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撰文丨赤貞

責(zé)編丨迦溆

相分離在膜受體及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中常有發(fā)生。以T細(xì)胞活化過程為例，TCR被Src家族激酶磷酸化后，招募胞內(nèi)酪氨酸激酶ZAP70，后者磷酸化骨架蛋白上T細(xì)胞活化linker（LAT）的酪氨酸位點(diǎn)。磷酸化后的LAT可與接頭蛋白Grb2的SH2/SH3結(jié)構(gòu)域、GEF蛋白的脯氨酸富含域形成互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)生相分離。2016年，著名的Ronald Vale（就是那位研究生期間打破科研記錄一年發(fā)表4篇一作cell，26歲拿到PhD，42歲成為雙院院士，研究分子馬達(dá)的高富帥）實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中TCR磷酸化可誘導(dǎo)下游蛋白形成液液相分離，并最終促進(jìn)肌動蛋白絲（actinfilament）的形成【1, 2】；這一研究首次闡明了相分離對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有促進(jìn)作用。

隨著相分離領(lǐng)域的發(fā)展，眾多體外實(shí)驗(yàn)逐步揭示相分離的發(fā)生主要有兩種機(jī)制：一是蛋白內(nèi)部的無序區(qū)自發(fā)形成相分離；二是蛋白間通過多價的相互作用，形成穩(wěn)定的互作網(wǎng)絡(luò)，從而發(fā)生相分離【3】。那么，膜受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的相分離究竟通過哪種機(jī)制發(fā)生，這一過程發(fā)生的化學(xué)計(jì)量學(xué)依據(jù)為何，相分離具體如何調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其意義何為，這些問題目前仍不清楚。近日，Science雜志背靠背發(fā)表了來自UCB和UTSW的兩個實(shí)驗(yàn)室對相分離調(diào)控細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的化學(xué)計(jì)量學(xué)研究【4, 5】。

在UCB Jay T.Groves教授團(tuán)隊(duì)的研究中，研究者對（pY）LAT-Grb2-SOS信號通路中的SOS蛋白在TCR磷酸化以后是如何被招募到膜上、并從活性抑制狀態(tài)中激活的過程進(jìn)行了詳盡的分析。SOS蛋白由N端histone fold、Dbl同源結(jié)構(gòu)域、Pleckstrin同源結(jié)構(gòu)域，C端PR（脯氨酸富含域），和催化活性中心REM（Ras交換motif）、CDC25結(jié)構(gòu)域構(gòu)成【6】。其C端PR與接頭蛋白Grb2的SH3結(jié)構(gòu)域互作，N端則通過分子內(nèi)及分子間的互作阻擋活性中心發(fā)揮作用。研究者通過inteinligation得到了全長的SOS蛋白，通過單分子實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SOS在被Grb2招募到細(xì)胞膜后有兩種形式：招募后活化（activation）和招募后排斥（rejection）。兩種形式分別對應(yīng)著不同的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)：Activation形式的SOS蛋白通過與PIP2等陰離子脂質(zhì)互作，開放活性中心，從而激活下游Ras蛋白；而Rejction形式的SOS蛋白則迅速游離開細(xì)胞膜，保持活性抑制狀態(tài)。多個單分子實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，Activation形式的SOS蛋白從被招募到活化所需的activation time呈先升后降的gamma分布而非指數(shù)分布，提示SOS蛋白的活化過程存在至少一個限速步驟。研究者通過化學(xué)計(jì)量學(xué)推算對這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了理論驗(yàn)證，當(dāng)SOS蛋白活化需經(jīng)歷一個限速步驟時，其activation time的表達(dá)公示為

函數(shù)圖像則如圖D。由于SOS蛋白的活化主要是活性中心抑制狀態(tài)到活性中心開放狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，影響這一轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵分子有接頭蛋白Grb2、SOS蛋白N端結(jié)構(gòu)域和PIP2，研究者分別探究了這三者對于activation time的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Grb2和SOS蛋白N端結(jié)構(gòu)域是維持activationtime gamma分布的關(guān)鍵，兩者通過影響SOS蛋白在膜上的駐留時間（dwell time）而維持限速步驟的存在，其具體機(jī)制則正是相分離。具體來說，SOS蛋白的PR結(jié)構(gòu)域可與多個Grb2分子相互作用，駐留時間較長（4-6s）的SOS蛋白通過多個Grb2分子與至少兩個LAT分子形成互作網(wǎng)絡(luò)。在給定LAT及Grb2濃度的情況下，隨著SOS蛋白PR結(jié)構(gòu)域濃度的增加，可觀察到相分離的形成。通過相分離而長時間駐留在膜上的SOS蛋白增加了與PIP2接觸并活化的幾率，相分離中每個SOS分子可4倍激活下游的Ras蛋白。而與單個Grb2分子互作的SOS蛋白在膜上的駐留時間則不到1s，其激活概率大大降低。

