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癌癥被普遍認為是一種進化性的疾病，由零星的致癌突變引起的癌變前細胞與正常細胞相比，其可以更快地轉(zhuǎn)移并且更好地承受生存壓力，進而形成腫瘤。許多已形成的腫瘤具有遺傳不穩(wěn)定性，產(chǎn)生累積額外突變的趨勢，從而造成腫瘤內(nèi)的惡性細胞不斷增多。這其中一個重要的原因是大量的基因組多樣性引起廣泛的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性和系統(tǒng)發(fā)育不同。大量的研究證據(jù)表明，遺傳多樣性和分子進化對同時患有多種癌癥的病人的臨床病程具有重要影響。

在研究引發(fā)癌癥原因的一個未被解決的關(guān)鍵問題是：在一般研究方案的框架中，腫瘤的基因組多樣性造成表型異質(zhì)性的程度有多大？普遍認為癌癥遺傳譜是以存在表型可塑性的形式出現(xiàn)，以便于腫瘤動態(tài)適應(yīng)來自免疫和治療的壓力。然而，在給定環(huán)境下進化約束可能會限制腫瘤遺傳驅(qū)動的選擇從而造成表型的收斂，已經(jīng)有證據(jù)初步證明這個假設(shè)。比如：不同腫瘤的亞克隆或者不同的轉(zhuǎn)移位點在致癌過程或藥物治療中常常經(jīng)歷相同基因、通路或者蛋白質(zhì)復(fù)合物，是一個平行進化過程；同樣的，一個Von Hippel Lindau（希佩爾·林道綜合征，一種罕見的常染色體顯性遺傳性疾?。┎∪梭w內(nèi)四個相互獨立的腫瘤都會反復(fù)出現(xiàn)mTOR通路的活化。這些研究中值得注意的是：研究使用的腫瘤克隆或者亞克隆具有大量相同的體細胞突變和一些已知種系癌癥易感基因，這可能對進化分歧的內(nèi)在邊界進行了定義。從治療角度來看，一方面要增強對擴張競爭力的理解，另一方面腫瘤發(fā)生過程中基因組多樣性和異質(zhì)性限制的干預(yù)對于精準破譯人類癌癥至關(guān)重要。

MSLC指被診斷為相同或者不同肺葉中具有多個腫瘤結(jié)節(jié)的患者，因此，同一個MSLCs患者體內(nèi)的腫瘤具有相同的遺傳背景和生活環(huán)境。MSLC在肺癌中頻繁發(fā)生，但是關(guān)于同步多發(fā)腫瘤中的分子起源以及關(guān)系還尚未確定。通過對MSLC基因組分析確定其起源是否相同，是迄今還未被研究的領(lǐng)域，該領(lǐng)域研究將為腫瘤形成的進化機理提供一個獨特的研究方向。

本研究對MLSC患者的臨床樣本進行了詳細的遺傳分析和實驗分析。通過全外顯子測序揭示了每個患者體內(nèi)同步損傷的獨立性克隆，以及病灶內(nèi)和病灶間的基因組異質(zhì)性。然而，同步多發(fā)腫瘤的重要信號通路中不同致癌驅(qū)動因素的功能收斂可能是一個普遍性的原理，并有助于選擇合理的治療方案。因此，基因組異質(zhì)性的同時進化擴張和收斂可能競爭且協(xié)同地的促進肺癌或者其他惡性腫瘤的形成。

1  MSLC的克隆架構(gòu)和突變情況

為了進一步了解形成肺癌腫瘤的遺傳突變，研究人員采用4名(Table1)接受初始治療的患者(11處獨立病變的16個腫瘤樣本，都屬于腺癌)以及相鄰的正常組織DNA進行了全外顯子測序比較。平均覆蓋度為244x(205x-296x)。大約99%的靶標基因的覆蓋度在20x以上。研究人員在每個腫瘤組織中識別出了167-679個體細胞突變，至少一個腫瘤區(qū)域中總共存在373個非同義突變。為了確定MSLC是從一個具有胸部轉(zhuǎn)移或多個局部原發(fā)性腫瘤的單一病變中衍生出來的，非沉默突變被基于瘤內(nèi)分布進行了共有(出現(xiàn)在一個腫瘤以上)和特有的分類(只出現(xiàn)于一個腫瘤中)。此外，研究者構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹來評估每個病灶的遺傳關(guān)系(Fig.1a)。4個病人體內(nèi)任意一對腫瘤之間不存在共有的變異集，這和最近研究證明MSLCs是獨立克隆的起源保持一致。對兩塊較大的腫瘤組織進行多位點取樣測序發(fā)現(xiàn)，同一個腫瘤的多個測序樣品里存在很多共有的體細胞突變(Fig.1a)。這一觀察表明一個受試者體內(nèi)多個肺結(jié)節(jié)可能起源于不同的細胞。

