作者首先實(shí)驗(yàn)證明了用small haripin RNA來knockout CARM1 只能達(dá)到90%的敲除效果，有趣的是，對(duì)CARM1的功能影響非常小，說明只需要極地量的CARM1就可以很好的發(fā)揮作用，所以作者設(shè)計(jì)了100%敲除CARM1的實(shí)驗(yàn)材料，通過zinc finger nuclease這種基因組編輯技術(shù)( 縮寫成ZFN技術(shù))。
這樣就能比較CARM1有無的機(jī)體種各種蛋白被催化狀態(tài)了，其中SWI/SNF(BAF) chromatin remodeling complex 染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物的一個(gè)亞基 BAF155，非常明顯的只有在CARM1這個(gè)基因完好無損的細(xì)胞系里面才能被正常的甲基化。作者證明了BAF155是CARM1這個(gè)基因非常好(拉丁語 bona fide)的一個(gè)底物， 而且通過巧妙的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，證明了BAF155這個(gè)蛋白的第1064位氨基酸(R) 是 CARM1的作用位點(diǎn)。
因?yàn)樵缇陀懈鞣N文獻(xiàn)說明了SWI/SNF(BAF) chromatin remodeling complex 染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物在癌癥的重要作用， 所以作者也很自然的想探究BAF155在癌癥的功能詳情。這里作者選擇的是CHIP-seq技術(shù)，因?yàn)锽AF155是轉(zhuǎn)錄因子的一種。（轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)是一群能與基因5`端上游特定序列專一性結(jié)合，從而保證目的基因以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。）CHIP-seq技術(shù)最適合來探究BAF155這樣轉(zhuǎn)錄因子的功能了，所以作者構(gòu)造了一種細(xì)胞系（MCF7），它的BAF155這個(gè)蛋白的第1064位氨基酸(R) 突變了，這樣就無法被CARM1這個(gè)基因催化而甲基化，然后比較突變的細(xì)胞系和野生型細(xì)胞系的BAF155的CHIP-seq結(jié)果，這樣就可以研究BAF155這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，是否必須要被CARM1這個(gè)基因催化而甲基化后才能行使生物學(xué)功能。
作者用me-BAF155特異性抗體+western bloting 證明了正常的野生型MCF7細(xì)胞系里面有~74%的BAF155是被甲基化的！
有一個(gè)細(xì)胞系SKOV3，可以正常表達(dá)除了BAF155之外的其余14種SWI/SNF(BAF) chromatin remodeling complex 染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物，而不管是把突變的細(xì)胞系和野生型細(xì)胞系的BAF155混在里面都可以促進(jìn)染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物的組裝，所以甲基化與否并不影響這個(gè)染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物的組裝，我們重點(diǎn)應(yīng)該研究的是甲基化會(huì)影響B(tài)AF155在基因組其它地方結(jié)合。
結(jié)果是，突變的細(xì)胞系和野生型細(xì)胞系種BAF155在基因組結(jié)合位置(peaks)還是有較大的overlap的，重點(diǎn)是看它們的peaks在各種基因組區(qū)域(基因上下游，5,3端UTR，啟動(dòng)子，內(nèi)含子，外顯子，基因間區(qū)域，microRNA區(qū)域)分布情況的差別，還有它們舉例轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離的分布區(qū)別，還有它們注釋到的基因區(qū)別，已經(jīng)基因富集到什么通路，等等這樣的分析。
雖然作者在人的細(xì)胞系(MCF7)上面做CHIP-seq，但是在老鼠細(xì)胞系(MDA-MB-231)做了mRNA芯片數(shù)據(jù)分析,BAF155這個(gè)蛋白的第1064位氨基酸(R) 突變細(xì)胞系，和野生型細(xì)胞系，用的是Affymetrix HG U133 Plus 2.0這個(gè)常用平臺(tái)
which was hybridized to Affymetrix HG U133 Plus 2.0 microarrays containing 54,675 probesets for >47,000 transcripts and variants, including 38,500 human genes.
To identify genes differentially expressed between MDA-MB-231-BAF155WT and MDA-MB-231-BAF155R1064K
我簡(jiǎn)單摘抄作者的對(duì)CHIP-seq數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析結(jié)果
## All samples were mapped from fastq files using BOWTIE [-m 1 -- best] to mm9 [UCSCmouse genome build 9]
## Sequences were mapped to the human genome (hg19) using BOWTIE (--best –m 1) to yield unique alignments
QuEST 2.4 (Valouev et al., 2008) was run using the recommend settings for transcription factor (TF) like binding with the following exceptions:
kde_bandwith=30, region_size=600, ChIP threshold=35, enrichment fold=3, rescue fold=3.
HOMER (Heinz et al., 2010) analysis was run using the default settings for peak finding.
False Discovery Rate (FDR) cut off was 0.001 (0.1%) for all peaks.
The tag density for each factor was normalized to 1x107 tags and displayed using the UCSC genome browser.
Motif analysis (de novo and known), was performed using the HOMER software and Genomatix.
Peak overlaps were processed with HOMER and Galaxy (Giardine et al., 2005).
Peak comparisons between replicates were processed with EdgeR statistical package in R
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