前言
胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）是最致命的惡性腫瘤之一。腫瘤衍生的細(xì)胞外囊泡（EV）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移前的生態(tài)位形成以促進(jìn)轉(zhuǎn)移。6月22日科隆大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科和腫瘤外科團(tuán)隊(duì)在Cancers點(diǎn)擊查看影響因子上發(fā)表了“Tumor-Derived Extracellular Vesicles Inhibit Natural Killer Cell Function in Pancreatic Cancer”，文章通過(guò)超速離心從高轉(zhuǎn)移性胰腺癌細(xì)胞系和患者來(lái)源的原發(fā)癌細(xì)胞中分離出EV。通過(guò)質(zhì)譜法分析EV的蛋白質(zhì)含量;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)研究PDAC衍生的EV對(duì)天然殺傷（NK）細(xì)胞的影響;通過(guò)ELISA定量血清EVs的TGF-β1水平，發(fā)現(xiàn)整合素富含PDAC衍生的EV。與EV共培養(yǎng)后，NK細(xì)胞中NKG2D，CD107a，TNF-α和INF-γ的表達(dá)顯著下調(diào).NK細(xì)胞還表現(xiàn)出CD71和CD98水平降低，以及葡萄糖攝取能力受損。此外，NK細(xì)胞對(duì)胰腺癌干細(xì)胞的細(xì)胞毒性減弱。此外，PDAC衍生的EV誘導(dǎo)NK細(xì)胞中Smad2/3的磷酸化，PDAC患者血清EVs的TGF-β1顯著增加。研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了PDAC衍生的EV的免疫抑制作用，并對(duì)PDAC中轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成的NK細(xì)胞功能障礙的理解提供了新的見(jiàn)解。
研究思路
Figure 1：胰腺癌細(xì)胞衍生的細(xì)胞外囊泡（EV）的表征。 （a）通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）得到的胰腺癌來(lái)源的EV的代表性圖像。 （b）通過(guò)納米顆粒分析（NTA）測(cè)定胰腺癌衍生的EV的大小。 （c）通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定L3.6pl衍生的EV和親代細(xì)胞的外泌體標(biāo)志物ALIX，flotillin-1，TSG101，CD9，CD63，CD81和Rab5的表達(dá)。 （d）通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析在與羧酸鹽珠偶聯(lián)的L3.6pl衍生的EV上的CD63表達(dá)。
Figure 2：胰腺癌衍生的EV的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。 （a）TBO368衍生的EV和L3.6pl衍生的EV中的蛋白質(zhì)的細(xì)胞組分。 （b）胰腺癌衍生的EV中鑒定的蛋白質(zhì)的分子功能。 （c）胰腺癌衍生的EV中鑒定的蛋白質(zhì)的生物學(xué)過(guò)程。
Figure 3：胰腺癌衍生的EV攜帶粘附分子。 （a）L3.6pl衍生的EV和TBO368衍生的EV中的粘附分子的圖。 （b）整合在L3.6pl衍生的EV和TBO368衍生的EV中。 （c）L3.6pl衍生的EV中ITGAV的Western印跡分析。 （d）通過(guò)共聚焦顯微鏡分析用PKH67標(biāo)記的L3.6pl衍生的EV注射的肝臟。
Figure 4：胰腺癌衍生的EV損害天然殺傷（NK）細(xì)胞功能。 （a）來(lái)自GSE28735數(shù)據(jù)集的胰腺癌中腫瘤組織（T）和非腫瘤組織（N）中代表性免疫調(diào)節(jié)因子的相對(duì)mRNA表達(dá).（b）nectin-2，PVR和表達(dá)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡在L3.6pl衍生的EV和L3.6pl細(xì)胞中測(cè)定TGF-β1。 （c）使用共聚焦顯微鏡分析由NK細(xì)胞攝取的胰腺癌來(lái)源的EV。 （d）用PBS或L3.6pl衍生的EV處理NK細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析NKG2D陽(yáng)性NK細(xì)胞的百分比。 （e）用PBS或L3.6pl衍生的EV預(yù)處理的NK細(xì)胞與L3.6pl細(xì)胞以1：1的比例共培養(yǎng)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析NK細(xì)胞中CD107a（左），IFN-γ（中）和TNF-α（右）的平均熒光強(qiáng)度（MFI）。 （f）用PBS或L3.6pl衍生的EV處理NK細(xì)胞。然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析NK細(xì)胞以確定CD71（左）和CD98（中）和2-NBDG摻入（右）的MFI。
Figure 5：胰腺癌衍生的EV抑制NK細(xì)胞對(duì)癌癥干細(xì)胞（CSC）的細(xì)胞毒性。 （a）使用qRT-PCR在貼壁細(xì)胞和球體中基因表達(dá)NKG2D配體。 （b）通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定貼壁細(xì)胞和球體中MICA/MICB的MFI。 （c）沒(méi)有NK細(xì)胞殺傷的腫瘤球的代表性圖像（左），未處理的NK細(xì)胞殺傷后的腫瘤球（中）和L3.6pl衍生的EV預(yù)處理的NK細(xì)胞殺傷后的腫瘤球（右）。 （d）沒(méi)有NK細(xì)胞殺傷的腫瘤球的數(shù)量，未處理的NK細(xì)胞殺傷后的腫瘤球，以及L3.6pl衍生的EV預(yù)處理的NK細(xì)胞殺傷后的腫瘤球。
Figure 6：胰腺癌衍生的EV通過(guò)TGFβ-Smad2/3信號(hào)通路抑制NK細(xì)胞功能，并且胰腺癌患者的血清EVs TGF-β1增加。 （a）在存在或不存在SB-431542的情況下與TGF-β1或L3.6pl衍生的EV共培養(yǎng)后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量NK細(xì)胞中SMAD2/3的磷酸化水平。 （b）免疫組織化學(xué)（IHC）結(jié)果顯示PDAC的腫瘤組織中TGF-β1過(guò)表達(dá)。 （c）健康對(duì)照和PDAC組中每克血清EV的TGF-β1的量。
討論
胰腺導(dǎo)管腺癌是最致命的惡性腫瘤之一。轉(zhuǎn)移在PDAC中占癌癥相關(guān)死亡的大多數(shù)。最近，已經(jīng)提出轉(zhuǎn)移前的生態(tài)位來(lái)闡明許多癌癥實(shí)體中器官特異性轉(zhuǎn)移過(guò)程的機(jī)制，例如黑素瘤，肺癌和胰腺癌。在過(guò)去的幾十年中，EV在癌癥的早期檢測(cè)，診斷和治療中引起了廣泛的關(guān)注。此外，作為細(xì)胞間通訊的介質(zhì)，發(fā)現(xiàn)從腫瘤細(xì)胞釋放的EV與遠(yuǎn)處器官部位的細(xì)胞相互作用，最終誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移前的生態(tài)位用于未來(lái)的轉(zhuǎn)移。盡管取得了巨大進(jìn)展，但尚未確定涉及PDAC轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成的潛在細(xì)胞和分子事件。
細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的粘附?jīng)Q定了轉(zhuǎn)移部位的定植，并促進(jìn)了新環(huán)境中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的存活。整合素可以與ECM中的纖連蛋白，玻連蛋白，層粘連蛋白和膠原蛋白結(jié)合，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和侵襲能力。研究結(jié)果表明，整合素αv和整合素β5在胰腺癌衍生的EV中是豐富的。在靜脈內(nèi)注射后，PKH67標(biāo)記的胰腺癌衍生的EV到達(dá)NSG小鼠的肝臟。因此，提出腫瘤來(lái)源的EV傾向于進(jìn)入肝臟，將貨物運(yùn)送到受體細(xì)胞，并誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移前的生態(tài)位用于PDAC中的未來(lái)轉(zhuǎn)移。
轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的一個(gè)關(guān)鍵特征是免疫抑制。在研究中，GO分析顯示胰腺癌衍生的EV中鑒定的蛋白質(zhì)參與生物調(diào)節(jié)和免疫系統(tǒng)過(guò)程。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡，發(fā)現(xiàn)胰腺癌來(lái)源的EVs顯示出多種免疫調(diào)節(jié)分子。因此，推測(cè)胰腺癌衍生的EV可能參與免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。接下來(lái)，嘗試研究胰腺癌來(lái)源的EV對(duì)NK細(xì)胞的影響。首先，發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)NK細(xì)胞摻入胰腺癌來(lái)源的EV。然而，仍然不確定胰腺癌來(lái)源的EV是否能夠在與NK細(xì)胞共孵育時(shí)介導(dǎo)免疫抑制。
最近，免疫細(xì)胞的細(xì)胞代謝的重要性已經(jīng)引起越來(lái)越多的關(guān)注。足夠的營(yíng)養(yǎng)和能量對(duì)NK效應(yīng)功能至關(guān)重要。發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞表現(xiàn)出較少的CD71和CD98，以及用EV處理后葡萄糖攝取能力降低。由胰腺癌衍生的EV引起的失調(diào)的代謝影響NK細(xì)胞中的多個(gè)生物過(guò)程。結(jié)果與先前研究腫瘤衍生的EV對(duì)免疫細(xì)胞的影響的研究一致。研究結(jié)果表明，胰腺癌衍生的EV誘導(dǎo)NK細(xì)胞功能失調(diào)的表型，最終有助于轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的免疫抑制微環(huán)境。
沒(méi)有特定癥狀，在早期階段檢測(cè)PDAC是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。EVs有望被開(kāi)發(fā)為液體活檢工具，用于PDAC的早期檢測(cè)和診斷。最近，據(jù)報(bào)道，血漿中的外泌體PD-L1水平而非可溶性PD-L1與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）患者的疾病進(jìn)展相關(guān)。在研究中測(cè)量了PDAC患者血清EVs的TGF-β1水平。有趣的是，與健康供體相比，PDAC組血清EVs的TGF-β1顯著升高。因此，血清EVs的TGF-β1有望用作檢測(cè)PDAC的診斷工具。
除TGF-β1外，胰腺癌衍生的EV還含有多種其他免疫調(diào)節(jié)因子。PVR和nectin-2均可與NK細(xì)胞上的抑制性受體結(jié)合，包括CD96，PVRIG和TIGIT。因此，除TGF-β1外，胰腺癌衍生的EV中的PVR和nectin-2也可損害NK細(xì)胞功能。已經(jīng)證明PVR/nectin-2-TIGIT軸參與減弱的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性。作為檢查點(diǎn)，TIGIT的受體阻斷阻止了NK細(xì)胞功能障礙，并在攜帶腫瘤的小鼠模型中引發(fā)了NK細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng).針對(duì)CTLA-4，PD-1和PD-L1的免疫檢查點(diǎn)抑制劑已經(jīng)顯示出對(duì)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），晚期黑色素瘤和其他幾種癌癥患者的臨床益處。然而，這些抑制劑在PDAC患者中效果較差。結(jié)果表明TIGIT為PDAC提供了潛在的免疫治療靶點(diǎn)。
然而，本研究的局限性是尚未研究人胰腺癌衍生的EV對(duì)NK細(xì)胞的體內(nèi)作用。為解決這一問(wèn)題，人源化患者來(lái)源的異種移植小鼠模型可以更好地概括腫瘤異質(zhì)性并模擬免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性，為進(jìn)一步研究提供了更好的平臺(tái)。
總之，文章提出了一種新的PDAC免疫逃逸機(jī)制。胰腺癌可通過(guò)腫瘤衍生的EV在肝臟中建立轉(zhuǎn)移前的生態(tài)位。攜帶免疫抑制性貨物的胰腺癌衍生的EV介導(dǎo)NK細(xì)胞功能障礙。轉(zhuǎn)移性胰腺癌細(xì)胞逃避NK細(xì)胞的免疫監(jiān)視并最終在肝臟中產(chǎn)生轉(zhuǎn)移。此外，血清EVs的TGF-β1可能代表了一種有前景的PDAC非侵入性診斷工具。
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