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KIBRA主要在腎臟和與記憶相關(guān)的大腦區(qū)域表達(dá)，在這些區(qū)域中，KIBRA作為支架蛋白參與細(xì)胞的各種過(guò)程，如細(xì)胞極性、細(xì)胞遷移和細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)[5-6]。研究表明，KIBRA對(duì)海馬信號(hào)通路、突觸可塑性、學(xué)習(xí)、早期胞內(nèi)體運(yùn)輸?shù)扔兄匾{(diào)節(jié)作用[7]。然而，KIBRA在調(diào)節(jié)外泌體或細(xì)胞外囊泡（EV）分泌方面的潛在作用尚不可知。

來(lái)自山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院杜怡峰課題組于2019年4月9日在《Nature Communications》中發(fā)表了關(guān)于外泌體文章，文中闡述KIBRA對(duì)于外泌體分泌具有重要作用，且通過(guò)抑制Rab27a的蛋白酶體降解來(lái)控制外泌體的分泌[8]。

杜怡峰教授

Results

由于KIBRA主要在腎臟和腦部表達(dá)，作者選了小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系（HT22）和小鼠腎足突細(xì)胞系（MPC5）進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。為了分析KIBRA對(duì)不同亞型EVs分泌的影響，作者在細(xì)胞系中分別敲低或過(guò)表達(dá)KIBRA，用無(wú)外泌體血清培養(yǎng)細(xì)胞48h，再通過(guò)不同的轉(zhuǎn)速（2000*g、10000*g、100000*g）分離EVs。作者發(fā)現(xiàn)相比于對(duì)照組，敲低了KIBRA的HT22細(xì)胞系，其胞內(nèi)總蛋白量變化不大，但其分泌的外泌體內(nèi)蛋白量明顯下降。用外泌體marker（Alix、Tsg101、CD63、CD9）蛋白水平變化進(jìn)一步驗(yàn)證，HT22中敲低KIBRA破壞了EVs的分泌，尤其是外泌體的分泌。NTA和電子顯微鏡的結(jié)果也顯示了超離得到的EVs大小大多數(shù)與外泌體大小相符。此外，HT22中過(guò)表達(dá)KIBRA會(huì)明顯促進(jìn)細(xì)胞的外泌體分泌，而不影響外泌體的大小和形態(tài)。同樣，MPC5中敲低或過(guò)表達(dá)KIBRA后外泌體的蛋白水平變化與HT22中一致（圖1）。

圖1 KIBRA體外調(diào)節(jié)胞外小囊泡（EVs）的分泌

為了進(jìn)一步分析敲低KIBRA破壞外泌體分泌的機(jī)制，作者用電子顯微鏡觀察管腔內(nèi)囊泡（ILVs）和MVBs的數(shù)量和形態(tài)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲低KIBRA雖然明顯降低了外泌體的分泌，但導(dǎo)致了細(xì)胞中MVBs和MVBs內(nèi)ILVs的積累。同時(shí)，ILVs的形態(tài)沒(méi)有發(fā)生任何變化，表明了KIBRA可能僅影響外泌體的分泌，而不影響它的生成。

隨后作者用CD63作為免疫熒光marker，進(jìn)一步研究MVBs的亞細(xì)胞分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低KIBRA會(huì)引起細(xì)胞中CD63的大量分布，即每個(gè)細(xì)胞中CD63+斑點(diǎn)的大小和數(shù)量都有所增加。WB也顯示CD63表達(dá)水平的增加，約為對(duì)照組的三倍。

有報(bào)道稱(chēng)外泌體分泌可能與自噬直接相關(guān)[9-10]，但是在本次實(shí)驗(yàn)中WB和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果均沒(méi)有顯示LC3B（自噬體標(biāo)記物）和Lamp2（溶酶體標(biāo)記物）水平有明顯變化（圖2）。

圖2 敲低KIBRA增加了MVBs的大小和數(shù)量

作者利用蔗糖密度梯度離心分別從KIBRA敲除小鼠和WT小鼠的大腦和腎臟的胞外空間中分離純化外泌體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外泌體標(biāo)記物CD9和CD63主要存在于蔗糖梯度的b-e部分，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白Calnexin在蔗糖梯度中沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)WB結(jié)果顯示相對(duì)于WT小鼠胞外外泌體的CD9和CD63含量，KIBRA敲除小鼠外泌體的CD9和CD63含量降低了。NTA結(jié)果表明KIBRA敲除小鼠分泌的外泌體數(shù)量只有WT小鼠的52%，但是外泌體的平均大小沒(méi)有受影響。這些數(shù)據(jù)表明在KIBRA敲除小鼠中外周血外泌體的分泌遭到破壞。

