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本文由李苗苗編譯，董小橙、江舜堯編輯。

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原名：Modular Traits of the Rhizobiales Root Microbiota and Their Evolutionary Relationship with Symbiotic Rhizobia

譯名：根瘤菌微生物群落的模塊化特征及其與共生根瘤菌的進(jìn)化關(guān)系

期刊：CELL HOST & MICROBE

IF：17.872

發(fā)表時間：2018.11

通信作者：Paul Schulze-Lefert

通信作者單位：馬克斯·普朗克植物育種研究所，植物-微生物相互作用系

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖

2.1 細(xì)菌菌株的分離和測序

將表面滅菌的擬南芥種子以每盆四株植物的密度播種并分層3-4天。植物在溫室中在短日照條件下生長6周（8 / 16hr日/夜，溫度為22℃/ 18℃，相對濕度為70％）。收獲后，將根與粘附的土壤顆粒機(jī)械分離，并從下胚軸遠(yuǎn)端0.5cm開始的3cm的定義根段取樣。通過輕輕敲擊除去仍然附著在根部的土壤顆粒。將根收集在15mL錐形管中，所述錐形管含有5 mL磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）-S緩沖液，并在搖床上以180 rpm洗滌15分鐘。將根轉(zhuǎn)移到新的15 mL錐形管中，將剩余的土壤顆粒以15000 3 g離心20分鐘。菌株被培養(yǎng)分離，單克隆菌落培養(yǎng)在96孔板。使用引物799F（50-AACMGGATTAGATACCCKG-30）和1392R（50-ACGGGCGGTGTGTRC-30）將上清液用于16S rRNA V5-V8區(qū)域的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物質(zhì)量評估和純化之后被測序。每個菌株的基因組被提取純化之后被測序。

2.2 細(xì)菌接種與圖像分析

細(xì)菌菌株培養(yǎng)2-3天達(dá)到平臺期后被稀釋5倍，收集細(xì)菌細(xì)胞并重懸浮于10 mM MgCl₂中，并調(diào)整OD600為0.5。細(xì)菌懸浮液混合到植物MS培養(yǎng)基上。預(yù)先在MS上培養(yǎng)好的植物轉(zhuǎn)入包含細(xì)菌的MS培養(yǎng)基上。

2.3 DNA提取與定量PCR

從平板收集接菌的根，并在無菌水中洗滌兩次。用玻璃纖維過濾紙除去多余的水，液氮處理后凍存-80度直到DNA提取。

2.4 共聚焦顯微鏡和圖像分析

表達(dá)NPSN12與增強(qiáng)的黃色熒光蛋白（EYFP）融合的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系Wave_131Y在CLSM780共聚焦顯微鏡下觀察，該共聚焦顯微鏡配備有水浸203物鏡，使用514-nm的25wW氬離子激光器。使用ImageJ對所有圖像分析（Schneider等人，2012）。在顯微鏡檢查之前掃描并標(biāo)記平板，允許各個植物的參數(shù)之間的相關(guān)性。

2.5 RNA提取和RNA-seq

對于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，6天大的擬南芥幼苗在磷酸鹽充足或磷酸鹽貧乏的條件下接種根瘤菌129E或模擬對照，并在短日照條件下孵育4、8、12和16天，如所述以上。將來自三個平板的根組合一次重復(fù)，并對每種條件取樣總共三次重復(fù)。用Lysing Matrix E和TissueLyser II將根均質(zhì)化。RNA被提取、質(zhì)檢、建庫和測序。

3.1 細(xì)菌有序根瘤菌的保守微生物群落成員

大規(guī)模的細(xì)菌分離和DNA測序使我們能夠組裝944種根瘤菌代表細(xì)菌的高質(zhì)量全基因組序列。這些菌株起源于一組遠(yuǎn)緣植物寄主，包括非豆科植物，以及相關(guān)的環(huán)境來源，如土壤、昆蟲和線蟲（表S1）。這些基因組涵蓋了已知的根瘤菌系列以及先前在公共數(shù)據(jù)庫中不存在的幾個譜系。我們將這些序列與370個高質(zhì)量的根瘤菌基因組裝置進(jìn)行了比較，這些基因組大部分來自豆科植物共生根瘤，從公共數(shù)據(jù)庫中檢索出來（表S1）。