Table1   MSLC組患者特征

在同個體內(nèi)肺癌的SNVs突變譜是一致的，然而在患者RJLC3中卻觀察到了明顯的不一致性。大多數(shù)樣品測試顯示了C>T和T>G顛換的優(yōu)勢，而非與煙草暴露相關(guān)的C>A轉(zhuǎn)換(Figure.1b),這一現(xiàn)象與患者的非吸煙史是相一致的。研究者檢測了先前報道過的在肺腺癌中反復(fù)出現(xiàn)的基因遺傳突變（EGFR，KRAS，MET，BRAF和TP53）。其它的候選驅(qū)動突變則常常影響基因的調(diào)控轉(zhuǎn)錄、MAPK信號、細胞粘附和存活的基因(Figure.1b)?？傮w來說，任何兩個腫瘤之間的共有驅(qū)動突變都很少，進一步表明這些MSLC組是獨立原發(fā)性腫瘤。將所有樣本分為兩個簇，突變特征的詳細分析表明來自同一患者體內(nèi)的腫瘤常常聚集到一起(Fig.1c)，RJLC3患者除外。這個結(jié)果驗證了不同部位腫瘤病變的發(fā)生是由不同的突變過程造成的。接下來運用deconstructSigs框架來提取每一個簇中可能促進特定突變特征中已知的突變特征。有趣的是，cluster1顯著富集了特征1(年齡相關(guān))，特征3(同源重組的DNA雙鏈斷裂失敗相關(guān))，特征9(促進聚合酶η并與AID活性相關(guān))和特征12(病因不明)。與此形成鮮明對比的是culster2幾乎完全以特征9表征，該特征之前在肺癌中沒有相關(guān)描述，僅在慢性淋巴細胞性白血病和惡性B細胞淋巴瘤中有記錄，要確定這些發(fā)現(xiàn)的機制基礎(chǔ)和生物學(xué)意義需要進一步的研究。

Fig.1

2 MSLC的病灶間和病灶內(nèi)部的遺傳異質(zhì)性

MSLC的深度基因組測序可以在患者間、病灶間、病灶內(nèi)等多層水平上描述腫瘤異質(zhì)性(Fig.2a)。每個MSLC患者具有特定的體細胞突變，經(jīng)過不同的突變譜和大量的非重疊外顯子取代進行驗證(Fig.2b)，這和肺癌的TCGA的遺傳異質(zhì)性是一致的。遺傳種系的傾向分析未發(fā)現(xiàn)有意義的且與肺癌易感性相關(guān)的SNP，進一步表明了每個腫瘤是由不同的體細胞遺傳改變的驅(qū)動結(jié)果。