此外，電子顯微鏡的結(jié)果也顯示在KIBRA敲除小鼠中細(xì)胞內(nèi)的MVBs數(shù)目和ILVs數(shù)目都明顯增加，這些數(shù)據(jù)驗(yàn)證了KIBRA在體內(nèi)調(diào)控外泌體分泌和MVBs表型的作用（圖3）。

圖3 KIBRA在體外調(diào)節(jié)外泌體分泌和MVB表型

作者通過(guò)質(zhì)譜（MS）分析和同位素標(biāo)記相對(duì)與絕對(duì)定量（iTRAQ）技術(shù)篩選了KIBRA敲除小鼠大腦與WT幼鼠之間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rab27a在所有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）的蛋白中變化最顯著的蛋白。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白質(zhì)譜，我們比較了KIBRA敲除小鼠和WT小鼠的皮層和海馬中Rab27a的水平。結(jié)果表明KIBRA敲除導(dǎo)致了皮層和海馬區(qū)域中Rab27a表達(dá)水平的顯著下降。WB分析顯示Rab27a在KIBRA敲除小鼠的皮層、海馬、腎臟、肌肉和肝臟中表達(dá)明顯降低，但是qPCR結(jié)果是Rab27a的mRNA水平在KIBRA敲除小鼠的腎臟、肌肉和肝臟中沒(méi)有變化，但在皮層和海馬中表達(dá)提高了，這可能是由于Rab27a蛋白的過(guò)度降解引起的補(bǔ)償機(jī)制。因此，作者認(rèn)為KIBRA敲除小鼠中Rab27a蛋白水平的降低是由于降解增加而不是Rab27a的合成減少引起的（圖4）。

圖4 敲除KIBRA促進(jìn)了Rab27a的降解

為了探索KIBRA的降解機(jī)制，作者分別將KIBRA敲低細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞用蛋白質(zhì)合成抑制劑（環(huán)己酰亞胺（CHX））、蛋白酶體抑制劑（Lac）或溶酶體抑制劑（Baf）進(jìn)行處理。WB分析顯示，當(dāng)用CHX處理12小時(shí)時(shí)，Rab27a大大降解，并且這種降解可以通過(guò)蛋白酶體抑制劑Lac而不是通過(guò)溶酶體抑制劑Baf恢復(fù)。同時(shí)，IP實(shí)驗(yàn)表明KIBRA被敲低后，Rab27a更容易被泛素化。因此，這些結(jié)果驗(yàn)證了Rab27a主要通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑進(jìn)行降解。

隨后通過(guò)cross-IP和免疫熒光實(shí)驗(yàn)得出Rab27a和KIBRA之間是直接相互作用。Rab27a通過(guò)與KIBRA相互作用后變得更加穩(wěn)定，從而不被泛素化。相反，KIBRA敲低導(dǎo)致Rab27a的蛋白酶體降解增加，這反過(guò)來(lái)抑制了外泌體的分泌（圖5）。

圖5 KIBRA使得Rab27a更加穩(wěn)定并防止其泛素化

為了進(jìn)一步探討KIBRA是否通過(guò)Rab27a調(diào)節(jié)外泌體分泌，作者將過(guò)表達(dá)Rab27a質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Rab27a敲低細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞，再通過(guò)G418進(jìn)行抗性篩選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與上述結(jié)果一致，相比于對(duì)照組，KIBRA敲低細(xì)胞的外泌體蛋白總量明顯減少，但是過(guò)表達(dá)Rab27a后，外泌體內(nèi)蛋白水平顯著提高。隨后通過(guò)對(duì)外泌體標(biāo)記物（Alix、Hsc70、Tsg101）進(jìn)行驗(yàn)證，顯示相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明過(guò)表達(dá)Rab27a能修復(fù)被破壞的外泌體分泌過(guò)程（圖6）。

圖6 過(guò)表達(dá)Rab27a能修復(fù)由于KIBRA基因敲低引起的外泌體分泌被破壞的過(guò)程

本文主要闡釋了Rab27a通過(guò)與KIBRA相互作用而變得更加穩(wěn)定，這就阻止了Rab27a通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑被泛素化和降解，同時(shí)Rab27a本身可以在體內(nèi)和體外調(diào)控外泌體的分泌，所以作者得出KIBRA可以通過(guò)抑制Rab27a的蛋白酶體降解來(lái)控制外泌體分泌的結(jié)論。

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