dá)20%，唾液酸化的變化達(dá)30%。培養(yǎng)溫度從37℃降至30℃，唾液酸比例也會(huì)由14%降至8%。降低溫度可以延長(zhǎng)細(xì)胞活力，從而提高所有蛋白表達(dá)，原則上也可以增加抗體糖基化。在生物反應(yīng)器中溫度的改變可以提高單位體積表達(dá)蛋白的活性，同時(shí)可維持糖型質(zhì)量。

此外，生物反應(yīng)器中的剪切力也是一個(gè)非常重要的工程學(xué)變量，可影響抗體藥物糖型修飾。在工藝放大或者現(xiàn)有工藝轉(zhuǎn)移過程中剪切力是需要重點(diǎn)考慮的，監(jiān)測(cè)剪切力對(duì)抗體糖基化不同表型的影響（例如從灌流培養(yǎng)到批式培養(yǎng)），同樣是確保產(chǎn)品一致性非常重要的研究項(xiàng)。

當(dāng)然，細(xì)胞活力也是十分重要的因素，因?yàn)榧?xì)胞胞外糖基化酶可以在培養(yǎng)基中逐步積累，并將單糖從聚糖上移除。對(duì)細(xì)胞活力等關(guān)鍵數(shù)據(jù)的測(cè)量應(yīng)盡量保證準(zhǔn)確，這對(duì)監(jiān)測(cè)整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過程極為重要，這不僅能夠掌握細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞參數(shù)，而且可以從這些細(xì)胞參數(shù)中獲得細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞密度、細(xì)胞活力等第一手?jǐn)?shù)據(jù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)更加可控。在細(xì)胞活力的檢測(cè)中貝克曼的Vi-CELL XR細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力分析平臺(tái)有效解決了細(xì)胞計(jì)數(shù)的誤差，建立了統(tǒng)一的、標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定方法，跟蹤培養(yǎng)細(xì)胞的各種狀態(tài)參數(shù)，同時(shí)可以根據(jù)需要制作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，幫助操作者有效地監(jiān)管生物反應(yīng)器（發(fā)酵罐）中的細(xì)胞狀態(tài)，優(yōu)化培養(yǎng)條件和培養(yǎng)參數(shù)。

2.4 培養(yǎng)基對(duì)抗體藥物糖基化修飾的影響

哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基基本上由50～100種化學(xué)限定性物質(zhì)組成，同時(shí)還有少數(shù)不確定物質(zhì)作為補(bǔ)料，這些不確定物質(zhì)包括蛋白胨、酵母抽提物、植物水解物和血清，已有文獻(xiàn)報(bào)道一些不確定物質(zhì)在糖基化蛋白中存在影響。目前，已明確的培養(yǎng)基成分如葡萄糖，谷氨酰胺，半乳糖等都在糖基化控制中擔(dān)任了十分重要的角色。

如上所述，經(jīng)研究確證N-糖基化對(duì)于單克隆抗體藥物的結(jié)構(gòu)、功能以及藥代動(dòng)力學(xué)有顯著的影響。因此，對(duì)于生物制藥產(chǎn)業(yè)來(lái)說通過糖基化工程去控制特定糖結(jié)構(gòu)的形成已然成為研究熱點(diǎn)。在傳統(tǒng)經(jīng)典的人源化單抗和全人單抗的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步優(yōu)化效應(yīng)功能和降低免疫原性，最直接的方法是以生產(chǎn)工藝為基礎(chǔ)，通過代謝分析和數(shù)學(xué)模型的方法，進(jìn)一步控制重組蛋白質(zhì)的糖基化類型和糖基化修飾程度。

糖基化修飾在治療性抗體療效、安全性及藥代動(dòng)力學(xué)等方面發(fā)揮著重大的作用。在現(xiàn)代單克隆抗體產(chǎn)業(yè)中，調(diào)整和控制糖基化修飾至關(guān)重要，通過糖基化工程去控制特定糖結(jié)構(gòu)的形成也在不斷地發(fā)展。通過總結(jié)過去的研究成果了解細(xì)胞代謝途徑，希望最終可以控制單克隆抗體糖基化。未來(lái)目標(biāo)是通過前期的基礎(chǔ)研究，將新技術(shù)、新細(xì)胞系表達(dá)蛋白的糖基化水平做到可控并獲得滿足要求的糖蛋白，真正達(dá)到質(zhì)量源于設(shè)計(jì)(QbD)的要求。

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參考文獻(xiàn)

［1］Spearman M, Rodriguez J, Huzel N, et al. Production and Glycosylation of Recombinant β -Interferon in Suspension and Cytopore Microcarrier Cultures of CHO Cells. Biotechnology Progress, 2005,21(1):31.

［2］Jones D, Kroos N, Anema R, et al. High-level expression of recombinant IgG in the human cell line per.c6. Biotechnology Progress, 2003, 19(1):163-168.

［3］Yee JC, Gatti MDL, Philp RJ, et al. Genomic and proteomic exploration of CHO and hybridoma cells under sodium butyrate treatment. Biotechnology & Bioengineering, 2008, 99(5):1186-1204.

［4］Higel FB,Seidl A,Sorgel F,N-glycosylation heterogeneity and the influence on structure,function and pharmacokinetics of monoclonal antibodies and Fc fusion proteins［J］.Eur J Pharmaceut Biopharmaceut,2016,100:94-100.

［5］Liu B,Spearman M,Doering J,eta.The availability of glucose to CHO cells affect the intracellular lipid-linked oligosaccharide distribution,site occupancy and the N-glycosylation profile of a monoclonal antibody［J］.J Biotechnol,2014,170:17-27.

［6］Aghamohseni H,Ohadi K,Spearman M.Eeffects of nutrient levels and average culture pH on the glycosylation ppattern of camelid-humanized monoclonal antibody［J］.J Biotechnol,2014,186:98-109.

［7］Yee JC, Gatti MDL, Philp RJ, et al. Genomic and proteomic exploration of CHO and hybridoma cells under sodium butyrate treatment. Biotechnology & Bioengineering, 2008, 99(5):1186-1204.

［8］Trummer E, Fauland K, Seidinger S, et al. Process parameter shifting: Part II. Biphasic cultivation-A tool for enhancing the volumetric productivity of batch processes using Epo-Fc expressing CHO cells. Biotechnology & Bioengineering, 2006, 94(6):1045-1052.