為了進一步證實系統(tǒng)發(fā)育分析揭示的內(nèi)分泌多樣性，研究者在功能上推斷了每個腫瘤中最突出的癌癥驅(qū)動異常。KRAS是一種原癌基因，在RJLC2-T2(KRAS^G12D)和RJLC3-T3(KRAS^G12C)上，這可能引起MAPK信號的傳導(dǎo)。類似地，RJLC1-T1，RJLC1-T2和RJLC4-T1/T2/T3激活EGFR突變(EGFR^L858R、EGFR^{E746-A750 indel})或ERBB2的插入(HER2^YMVA)來增強癌化過程。MET突變可引起RJLC2-T3(c-MET^ΔE14)和ARAF^S214C中14號外顯子躍，這在最近的報道中被證實其在臨床模型和肺腺癌患者中具有致癌性。在RJLC2-T3中也可以檢測到ERBB3(HER3)和PDGFRB基因的突變，但是研究者發(fā)現(xiàn)這些突變不會造成AKT或ERK實質(zhì)性突變。值得注意的是，兩個位于蛋白激酶結(jié)構(gòu)域中與臨床相關(guān)的潛在突變，RJLC2-T1中的BRAF^D594G和MAP1K1中的MEK1^{E102-I103 indel}(MAP2K1編碼)。每種突變即使先前在各種癌癥類型中被發(fā)現(xiàn)，但并沒有明確地參與到肺部惡性腫瘤的驅(qū)動中。為了表征BRAF和MEK1突變的對功能的影響，我們使用KRASG12D作為陽性對照，采用人類胚胎腎細胞系KEK293T的異位表達突變的等位基因（一種永生化支氣管上皮細胞系BEAS-2B和肺腺癌細胞系LXF-289）。有趣的是BRAF^D594G在HEK293T中表現(xiàn)出對下游MAPK通路的減毒催化活性，與其高度保守的DFG基序以及先前報道的激酶失活性質(zhì)是一致的。BRAF^D594G在細胞BEAS-2B或LXF-289中是以依賴RAS/CRAF的方式轉(zhuǎn)化，這一結(jié)果通過phospho-ERK評估以及克隆形成和異種移植瘤的測定得到的(Fig.2c?e)。另一方面，MEK1^{E102-I103 indel}在三種細胞系中表現(xiàn)為生化獲得功能突變(Fig.2c?e)并且和體內(nèi)的MEK抑制劑密切相關(guān)。重要的是，研究者建立了病人肺腫瘤BRAFD594N來源的模型，增強了野生型BRAF的克隆生成。研究人員觀察到在靶向治療中對MAPK通路明顯的敏感性，特別是當dabrafenib和trametinib這兩種藥物組合使用的時候。這些數(shù)據(jù)的結(jié)果揭示了BRAF^D594G和MEK1^{E102-I103 indel}在肺癌中的致癌性和靶標性。病灶間異質(zhì)性在MSLC中非常常見，因此，每一個同步多發(fā)性腫瘤可能是由不同的分子機制驅(qū)動的。此外，所有的MSLCs都表現(xiàn)出CD3染色陽性，表明在早期肺癌中T細胞已經(jīng)滲透到腫瘤細胞中，每一個病變都可能會有不同的譜系和不同的抗原負荷，這預(yù)示著腫瘤相關(guān)淋巴細胞的功能異質(zhì)性和對治療方案不同的臨床免疫反應(yīng)。

為了評估MSLC病灶間異質(zhì)性的程度，研究者首先運用PyClone38和SciClone39進行了單樣本的克隆分析。兩種方法都顯示大多數(shù)樣本測序為寡克隆。然而假定的驅(qū)動突變被證明大部分克隆是基于癌細胞百分比的基礎(chǔ)上(百分比是指攜帶SNVs的癌細胞)(Fig.2f),這一結(jié)果與之前報道的肺癌的驅(qū)動突變發(fā)生于早期是一致的。此外，兩個較大的腫瘤(RJLC1-T1和RJLC4-T1)都進行了多區(qū)域測序(Mseq)，以便于更全面的探測病灶間進化。結(jié)合之前的觀察，對M-seq數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)圖發(fā)育重構(gòu)，生成了分支進化的模型(Fig.2g)。這兩種腫瘤的ITB(截短突變分支指數(shù))比最近由M-seq分析的肺腺癌都要高。每個腫瘤的點突變譜顯示了SNVs早期(主干)和晚期(分支)的時間差異。這和之前的相關(guān)報道一致，較高比率的體細胞突變可歸因于：在兩個腫瘤中APOBEC相比于主干而言在分支上介導(dǎo)誘變調(diào)節(jié)。此外，空間異質(zhì)性，如散發(fā)性突變特征指示，根據(jù)位置劃分的腫瘤區(qū)域具有顯著性(Fig.2g)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明動態(tài)突變過程隨著時間的推移形成了亞克隆基因組，從而促進大量的病灶間異質(zhì)性的形成。