相分離調(diào)控SOS蛋白的膜駐留時間從而影響SOS蛋白的活化，這一限速步驟在化學(xué)計(jì)量學(xué)中被稱為“動力學(xué)校正”（kineticproofreading），其主要意義為防止個別被偶然激活的上游信使分子大規(guī)模激活下游信號通路。除SOS蛋白以外，許多膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白也表現(xiàn)出相似的機(jī)制，如小G蛋白Rho家族的鳥苷酸交換因子Vav蛋白，Raf蛋白，PI3K，誘導(dǎo)性T細(xì)胞激酶和起始肌動蛋白成核的Arp2/3復(fù)合物。UTSW Michael K.Rosen教授團(tuán)隊(duì)的研究即對Nephrin-Nck-N-WASP信號通路中的相分離現(xiàn)象進(jìn)行了描繪。

Michael K.Rosen教授早先報道了腎足細(xì)胞、活化的T細(xì)胞膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中存在相分離現(xiàn)象【7, 8】。這一相分離現(xiàn)象起始于在上游信號刺激下跨膜蛋白nephrin/LAT位于胞漿內(nèi)的無序端被酪氨酸激酶磷酸化，磷酸化的酪氨酸位點(diǎn)可與適配蛋白的SH2、SH3、PRM結(jié)構(gòu)域多價互作，最終形成微米級的相分離液滴。這兩條信號通路的相分離能夠特異性上調(diào)適配蛋白Nck及其配體N-WASP和actin成核因子Arp2/3復(fù)合物的活性，最終促進(jìn)肌動蛋白成絲，而其具體如何上調(diào)復(fù)合物的活性尚不得而知。

研究者首先通過單分子實(shí)驗(yàn)證實(shí)pNephrin、Nck、N-WASP分子能夠在體外自發(fā)形成液液相分離，且相分離內(nèi)部肌動蛋白成絲的凈能力（除去蛋白濃度的影響）比游離狀態(tài)下肌動蛋白成絲的能力高14倍。肌動蛋白成絲的過程起始于Arp2/3：WASP2：Actin2復(fù)合物組裝成為“母體”肌動蛋白絲，而后WASP從復(fù)合物中解聚、Arp2/3復(fù)合物不可逆的結(jié)合在“母體”肌動蛋白絲上，并開始“子代”肌動蛋白絲的裝配。由于WASP的結(jié)合是這一過程中的主要限速步驟，研究者試圖探究N-WASP在細(xì)胞膜上的駐留時間是否是影響其活性的主要因素之一。

首先，N-WASP是通過PRM與Nck的SH3結(jié)構(gòu)域互作，從而連接到跨膜蛋白Nephrin的pTyr位點(diǎn)上的，其膜上駐留時間主要受到Nck濃度的影響。但此影響并非完全線性：當(dāng)Nephrin的pTyr位點(diǎn)被Nck的SH3結(jié)構(gòu)域飽和時，此互作網(wǎng)絡(luò)最為穩(wěn)固，N-WASP在膜上的駐留時間最長。其次，單分子實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)N-WASP直接結(jié)合在細(xì)胞膜上時，其促進(jìn)肌動蛋白成絲的能力是通過Nck間接結(jié)合在細(xì)胞膜上時的40倍余。最后，actin成絲的能力與nephrin-Nck-N-WASP的濃度呈現(xiàn)相似的非線性關(guān)系，而與WASP的膜上駐留時間則呈線性正相關(guān)。

至此，在腎足細(xì)胞的膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，pNephrin-Nck-N-WASP通過多價的相互作用形成相分離，而相分離的程度則受分子間相對濃度調(diào)節(jié)。液液相分離通過增加N-WASP的膜上駐留時間，顯著上調(diào)N-WASP的活性，增強(qiáng)其通過Arp2/3復(fù)合物促進(jìn)肌動蛋白成絲的能力。這一機(jī)制既抑制了上游通路低活躍水平下干擾信號對下游信號通路的大規(guī)模激活，又保證了高活躍水平時對下游信號通路的精細(xì)調(diào)節(jié)，因此在膜受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中尤為重要，并成為液液相分離的又一重要生物學(xué)功能。

原文鏈接：

http://science.sciencemag.org/content/363/6431/1093.abstract

http://science.sciencemag.org/content/363/6431/1098

制版人：子陽

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3. Banani, S.F., et al., Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology,2017. 18(5): p. 285-298.

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