我們從這些基因組中交叉引用了16S rRNA基因序列，其中有五個以前非培養(yǎng)的擴(kuò)增子研究為來自五個相關(guān)的微生物（土壤，根，根際，葉和豆科根瘤）的植物微生物群在六種不同土壤類型中生長的植物寄主（表S2）（Schlaeppi等，2014; Bulgarelli等，2015; Bai等，2015; Zgadzaj等，2016）。這種高分辨率分析（99％序列同一性）證實(shí)，根瘤菌在高相對豐度中始終存在，并富含系統(tǒng)發(fā)育上不同的植物寄主的根和葉群落，因此是核心植物微生物群的一部分（5％-17％）平均相對豐度;圖1A）。根瘤菌中的β多樣性分析表明，從根、根際或未種植的土壤中獲得的樣品之間沒有明顯差異（圖1B），表明土壤中根瘤菌對根系環(huán)境的保守適應(yīng)性。相比之下，我們觀察到來自根室和來自葉和豆科根瘤的樣品之間的分離，分別通過葉綠體中的甲基桿菌的優(yōu)勢和日本落葉松結(jié)節(jié)中的兼容共生根瘤菌（Mesorhizobium loti）進(jìn)行了解釋（圖S1）。

圖1 細(xì)菌根瘤菌目中的保守微生物成員

3.2 根瘤菌亞系對植物生態(tài)位的進(jìn)化保守適應(yīng)性

為了研究根瘤菌的功能多樣性，我們對數(shù)據(jù)集中存在的1314個全基因組進(jìn)行了比較分析。根瘤菌基因組通常是鑲嵌的和多部分的結(jié)構(gòu)，因?yàn)榇嬖诖蟮娜旧w外復(fù)制體，這導(dǎo)致大的泛基因組由穩(wěn)定和保守的核心和可變的輔助基因庫組成（Galibert等，2001; Young等，2006）?；谂帕械淖⑨尯蛷念^預(yù)測基因家族的分析揭示了一個小核心（每個分離菌基因的27.30％;平均802個基因家族）和廣泛且基本上沒有特征的泛基因組（> 100000個直系同源基因;數(shù)字S2C和S2D）?；诰┒蓟虬倏迫珪突蚪M注釋基因的存在和缺失的計(jì)算的全基因組功能差異的主要坐標(biāo)分析顯示通過分類譜系明顯區(qū)分但在結(jié)瘤和非結(jié)瘤菌株之間或在根和土壤起源的分離菌株之間沒有區(qū)別（圖S2A）。這表明獲得與豆科植物相互作用所需的共生基因并不伴隨著全基因組水平的適應(yīng)性。此外，我們發(fā)現(xiàn)根據(jù)寄主物種的根共生基因組之間沒有分離（圖S2B），表明根瘤菌微生物群成員的廣泛寄主范圍。有趣的是，從昆蟲中分離的一部分菌株顯示出與根瘤菌科其他成員（黑點(diǎn);圖S2B和表S1）在全基因組水平上的高相似性，表明昆蟲可能充當(dāng)根瘤菌的傳播媒介。