Fig.2

3 多病灶病變中受約束的致瘤通路

研究人員注意到在每個MSLC中同一信號通路的病灶之間存在著顯著的異質(zhì)性驅(qū)動的生物學(xué)收斂。比如，RJLC1和RJLC4都改變了EGFR家族的受體絡(luò)氨酸激酶，然而RJLC2和RJLC3更傾向于影響MAPK通路。雖然這種現(xiàn)象讓人聯(lián)想到之前講到的平行進化原理，但是這種明顯的生物學(xué)收斂功能的推動力及其對腫瘤形成和治療的影響尚未得到解決。比如，這個領(lǐng)域中一個尚未解決的問題就是在不同腫瘤中是否存在特定的且不同的遺傳突變，造成相同或者不同治療響應(yīng)的產(chǎn)生。因此研究人員使用了獨特的MSLC體系來驗證每個患者中不同的驅(qū)動突變是否功能互換，這個原理已經(jīng)存在但是沒有在肺癌中被驗證。研究人員設(shè)計了一個實驗工作流程，使用CRISPR-Cas9 system(Fig.3b)特異性控制肺癌的細胞群體。最后敲除PC9細胞中的EGFRE746-A750 del，它會減弱phospho-AKT 和phospho-ERK，沒有PC9的EGFR細胞的存活時間很短。當往這些細胞中引入HER2^YMVA后，受損的AKT和ERK磷酸化以及生長能力都得到了很好的修復(fù)(Fig.3c)。因此，用HER2^YMVA代替EGFR^{E746-A750 del}對erlotinib來說是異常敏感的，erlotinib是對HER2活性較低的EGFR抑制劑，而不是像afatinib或者dacomitinib各自抑制EGFR2的激酶活性(Fig.3d)。為了構(gòu)建RJLC2和RJLC3模型，研究者將這種方法應(yīng)用于KRAS突變體的NCI-H1944細胞，發(fā)現(xiàn)BRAF^D594G, c-MET^ΔE14、ARAF^S214C、MEK1^{E102-I103 del}的表達確實可以在功能上消除KRAS^G13D的缺失(Fig.3e)。用攜帶KRAS^G12A的NCIH2009細胞得到類似的結(jié)果。從而可以得出MSLC獨立腫瘤中的進化軌跡可能受到約束從而引起致命致癌通路的優(yōu)先激活。

Fig.3

4   致癌通路收斂的獨立性驗證

有一些補充信息進一步佐證該研究隊伍所發(fā)現(xiàn)的MSLC發(fā)展中體細胞突變的生物學(xué)擴張收斂原理。首先，近期的小細胞MSCL病人組的基因組測序揭示了在不同腫瘤中相同癌基因的頻繁突變共存，即使這些細胞起源于不同的細胞。其次，研究者再次鑒定了兩名患有同步肺癌和乳腺癌的患者(RJLC5和RJLC6)(Fig.4a),她們都接受了腫瘤切除手術(shù)，研究者收集了這些病人的新鮮組織進行了全基因組測序(WGS)，基于體細胞的突變顯示了肺癌和乳腺癌腫瘤細胞的獨立性克隆。Circos圖分析顯示這些同步腫瘤之間沒有共同的結(jié)構(gòu)突變，進一步證實了這些腫瘤是通過不同的遺傳事件累積發(fā)展而成(Fig.4b)。每個患者的兩個腫瘤盡管來自于不同的組織但具有很相似的突變譜和突變特征。另外，研究者識別出c-MET^ΔE14、HER2^Y777L、EGFR-KDD、和HER4^N855K是腫瘤中具有主導(dǎo)性的四種突變(Fig.4b)，這表明了酪氨酸激酶受體在肺癌和乳腺癌中的中心收斂作用。最后，研究者測試發(fā)現(xiàn)在前瞻性研究結(jié)果中該研究具有潛在的治療意義。患者RJLC7由于持續(xù)的感染住院，隨后診斷為MSLC，在三個肺部結(jié)節(jié)中出現(xiàn)了一些磨玻璃影(GGO)。2018年8月，病人接受了視頻輔助胸腔(VATS)指導(dǎo)下的右上葉、右下葉以及淋巴的切除手術(shù)。兩個相對較大的病變被切除，病理學(xué)分級為pT1N0M0IA期肺腺癌。WES表明RJLC7-T1和RJLC7-T2都是多中心原發(fā)性腫瘤，但是有相同的突變譜和突變特征，兩種腫瘤都具有FGFR3中心的擴增功能。此外，研究者在RJLC7-T2和RJLC7-T1中分別檢測到BRAF^N581S和EGFR^L858R (Fig.4c)，并運用擴增難治性突變系統(tǒng)(ARMS)進行了證實。即使在左上葉的幾個小結(jié)節(jié)呈現(xiàn)局部病變，但是患者拒絕了繼發(fā)性外科手術(shù)以及分子分析活檢，進而選用了脫標簽的gefitinib藥物治療以了解她早期疾病的進展。對患者進行全程觀察并做了GGO回歸分析(Fig.4d)。雖然這些數(shù)據(jù)都必須謹慎使用，但EGFR靶標藥物的反應(yīng)顯示多病灶的區(qū)域?qū)GFR信號傳導(dǎo)的依賴性，這與在RJLC7-T1中發(fā)現(xiàn)被激活的EGFR^L858R突變是一致的。這些發(fā)現(xiàn)為MSLC的收斂演化提供了充分的證據(jù)。截至目前患者仍在接受治療，并且沒有顯著的不利影響。作為擴展，多中心計劃開展臨床調(diào)查以確定MSLC患者腫瘤進展中的擴張和收斂的程度以及意義。

