經(jīng)典EMSA是使用放射性同位素（一般為P32）標(biāo)記探針。由于P32的短壽命與放射性，用P32標(biāo)記探針只能經(jīng)實(shí)驗(yàn)者全手工用末端轉(zhuǎn)移酶或激酶進(jìn)行標(biāo)記。 如果順利，2天左右能獲得探針，但10多天后又要重新進(jìn)行標(biāo)記。市場(chǎng)上的EMSA探針末端標(biāo)記產(chǎn)品適合于同位素標(biāo)記，對(duì)非放射性標(biāo)記沒(méi)有什么用。
現(xiàn)在已很少有人用P32標(biāo)記探針做EMSA了。非放射性EMSA探針常采用生物素，熒光或地高辛（DIG）。非放射性分子標(biāo)記EMSA探針的最大好處是可以 在核酸合成過(guò)程中進(jìn)行標(biāo)記，具有高效，省時(shí)，費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)。
一、非放射性探針制作需掌握下面幾點(diǎn)：
（1）文獻(xiàn)查找與分析：1）如果利用實(shí)驗(yàn)者自測(cè)的基因序列做EMSA，需要對(duì)其進(jìn)行分析尋找TF結(jié)合序列，并與文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì)。2）在文獻(xiàn)中可以查 到大多數(shù)TF的結(jié)合序列，但最好進(jìn)行交叉驗(yàn)證以防出錯(cuò)。 3）需要注意文獻(xiàn)發(fā)表的探針序列可能并不適合做非放射性EMSA（見(jiàn)下面解釋）。
（2）探針設(shè)計(jì)：須注意 1）防止探針?lè)忾]成環(huán)，2）防止錯(cuò)位配對(duì)，3）排除目標(biāo)序列以外結(jié)合位點(diǎn)的，4）防止產(chǎn)生空間位阻，5）適當(dāng)考慮AT/GC比例，6）一般EMSA探針只有幾十堿基對(duì)。探針太長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生過(guò)多結(jié)合位點(diǎn)導(dǎo)致結(jié)果分析困難，還會(huì)產(chǎn)生超級(jí)螺旋結(jié)構(gòu)而掩蓋結(jié)合部位。
（3）核酸合成：1）合成量不能太少，量太少不準(zhǔn)確，易產(chǎn)生多余的單鏈。2）需要HPLC純化。3）如果是RNA探針，要防止降解。
（4）生物素或熒光標(biāo)記：1）建議采用Biotin或紅外熒光標(biāo)記，盡量不要采用DIG標(biāo)記。2）標(biāo)記只能在探針末端。3）為提高靈敏度，探針兩端都須有標(biāo)記。
（5）質(zhì)譜分析：用質(zhì)譜對(duì)探針進(jìn)行純度與分子量分析，以防出錯(cuò)。
（6）雙鏈制作：對(duì)配對(duì)的單鏈需進(jìn)行仔細(xì)計(jì)算，確?；パa(bǔ)鏈為等當(dāng)量反應(yīng)。探針中的多余單鏈所引起高背景，使非特異帶增加，致結(jié)果分析困難。
（7）比活性測(cè)定：新制作的探針需要稀釋后才能直接用于EMSA。稀釋度是通過(guò)將新探針做不同稀釋度后與已知量探針進(jìn)行比活性測(cè)定來(lái)確定的。
（8）制作應(yīng)用液：按比活性確定稀釋倍數(shù)，用TE稀釋制作探針應(yīng)用液，-20保存。
二、探針空間位阻問(wèn)題：
在32P標(biāo)記的探針中，磷酸基團(tuán)是DNA本身的結(jié)構(gòu)。用放射性P32代替P31的最大的好處是探針標(biāo)記只增加了1個(gè)電子（圖1），對(duì)探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)與結(jié)合能力的影響可忽略不計(jì)，EMSA結(jié)果最恒定。
我們比較放射性與非放射性EMSA時(shí)發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄因子用P32探針能夠出結(jié)果，但改用非放射性探針后就不能出結(jié)果。 一些轉(zhuǎn)錄因子用放射性探針與非放射探針的EMSA結(jié)果不一致。我們的進(jìn)一步分析顯示探針用非放射性分子標(biāo)記導(dǎo)致結(jié)果不一致的主要原因。對(duì)核酸探針而言， 非放射性標(biāo)記物都屬于外加分子（圖2為生物素標(biāo)記物，圖3為熒光分子標(biāo)記物）。為提高靈敏度，常常在探針兩端都進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記后的分子都會(huì)使原來(lái)的探針增加至少1000-2000道爾頓。如果采用文獻(xiàn)報(bào)道的長(zhǎng)度為20-22堿基（6-7千道爾頓)的EMSA探針, 標(biāo)記物占探針?lè)肿拥谋壤?div id="fbwnfa5u" class='imgcenter'>
由于我們的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)是從放射性EMSA過(guò)度到非放射性EMSA的，我們有條件將非放射性探針進(jìn)行各種比較，并找出可能解決方案并進(jìn)行驗(yàn)證。我們發(fā)現(xiàn)一些探針需改變長(zhǎng)度，一些需變更結(jié)合，一些需加入非離子去污劑才能獲得滿意結(jié)果。一些客戶做不出理想EMSA，探針問(wèn)題可能是其中一個(gè)重要原因。
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