3.3 根瘤菌固氮共生的趨同演化

為了探索根瘤菌中固氮共生的進(jìn)化歷史，我們對所有測序基因組的祖先性狀進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育重建。首先，從保守的、單拷貝的和垂直遺傳的基因的多序列比對產(chǎn)生有根的進(jìn)化樹。接下來，我們使用最大似然法在沿著進(jìn)化樹分支的每個祖先基因組中重建關(guān)鍵共生基因（編碼固氮酶的nif和結(jié)瘤因子根瘤基因）的存在或不存在（圖2和S3）。我們確定了豆科植物共生所需的相應(yīng)基因家族的獲得和丟失模式的高度相關(guān)性（圖S2E），表明可能通過水平基因轉(zhuǎn)移協(xié)同獲得這些基因。鑒于這種進(jìn)化上獲得和丟失的模式，我們?nèi)缓笫褂帽Ｊ氐?/span>nifH標(biāo)記作為共生能力的代表。這表明所有根瘤菌的最新共同祖先可能缺乏共生遺傳工具包，并且在導(dǎo)致主要根瘤菌分類群形成的物種形成事件后多次獲得形成結(jié)核和固定大氣氮的能力（圖2中的綠色分支）。在當(dāng)前數(shù)據(jù)集（n = 296;表S3）和非根瘤菌基因組（n = 585）中發(fā)現(xiàn)的nifH序列的系統(tǒng)發(fā)育分析證實(shí)，在屬于慢生根瘤菌科（Bradyrhizobiaceae）和根瘤菌科（Rhizobiaceae）的根瘤菌中發(fā)現(xiàn)的nifH基因構(gòu)成兩個獨(dú)立的但密切相關(guān)的進(jìn)化枝（圖S2F）表明，來自未知的非根瘤菌供體的一次或兩次原始采集之后是在該細(xì)菌目內(nèi)的多個水平基因轉(zhuǎn)移。

圖2 根瘤菌氮固定共生的趨同演化

3.4 擬南芥中保守的根瘤菌根生長促進(jìn)活性

來自天然土壤中生長的植物樣品中所有主要根瘤菌分類群的富集（圖1）以及大多數(shù)來自根的菌株（99.74％菌株;圖2）缺乏結(jié)瘤和氮固定能力預(yù)測了與非豆科和豆科寄主相互作用，可以成功進(jìn)行根系定殖的祖先機(jī)制。我們通過在實(shí)驗(yàn)室條件下共同培養(yǎng)的一組根瘤分離菌株和無菌擬南芥植物進(jìn)行二元相互作用實(shí)驗(yàn)來測試這種關(guān)聯(lián)是否影響寄主生理學(xué)。在系統(tǒng)發(fā)育重建的指導(dǎo)下，我們選擇了屬于擬南芥根系微生物群的所有主要根瘤菌進(jìn)化枝的分類和功能多樣的菌株的子集，以及用于氮固定根瘤共生（根瘤菌）的或轉(zhuǎn)運(yùn)DNA到植物細(xì)胞（農(nóng)桿菌）中（圖2中的箭頭）的特征分離株。我們在含有單個細(xì)菌菌株的瓊脂糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)野生型擬南芥植物3周，并測量初生根長度和芽鮮重。大多數(shù)測試菌株強(qiáng)烈地促進(jìn)了根生長（RGP）（圖3;表S4）。重要的是，這種表型是在屬于五個主要分類群的分離菌株中檢測到的，這些分類群含有氮固定根瘤共生菌和擬南芥根衍生共生菌，表明這種性狀是根瘤菌有序的特征。除了NGR234（分離株157,635和685;圖S4A）之外，所有不影響根生長的分離株在根中檢測不到，表明RGP表型的缺乏主要是由于它們在我們的實(shí)驗(yàn)中不能定植植物寄主。值得注意的是，盡管有效的根定殖，但來自α-變形菌綱Alphaproteobacteria（柄桿菌目Caulobacterales和鞘脂單胞菌目Sphingomonadales目）內(nèi)的姐妹核心根微生物群譜系的代表性擬南芥根衍生的共生菌顯示沒有RGP表型（圖3和S4A）。在擬南芥根系微生物群中發(fā)現(xiàn)了4種擬南芥種和多種根瘤菌種的多個模型（Bulgarelli等，2012），表明RGP是寄主和微生物種群中的保守性狀（圖S5A和S5B）。此外，在營養(yǎng)限制條件下生長的擬南芥的二元相互作用實(shí)驗(yàn)揭示，根瘤分離菌一致地拯救磷饑餓誘導(dǎo)的根生長抑制（RGI）并在氮饑餓下保留RGP（圖S5C-S5E）。這表明，與根瘤共生不同（Carroll和Gresshoff，1983），擬南芥中的共生RGP在硝基充足和缺乏條件下均有效。