Fig.4

從進化生物學(xué)角度來看，癌癥是一個腫瘤細胞和微環(huán)境相互作用不斷發(fā)展的生態(tài)系統(tǒng)。最適應(yīng)的克隆的生存和擴張都符合達爾文自然選擇規(guī)則。而且，不穩(wěn)定性是人類腫瘤的一個重要的特性，隨機誘變不斷發(fā)生可能會改變克隆適應(yīng)的表型。這些新突變的輪番出現(xiàn)和無處不在的陽性陰性選擇不可避免的造成了腫瘤內(nèi)和腫瘤間的異質(zhì)性。實際上，研究者提供的MSLC病灶內(nèi)和病灶間的基因組分子圖像解釋了即使在每個受試者具有相同遺傳背景和生活環(huán)境下仍然具有大量的異質(zhì)性。這些數(shù)據(jù)驗證并拓展了之前在非小細胞肺癌中觀察到的明顯的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，異質(zhì)性被推測復(fù)雜化了致命疾病的分子診斷和臨床治療干擾。

然而，遺傳異質(zhì)性的功能性和臨床相關(guān)性的程度是仍待解決的問題。本文研究解釋了大部分重要驅(qū)動突變是主克隆并且看似不同的多灶性腫瘤常常在選擇致癌通路時收斂，這為功能互換提供了證據(jù)。值得注意的是，研究者基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)開發(fā)了一種特定的實驗流程，并且正式證明了對于每一個MSLC的不同病灶給予等效的信號輸出和治療反應(yīng)具有不同的遺傳突變。因此這些數(shù)據(jù)有力的支持了在肺癌初期和進展中進化收斂的存在?？傊?，本文的研究強調(diào)了基因組多樣性和表型約束的共存，這可能是認識腫瘤進展的一個普遍原理，可能對識別和優(yōu)化治療方案具有潛在的作用。

總之，該項研究的發(fā)現(xiàn)不僅為運用基因組測序來區(qū)分MSLC患者可治愈的多發(fā)原發(fā)性腫瘤和不可切除的轉(zhuǎn)移性腫瘤提供了合理的應(yīng)用，而且也為腫瘤發(fā)生過程中驅(qū)動突變的平行進化和復(fù)發(fā)模式的評估提供了初步的證據(jù)。更加深入的了解控制腫瘤基因組多樣性和異質(zhì)性的同時擴張和收斂兩種進化力量的抗爭將有助于肺癌和其他惡性腫瘤的診斷治療。

1 患者信息描述：所有的腫瘤樣本來源于5個MSLC患者，其中兩個是肺腺癌和乳腺癌患者。所有的患者都接受手術(shù)切除后再接受其他形式的輔助治療，樣本來源于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，仁濟醫(yī)院。腫瘤樣本大小范圍在0.5cm-3.6cm，詳細的臨床描述見Table 1。對18個來源于5個MSLC患者的腫瘤樣本進行了全外顯子測序，對來自于同時患肺癌和乳腺癌的四個樣本進行了全基因組測序。

2 腫瘤組織處理過程：病理學(xué)家對每一個腫瘤組織樣本選取最多10um的新鮮凍樣以及旁邊的正常組織。由經(jīng)驗豐富的的肺癌病理學(xué)家決定HE染色切片來判定組織的非惡性基質(zhì)細胞相比于惡性細胞的比例以確定組織病理學(xué)亞型。對5 x 5 x 5mm³腫瘤組織用于DNA的提取。DNA通過Qubit進行量化，DNA完整性檢測通過瓊脂糖凝膠電泳。

