原文作者：Giorgia Guglielmi
單個神經元的膜電壓讀取將如何驅動神經科學的下一場革命？
2010年，生物物理學家 Adam Cohen在舊金山漫步的時候接到了一個意外的電話。 “我們看到了信號！”電話那一端說。在距離舊金山約5000公里的馬薩諸塞州劍橋，Cohen的同事已經有了關鍵的發(fā)現(xiàn)。經過幾個月的失敗，研究人員終于發(fā)現(xiàn)了一種熒光蛋白，通過這種熒光蛋白他們可以觀察到神經元之間的信號傳遞。
插圖作者：Joanna Gebal
然后詭異的事情發(fā)生了。Cohen回到哈佛大學實驗室之后了解到所有的實驗記錄都呈現(xiàn)出奇怪的發(fā)展趨勢。起初，當電信號傳遞時，表面用熒光蛋白標記的神經元都順利發(fā)光了。但過了一段時間神經元細胞就會變成明亮的斑點。 “每次實驗進行到中途，我們的信號蛋白就完全不受控制了。” Cohen說。
所以他決定親自參與一次實驗?！爱攲嶒為_始的時候，他們會坐在那里，連氣都不敢喘。”科恩說。但是一旦他們意識到熒光蛋白發(fā)揮作用了，他們就開始歡呼慶祝，“在房間里跳舞，跑來跑去?！?/span>
他們在狂歡中，把臺燈的光線照到顯微鏡上。 “我們的實驗實際上記錄了我們的興奮?！碑敃rCohen團隊中的一名研究生Daniel Hochbaum說。之后他們在慶祝時有所收斂。一年之后，Cohen團隊發(fā)表了他們的研究——這是將熒光蛋白導入特定哺乳動物神經元實現(xiàn)實時跟蹤電信號傳遞的最早研究之一。
幾十年來，神經科學家一直試圖觀察大腦語言的主要組成部分——傳遞極為迅速的電信號。雖然電極片能夠測定電壓，可靠地記錄單個神經元的活動，但卻很難同時捕捉很多信號，尤其是在觀察時間較長的情況下。
而在過去的二十年里，科學家們找到了能夠將熒光蛋白直接嵌入神經元細胞膜的方法，這種熒光蛋白可以指示電壓大小。通過合適的顯微鏡，科研人員能夠在神經元細胞進行信號傳遞的時候觀察到細胞亮起來——無論信號強弱，無論是“竊竊私語”還是“搖旗吶喊”。電壓成像能夠同時記錄許多神經元之間的電信號，然后將大腦組織不同區(qū)域的信號進行平均。Cohen說，這有助于研究人員在不同空間層面上研究大腦的電活動，不僅能聽到單個細胞的“私語”，也能聽到“群體的咆哮”。
在過去的5年里，科研人員就這一主題已發(fā)表了約1000篇論文，一些主要的資助項目，如美國國立衛(wèi)生研究院的BRAIN計劃，進一步加快了新型基因工程電壓標志物的開發(fā)。為找到更加合適的標志物，一些研究小組提出了以特定特性（如亮度）為目標篩選數(shù)百萬種蛋白質的策略。其中一種方法已經找到了新的蛋白，它的亮度是4年前發(fā)現(xiàn)的標志物的2倍。
隨著這些蛋白質特性的不斷優(yōu)化以及顯微鏡技術的進步，科學家希望能夠闡明神經科學最大的難題：大腦的細胞是如何協(xié)同工作，將電脈沖系統(tǒng)轉化為思想、行為和情感的。研究人員仍在努力捕捉全方位的大腦活動，設法觀察腦組織內深部神經元的快速激活。如果未來的進步可以解決這些技術挑戰(zhàn)，“那將會是革命性的?！备鐐惐葋喆髮W的Rafael Yuste說。他的研究方向是神經回路功能。
神經元電信號傳導速度極快
人類大腦平均包含大約1200億個神經元，它們不斷地通過被稱為樹突的分支結構接收和發(fā)送信息。到達樹突的化學或電信號會在細胞膜上引起小小的電壓變化，這種電壓變化會向細胞體傳遞。當電壓變化的總和達到一個激發(fā)水平（又稱為閾值）時，神經元會釋放一個電高峰，即一個動作電位。這一動作電位會沿著神經分支（被稱為軸突）以高達每秒150米的速度傳導，從這里，信息會以化學信號或電信號的形式傳遞給下一神經元的樹突。
神經元信號積聚、發(fā)散、協(xié)同，從而產生各種思想、情感、動作和反應，包括一瞬間臉紅和嬰兒打嗝等。但是科學家的觀察工具非常有限。20世紀40年代，像頭發(fā)一樣薄的微型電極被開發(fā)出來，它們可以插入大腦，抵著神經元甚至進入神經元內部，精確快速測量膜電壓。
但是這種方法只能同時監(jiān)測一個或幾個神經元，且監(jiān)測時間有限，因為電極最終會對細胞造成損傷。這就像試圖通過觀察一個樂手幾秒鐘來了解整個管弦樂隊的編排要領一樣。