圖3 擬南芥中保守的根瘤菌根生長促進(jìn)活性      

3.5 干細(xì)胞分裂穩(wěn)態(tài)和MAMP觸發(fā)反應(yīng)的干擾

為了深入了解根瘤菌如何影響根系發(fā)育，我們對缺失nif和nod基因的Rhizobium 129E進(jìn)行了時間分辨的發(fā)育和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析（圖2和S3），并且在擬南芥根微生物群屬于最豐富的otu之一（Bulgarelli等，2012）。野生型擬南芥Col-0植物的二元相互作用實(shí)驗(yàn)顯示接種后14天（dpi）根分生組織區(qū)域增大（約2倍;圖4），而根伸長和分化區(qū)域的細(xì)胞生長仍然存在與無菌對照植物無法區(qū)分（圖S6A-S6D）。雖然植物激素細(xì)胞分裂素和生長素之間的拮抗作用對根分生組織的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，但RGP保留在缺乏細(xì)胞分裂素受體（ahk3-3）或細(xì)胞分裂素信號組分的擬南芥突變體中（arr1arr12;圖S6E和S6F），以及缺乏生長素受體（tir1-1）、生長素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（aux1-7和axr4）或生長素信號組分（arf7arf19;圖S6G）的突變體。

圖4 根瘤菌129E對根分生組織穩(wěn)態(tài)的干擾

為了進(jìn)一步研究根瘤菌129E干擾寄主生理的機(jī)制，我們在接種根瘤菌129E后進(jìn)行了擬南芥根的RNA測序（RNA-seq）。為了識別與營養(yǎng)狀態(tài)無關(guān)的響應(yīng)細(xì)菌定植的植物基因，我們在Pi充足和Pi缺乏條件下的四個時間點(diǎn)（4,8,12和16 dpi）收集樣品，這兩個條件下都產(chǎn)生了共生介導(dǎo)的RGP。在兩種營養(yǎng)條件下的細(xì)菌根定殖是比較處理的（Castrillo等，2017）。我們觀察到根瘤菌129E對根定殖的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與細(xì)菌病原體衍生的flg22處理之間存在顯著的反相關(guān)性（圖5D），這意味著該共生菌可部分抑制MAMP觸發(fā)的轉(zhuǎn)錄重編程。

圖5 MAMP觸發(fā)響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄干擾

長期以來，已知的MTI產(chǎn)量是RGI（Go'mez-Go'mez等，1999），據(jù)信，這反映了植物生長和防御之間的權(quán)衡（Huot等，2014; Lozano-Dura'n和Zipfel，2015）。我們檢查了根瘤菌129E是否可以在長期暴露于flg22后減弱RGI，并發(fā)現(xiàn)共生菌可以完全覆蓋RGI（圖6A），進(jìn)一步支持其抑制MAMP誘導(dǎo)的響應(yīng)的能力。我們探索了屬于α-變形菌綱Alphaproteobacteria的微生物群菌株中這種性狀的普遍性（圖6B）。進(jìn)一步測試的四個根瘤菌株（分離株491,13A，142和423）中沒有一個克服了flg22刺激的RGI，證明了這種性狀的菌株特異性，并且RGP特征和MAMP反應(yīng)抑制是根共生根瘤菌之間可分離的性狀。盡管缺乏RGP活性，Sphingomonadales1497完全抑制了flg22誘導(dǎo)的RGI，揭示了MAMP誘導(dǎo)的響應(yīng)的抑制也在核心根微生物群的另一個分類學(xué)譜系中進(jìn)化。在存在該MAMP表位的情況下，所有非抑制性根瘤菌分離株的RGP活性維持在缺乏flg22受體FLAGELLIN SENSITIVE2（FLS2; Go'mez-Go'mez等，1999）的突變體中，表明細(xì)菌喪失flg22處理后的RGP活性是由MAMP刺激的植物響應(yīng)引起的。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明，在存在MAMP的情況下，根瘤菌129E和鞘氨醇單胞菌1497共生物可以影響防御-生長權(quán)衡的結(jié)果。為了測試MAMP響應(yīng)抑制在微生物群背景中的潛在相關(guān)性，我們分析了來自擬南芥根的根生物群的分類代表性At-SPHERE培養(yǎng)物集合的基因組序列（Bai等人，2015）。這揭示了含有潛在MAMP表位的蛋白質(zhì)序列的廣泛存在于從健康植物中分離的細(xì)菌中（flg22，flgII-28，elf18，csp22和nlp20;Bo¨hm等，2014; Cai等，2011; Felix和Boller，2003; Felix等，1999; Kunze等，2004）（圖S7A）。一致地，來自At-SPHERE集合的四個測試的根源的假單胞菌中的三個激活了轉(zhuǎn)基因擬南芥CYP71A12pro：GUS幼苗的根中的MTI報告基因表達(dá)（圖S7B）（Millet等人，2010）。