3 全外顯子測序：paired-end DNA的建庫根據(jù)Agilent手冊進行，患者的基因組DNA通過Covaris S220超聲波打碎為180-280bp長度的片段。運用Illumina Hiseq 4000 測序平臺完成paired-end 150bp片段的測序，測序深度為200x。

4 全基因組測序：每個樣本提取1ug的DNA進行建庫，將其打碎為350bp長度的片段。運用Illumina Hiseq 4000 測序平臺完成paired-end 150b片段的測序，測序深度為60x。

5 序列比對和變異體識別：將得到的clean FastQ運用BWA和人類基因組UCSC hg19進行比對，結(jié)果文件儲存為BAM格式。SAMtools，Picard (http://broadinstitute.github/io/picard/), 然后采用GATK處理所得的BAM文件并計算序列的覆蓋率和深度。運用VarScan version 2.2.5和 MuTect識別體細胞SNVs，運用GATK Somatic Indel Detector檢測體細胞InDels。ANNOVAR用來處理得到的VCF文件。用到的基因轉(zhuǎn)錄注釋數(shù)據(jù)庫有Consensus CDS, RefSeq, Ensembl和UCSC。只有那些出現(xiàn)在外顯子或者標準的檢測位點的SNVs用于后續(xù)分析，剩余的非同義突變通過PolyPhen和SIFT進行功能預(yù)測最后采用Control-FREEC檢測體細胞CNV。

6 假定驅(qū)動突變的識別：將檢測到的所有非沉默突變和NSCLC中的潛在驅(qū)動基因進行比較，將p<><0.05或者ployphen得分> 0.995。然后在DNA充足可用時將這些假定的驅(qū)動突變進行Sanger測序驗證。突變蛋白結(jié)構(gòu)從Phyre2中獲得，制圖通過PyMOL完成。

7 突變譜分析：通過沉默和非沉默體細胞SNVs以定義突變特征。對每一個腫瘤樣本，參考hg19參考序列組提取5’和3’端序列中的突變，根據(jù)取代類型將SNVs劃分為C>A, C>G, C>T, T>A, T>C和 T>G類，然后繼續(xù)根據(jù)5’和3’端突變堿基繼續(xù)分解為96類。運用R的deconstructSigs包量化每個腫瘤特征的貢獻以便于將已知的突變特征和Wellcome Trust Sanger Institute Mutational Signature Framework進行比較。

8 克隆分析：運用PyClone和SciClone檢測亞克隆。PyClone運用MCMC方法進行變異體聚類。SciClone側(cè)重于基因組的拷貝數(shù)變異，雜合缺失識別。

9 癌細胞百分比分析：癌癥細胞百分比(CCF)得分定義為 ：      

10 新抗原預(yù)測：使用Polysolver進行HLA分型。使用NetMHCpan算法預(yù)測每個突變殘基的結(jié)合能力。結(jié)合力比野生型小并且小于500nm被判定為新抗原。

11 細胞培養(yǎng)和試劑：從ATCC或者JCRB中獲得腫瘤細胞系，進行細胞表征和感染。細胞培養(yǎng)在補充10%牛血清的RPMI1640中（Erlotinib, afatinib, docamatinib, trametinib, dabrafenib, and lapatinib購自Selleck Chemicals）。所有的抑制劑儲存在10mM的DMSO中。在細胞活力測定中，將細胞以每孔100000個細胞接種在補充有10%的FBS和2mM-L谷氨酰胺生長培養(yǎng)基的6孔板中，粘附過夜并連續(xù)使用稀釋的抑制劑處理一周。用結(jié)晶紫染色并用福爾馬林固定細胞。

12 CRISPR-Cas9 敲除：采用CRISPR-Cas9敲除技術(shù)分別敲除P9中的EGFR,以及H1944和H2009中的KRAS。

13 統(tǒng)計學(xué)分析：運用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計分析。Student’s t-test和ANOVA用于多組別之間的差異比較，P-values <>

參考文獻：

[1] Pengfei Ma, Yujie Fu, Mei-Chun Cai, et, al.[J].Nature Communications, 2017,823:Published online.