多個微電極可以同時記錄多達200個細胞的電活動，但由于這些電極只是靠近而非進入神經元內部，它們只能檢測到動作電位，即電活動中最尖銳的高峰，對于未達到這一水平的電信號或者說未能引起動作電位的電壓變化則無法檢測到。這些亞閾值的電壓變化對大腦功能十分重要，因為正是這些電壓變化逐漸累加決定了神經元是否產生動作電位。
為了檢測大腦中更多細胞更低強度的電活動，科學家從20世紀60年代開始研究感應到電信號就會發(fā)出熒光的傳感器或者探頭物質。運用最廣泛的被稱為鈣指示劑。在發(fā)生動作電位時，鈣離子會流入神經元細胞內，這些指示劑與鈣結合時會發(fā)出熒光。
但這種鈣成像技術仍然只是間接反映而非直接記錄膜電壓。雖然鈣指示劑能夠反映動作電位等強度較大的信號，但它會忽略其它一些對大腦功能至關重要的事件，如膜電壓的細微波動或抑制動作電位的電信號。就好比我們只聽到了交響音樂會之后的掌聲：很明顯，表演已經進行過了，但樂隊演奏的是什么卻沒人知道。
20世紀70年代，科學家們開始開發(fā)染料傳感器，直接檢測膜電壓的變化。最早這類傳感器必須不加選擇地涂滿整個大腦，這也意味著它們會標記所有細胞類型，包括非神經細胞；在這種情況下，要解析特定神經元的活動就十分困難了。
隨后在20世紀90年代，研究人員開始測試可以通過基因工程標記特定神經元的指示物。第一個基因工程編碼電壓指示器（GEVI）于1997年被開發(fā)出來；自那以后，科學家們已經制造了二十多個傳感器。其中有些是將電壓敏感蛋白與熒光分子結合起來制成的（參見“熒光感受器”）。當這些蛋白質檢測到電壓的變化時，它們會改變自己的三維結構以及它們偶聯(lián)的分子的熒光。
還有的電壓指示器是微生物視紫紅質突變體，這種熒光分子感應到光時會引起細胞膜上的電壓變化。這種蛋白也可以反向工作，即根據(jù)膜電壓變化產生對光的反應，即發(fā)出熒光。
微小的信號同樣不容忽視
到目前為止，GEVI已可以成功檢測單個神經元細胞的動作電位，無論這個神經元是在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的還是在昆蟲、老鼠等多種動物完整的大腦中。Cohen 表示，這項技術最大的潛力在于它不僅可以記錄動作電位這種大事件，還可以記錄膜電壓微小的亞閾值變化，這些膜電壓變化反映了神經元從相鄰細胞接收的信息?！半妷撼上窨梢宰屇阍隗w內環(huán)境看到神經元接收的信息，這在以前是無法實現(xiàn)的?！?/span>
在過去的一年中，Cohen和他的同事開發(fā)了新的GEVI并改進了顯微鏡技術，以便同時記錄多個神經元的亞閾值電壓變化，甚至是在小鼠大腦內。他的團隊還實現(xiàn)了記錄時間的延長，現(xiàn)在他們能夠對同一個神經元的電活動進行長達一周的觀察。
麻省理工學院的神經科學家Ed Boyden認為，能夠確切地知道正在被記錄的神經元并進行持續(xù)追蹤有助于研究人員觀察到神經元之間的聯(lián)系。Boyden說，這樣“你就可以將大腦的結構與功能聯(lián)系起來，這是所有神經科學的核心問題之一”。
GEVI的另一個優(yōu)點在于，與主要記錄來自細胞體的信號的電極片不同，GEVI可以記錄神經細胞任何部分的電信號，直至樹突尖端（參見“GEVI的‘多層面’能力”）。這就像是能夠專門聽到鋼琴家左手演奏的音符?！斑@是我長期以來一直夢寐以求的事情，還有許多人和我一樣?！奔幽么罄郀柎髮W神經生物學家Katalin Toth說。許多神經科學家正在努力實現(xiàn)對整個神經元的電壓檢測，以了解細胞不同區(qū)域的電壓變化。
芝加哥大學的神經生物學家Wei Wei正在使用GEVI研究小鼠的視網膜神經元是如何整合不同的電信號輸入的。Wei的研究對象是那些對正在移動的視覺刺激最為敏感的神經元。她希望通過觀察這些神經元不同區(qū)域的膜電壓變化，了解神經元細胞是如何整合輸入信號來辨別刺激運動方向的。
巴黎高等師范學校的神經生理學家Vincent Villette計劃使用電壓傳感器，研究亞閾值電信號的規(guī)律波動如何介導小鼠小腦中的神經元協(xié)調肌肉活動?！皩τ诩毎绾螀f(xié)同工作仍存在許多未知?！盫illette說。