圖6 根際共生菌干擾MAMP觸發(fā)的增長輸出

3.6 共生RGP的模塊性和對MAMP響應(yīng)的干擾

從與在同一土壤中生長的擬南芥中分離的根共生菌單一關(guān)聯(lián)觀察到的表型變異提出了RGP和抑制MAMP誘導(dǎo)的輸出是否在微生物群落環(huán)境中獨(dú)立運(yùn)作的問題。我們測試了這些細(xì)菌性狀的潛在功能調(diào)節(jié)性，通過選擇具有來自根瘤菌目（分離株129E和142）的這些性狀以及來自α-變形菌綱Alphaproteobacteria（分離株1497和700）的姐妹進(jìn)化枝的共同接種實(shí)驗(yàn)三聯(lián)體的不同組合的共生菌（圖7）。在存在或不存在外源flg22的情況下，共同接種所有單一和成對組合后的細(xì)菌分離菌，我們測量了擬南芥的初生根生長。這表明RGP和MAMP反應(yīng)抑制主要是顯性特征，只要其中一個細(xì)菌伴侶具有各自的功能就表達(dá)（圖7）。例如，根生長促進(jìn)和MAMP反應(yīng)抑制性分離株Rhizobium 129E與缺乏這兩種特征的Caulobacteras700共同接種導(dǎo)致兩種表型的保留。重要的是，僅在沒有flg22的情況下促進(jìn)根生長的Sinorhizobium142與缺乏RGP活性的MAMP反應(yīng)抑制菌株Sphingomonadales 1497的共同接種在模擬和flg22處理下賦予了完整的RGP表型（圖7）。在這種組合中，存在flg22時的RGP不能通過相應(yīng)的單關(guān)聯(lián)中看到的表型總和來解釋，因?yàn)樵谶@種條件下沒有一個菌株顯示RGP，這表明這些模塊性狀協(xié)同作用并且是一種三方互動的新興特性。

圖 7

4.1 適應(yīng)根環(huán)境有助于獲得共生基因

根瘤菌細(xì)菌目內(nèi)的大多數(shù)細(xì)菌種類始終在豆科植物和非豆科植物物種的根和葉中富集，因此是植物微生物群的核心成員（圖1A）。從六種不同土壤類型中生長的不同植物中收集的土壤、根和根際樣品中根瘤菌群落之間的高度相似性表明，大多數(shù)土傳根瘤菌也適應(yīng)根系環(huán)境。土壤生物群落中根莖根瘤菌的普遍存在可以通過在進(jìn)化時間尺度上持續(xù)的植物-土壤反饋來解釋（Bever等，2012），這是植物改變其生長土壤的生物量的過程。大規(guī)模植物生長測定揭示了來自所有五種主要根瘤菌譜系的分離菌株中預(yù)先存在的RGP表型一致，其能夠定殖擬南芥根（圖3A）而對芽鮮重沒有負(fù)面影響（圖3B），這表明了一種共生的生活方式。因此，大多數(shù)根瘤菌能夠與非豆科植物積極地相互作用并改變它們的寄主生態(tài)位而不僅僅是定殖根。需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來闡明這種普遍的共生生活方式的遺傳基礎(chǔ)和作用機(jī)制是否在根瘤菌物種中是保守的。

我們的數(shù)據(jù)集包括從根與土壤相關(guān)的環(huán)境來源分離的根瘤菌菌株的基因組，補(bǔ)充了當(dāng)前高度偏向豆科植物根瘤共生菌基因組的數(shù)據(jù)庫，使我們能夠?qū)Ω鼍亢透鲂纬傻倪M(jìn)化歷史進(jìn)行綜合分析。這表明，根瘤菌的最新共同祖先沒有關(guān)鍵的共生基因，這些基因是共同而非順序獲得的（圖2和S2E）。因此，對于被子植物和共生生活方式的強(qiáng)大的微生物群成員顯然可以預(yù)先確定并且可能使祖先的根瘤菌易于獲得根瘤形成所需的基因。最近的一項(xiàng)研究描述了從非豆科Parasponia譜系中的放線菌弗蘭西亞到根瘤菌的共生轉(zhuǎn)換（van Velzen等，2018），表明現(xiàn)存的根瘤菌可能已從外部供體獲得了已經(jīng)具有固氮及根瘤共生能力的nod和nif基因，如actinorhizal共生體。有趣的是，屬于β-變形菌綱Betaproteobacteria的伯克氏菌目Burkholderiales的成員，代表根微生物群的另一個核心譜系，具有強(qiáng)烈的植物生長促進(jìn)活性或參與基因豆科植物的結(jié)瘤和固氮共生（Chen et al，2003; Masson-Boivin等，2009; Moulin等，2001; Poupin等，2016）。這表明，從根際能力和微生物群成員狀態(tài)向氮固定共生的趨同演化可能具有超越根瘤菌的相關(guān)性。

4.2 從根共生到根瘤共生的生活方式轉(zhuǎn)變

固氮根瘤菌抑制豆科植物免疫反應(yīng)的能力已被解釋為根瘤共生從病原生活方式中出現(xiàn)的證據(jù)（Cao等，2017）。進(jìn)化實(shí)驗(yàn)研究將固氮豆科植物共生體Cupriavidus taiwanensis的共生質(zhì)粒引入根源病原青枯菌（Ralstonia solanacearum），兩者均屬于伯克霍爾德氏菌（Burkholderiales），表現(xiàn)出從腐生到共生的生活方式轉(zhuǎn)變，同時伴隨著基因組重塑，使得能夠有效地參與共生寄主（Capela等，2017; Remigi等，2016）。然而，我們的組合系統(tǒng)發(fā)育學(xué)（圖2和S2）和表型分析（圖5,6和7）提出了另一種情形，即根系環(huán)境和微生物群成員的祖先適應(yīng)狀態(tài)允許從共生主義（commensalism）轉(zhuǎn)向互利共生主義（mutualism）。該模型預(yù)測結(jié)瘤根瘤菌和根瘤菌根共生體具有根部定殖的保守成分。最近在苜蓿共生體Ensifer meliloti（以前稱為Sinorhizobium meliloti）中的全基因組誘變篩選顯示，近2％的基因（其中80％是染色體定位的）與根際定殖有關(guān)（Salas等，2017）。我們測試了這些根際能力基因是否存在于缺乏關(guān)鍵共生工具包的其他根瘤菌譜系和非豆科根共生體中，并且發(fā)現(xiàn)平均而言在每一個1,314個基因組中86％保守（圖S2G）。這有力地支持了我們的假設(shè)，即根瘤菌的最新祖先已完全適應(yīng)根環(huán)境。此外，觀察到從擬南芥根（Sinorhizobium/ Ensifer，Mesorhizobium和Bradyrhizobium spp.）中分離出的6個現(xiàn)存的根瘤菌氮素亞系的成員失去了關(guān)鍵的共生基因，這表明生活方式從互利共生過渡到共生主義也會發(fā)生。此外，最近對37種植物物種進(jìn)行了全基因組比較分析，確定了關(guān)鍵共生調(diào)節(jié)因子NODULE INCEPTION的多次獨(dú)立功能喪失事件（Griesmann等，2018），進(jìn)一步表明選擇壓對抗固氮根瘤共生可以作用于寄主和共生體。