直接觀察膜電壓變化還能讓科學家們了解哪些電信號對神經元放電具有抑制而非觸發(fā)作用。法國地中海神經生物學研究所的神經生物學家Rosa Cossart表示，由于抑制信號不可能用鈣成像等方法進行記錄，因此目前人們尚不清楚這類信號是如何影響大腦活動的。
多年來，Cossart一直在使用電極和鈣成像，但她現(xiàn)在迫切地想要嘗試GEVI。她希望這些傳感器能讓她在活鼠體中快速同時測量多個神經元（至少50個）的電壓。Cossart說，這應有助于理解神經元群是如何通過整合刺激性和抑制性電信號維持那些對大腦發(fā)育和功能至關重要的活動的。
巨大挑戰(zhàn)
盡管人們對其期待值很高，但讓GEVI走進實驗室卻并非那么容易。以Helen Yang為例，Yang是斯坦福大學的研究生，她決定嘗試使用GEVI研究果蠅的視覺系統(tǒng)神經元。但是，在第一次實驗中，Yang在顯微鏡下并沒有看到細胞的熒光發(fā)生改變，即便是她在果蠅眼睛前照射一束明光時也沒有。
直到分析數(shù)據(jù)的時候她才意識到視覺刺激其實產生了信號，只不過這個信號非常小。“我非常興奮，但我的實驗室伙伴卻有點失望?！彼f，“因為這個信號非常小，噪聲又很大?！?/span>
于是Yang開始嘗試調整顯微鏡設置，增加激光功率，加快成像速度。她說：“我基本上已經調到了顯微鏡的最大速度?！边@是因為電壓感受器對電信號的反應非常快，以至于熒光的變化只能在幾分之一秒內被檢測到。“如果你只在細胞反應期間捕獲了一幀畫面，那這個反應自然看起來很小?！盰ang說。
Yang最終成功使用GEVI研究了果蠅的神經元是如何處理視覺信號的，但迄今為止，她所面臨的各種挑戰(zhàn)正阻礙電壓成像成為一種主流技術。Cohen說，電壓成像需要先進的，通常情況下是定制的顯微鏡?！皞鹘y(tǒng)熒光顯微鏡做不到這一點?！?/span>
斯坦福大學蛋白質工程師Michael Lin表示，在過去的五年里，BRAIN計劃所提供的資助推動了電壓成像領域的進步，包括開發(fā)出了更好的GEVI。
在開發(fā)新傳感器的同時，科學家也致力于探索能夠精確捕捉大腦內快速傳輸?shù)碾娦盘柕募夹g。目前存在的一大挑戰(zhàn)是，大多數(shù)現(xiàn)有技術僅適用于培養(yǎng)皿中或大腦表面的細胞。但問題是哺乳動物的大腦并不是透明的：事實上，它看起來像豆腐一樣，加州大學伯克利分校的物理學家Na Ji說。
為了能夠觀察大腦深部的神經元，研究人員只能使用一些更具侵入性的方法，比如去除一些覆蓋組織或將一種被稱為微內窺鏡的微小光學設備直接放置到大腦中。
另一種無創(chuàng)且能觀察深達1 mm的不透明組織的技術是雙光子顯微鏡。該技術使用的光波長更長，能量更低，能更深地穿透到組織中。雙光子顯微鏡一次僅從一個點進行照射和記錄，因此它們捕獲圖像的速度非常慢，無法跟蹤大腦內極為快速的信號傳遞。但專家們相信，技術的進步將很快能夠讓雙光子顯微鏡提速以捕捉GEVI發(fā)出的信號?！斑@絕對是可行的?！盝i說。
如果能夠克服這些挑戰(zhàn)，科學家們毫不懷疑電壓成像將成為觀察大腦活動的標準方法。斯坦福大學的神經生物學家Thomas Clandinin說：“在接下來的一兩年里，我們會看到許多應用電壓傳感器進行生物學研究的論文。”有人甚至認為電壓成像技術或將取代電極成為科研人員探索神經元如何處理和整合信息的常規(guī)方法。
年輕的科研人員對電壓成像的前景尤為樂觀：哈佛醫(yī)學院的博士后研究員Hochbaum表示，從長遠來看，GEVI將成為研究細胞不同部分如何對亞閾值信號做出反應的專業(yè)方法。他計劃使用電壓成像探究這些亞閾值信號如何改變神經元之間的連接，這恰恰是學習的核心過程。
Hochbaum說，這些可能性令人興奮，但是他從早年全實驗室一旦發(fā)現(xiàn)熒光就歡呼慶祝的經歷中學到了一個重要的教訓：即使實驗成功，也要在慶祝的時候保持最大程度的節(jié)制。
原文以A new way to capture the brain’s electrical symphony為標題
發(fā)布在2018年9月19日《自然》新聞特寫上
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