4.3 細(xì)菌干擾根發(fā)育的多樣化

我們發(fā)現(xiàn)共生的根瘤菌能夠操縱根的發(fā)育與最近的研究一致，這些研究顯示改變的擬南芥根結(jié)構(gòu)與固氮菌Mesorhizobium loti MAFF303099或Rhizobium IRBG74相關(guān)（Poitout等，2017; Zhao等，2017）。然而，在那些研究中報道了RGI，與我們的調(diào)查中的Bradyrhizobium elkanii USDA61類似，我們觀察到所有其他定殖根的分離株的初生根長度增加（圖3）。我們贊成這樣的觀點(diǎn)，即這些差異表明在控制根發(fā)展方面具有良好的機(jī)械多樣性。首先，雖然根瘤菌129E對根發(fā)育的干擾不依賴于生長素受體TIR1和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AUX1，但這些蛋白在擬南芥中在結(jié)瘤共生體M. lotiMAFF303099和根瘤菌IRBG74的RGI活性中起主要作用。其次，激活細(xì)胞分裂素信號傳導(dǎo)途徑對豆科植物的根瘤器官發(fā)生至關(guān)重要（通過LjLHK1或MtCRE1受體; Oldroyd等，2011），但減少了擬南芥的根分生組織大小（Dello Ioio等，2007）。最后，良好的促進(jìn)植物生長的根際細(xì)菌（PGPR），假單胞菌WCS417，也增加了根分生組織的大小，盡管這種細(xì)菌通過抑制細(xì)胞伸長來賦予RGI（Zamioudis等，2013）?？傮w而言，這些發(fā)現(xiàn)暗示了由共生根瘤菌、PGPR假單胞菌和共生根瘤菌介導(dǎo)的寄主根構(gòu)造改變的不同機(jī)制。

4.4 共生根瘤菌干擾擬南芥中MAMP誘導(dǎo)的反應(yīng)，與節(jié)點(diǎn)因子產(chǎn)生無關(guān)

我們的時間分辨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與flg22處理的擬南芥根的公布數(shù)據(jù)集的比較顯示，MAMP感知誘導(dǎo)的大多數(shù)基因響應(yīng)于根瘤菌129E定植而下調(diào)（圖5D），表明在沒有外部MAMP的情況下干擾MAMP誘導(dǎo)的寄主轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的能力。然而，根瘤菌129E缺乏細(xì)菌III型分泌系統(tǒng)組分和Nod因子生物合成基因，它們分別是植物病原細(xì)菌（Alfano和Collmer，2004）或豆科根瘤共生體（Liang et al，2013）對MTI抑制所必需的。這意味著該共生菌株獨(dú)立于先前描述的MTI抑制途徑干擾寄主MAMP誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在植物中，根瘤菌129E的增殖在指數(shù)生長指數(shù)生長后12 dpi時達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)3 log₁₀單位而對寄主沒有可識別的有害影響（圖5A和S4B），表明盡管抑制了MAMP誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在寄主根中，植物仍能控制細(xì)菌增殖。

與RGP不同，代表性的根瘤菌在flg22存在下顯示出群體水平的多樣性和菌株特異性能夠超越擬南芥中的RGI（圖6）。這表明根瘤菌RGP和對flg22誘導(dǎo)的RGI的干擾是可分離的性狀，排除了RGP僅僅是抑制MAMP刺激的RGI的間接結(jié)果的可能性。這也表明，根瘤菌129E（圖5和6）對寄主MAMP響應(yīng)的干擾是由于直接相互作用而不是代表一般植物對細(xì)菌細(xì)胞存在的反應(yīng)。此外，來自α-變形菌綱Alphaproteobacteria內(nèi)的姐妹譜系的分離菌株抑制MAMP活化的沒有RGP活性的RGI（分離菌株1497;圖6B），表明核心根微生物群的其他成員共同干擾寄主MAMP反應(yīng)的能力。先前的報道進(jìn)一步支持了這一點(diǎn)，該報道顯示來自γ-變形菌綱Gammaproteobacteria（P. simiae WCS471; Stringlis等，2018）和Firmicutes（枯草芽孢桿菌FB17; Lakshmanan等，2013）的PGPR菌株可以抑制擬南芥防御反應(yīng)。與我們的發(fā)現(xiàn)一起，這表明在從健康植物的根中分離的的細(xì)菌群體的抑制MAMP誘導(dǎo)的反應(yīng)稀疏但分類廣泛分布，并且表明這種性狀可能經(jīng)常被微生物群成員獲得和/或丟失。此外，這意味著植物先天免疫系統(tǒng)可以對根微生物群成員施加選擇性壓力，以獲得和維持參與抑制MAMP誘導(dǎo)的反應(yīng)的性狀。在擬南芥根微生物群的基因組中編碼與經(jīng)典MAMP高度相似的肽的序列（圖S7）以及觀察到的MAMP反應(yīng)干擾性狀的主要特征廣泛存在（圖6B），表明健康根中的微生物穩(wěn)態(tài)可能取決于具有MTI活化和MTI抑制活性的共生群體成員的共同發(fā)生。

4.5 植物微生物群的模塊化特征和突變性質(zhì)

野生型擬南芥植物與具有不同RGP能力和抑制flg22觸發(fā)的RGI的共生α-變形菌綱Alphaproteobacteria分離株的組合的共同接種實(shí)驗(yàn)表明，這些性狀可以協(xié)同作用，導(dǎo)致三方系統(tǒng)和植物生理學(xué)的新興特性和無法通過單個菌株的行為預(yù)測的產(chǎn)量（flg22處理的植物的RGP;圖7）。這可以通過這兩種性狀之間的相互作用來解釋，其中寄主MAMP響應(yīng)通過直接干擾細(xì)菌活性或通過降低寄主敏感性來禁用RGP。這種復(fù)雜的行為也可以解釋根微生物群成員中RGP和MAMP反應(yīng)抑制的表型多樣性，并表明這些細(xì)菌性狀影響整個群落和寄主的健康。我們推測PGPR的現(xiàn)場應(yīng)用效率的變化是由與作物上的常駐微生物群成員類似的復(fù)雜相互作用產(chǎn)生的（Ansari等，2015）。此外，盡管我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)置已經(jīng)減少，但我們觀察到以模塊化和協(xié)同方式起作用的微生物性狀之間的復(fù)雜相互作用。我們的發(fā)現(xiàn)說明了自下而上實(shí)驗(yàn)方法的必要性，其中微生物群成員群體首先以無偏的方式系統(tǒng)地采樣，然后是單一關(guān)聯(lián)的代表性分離菌株的特征化，最后是受控條件下的菌群環(huán)境。

此文中，大量的根瘤菌被分離出來，然后通過大規(guī)模的全基因組測序及高通量16s RNA擴(kuò)增子測序，揭示了氮固定共生在這種細(xì)菌中的進(jìn)化歷史。微生物與植物相互作用研究表明微生物群成員對擬南芥免疫反應(yīng)呈現(xiàn)菌株特異性干擾。本文利用了全基因組比較分析、16s RNA擴(kuò)增子測序及RNA-seq等多方面測序技術(shù)結(jié)合的方法研究固氮共生特點(diǎn)進(jìn)化及菌株與寄主的關(guān)系非常值得借鑒的。

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