近幾年來，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的RNA被鑒定出來，其中大部分是長度 > 200 個核苷酸的非編碼RNA，定義為長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA , lncRNA)。
與mRNA編碼蛋白這一單一功能類分子不同，lncRNA分子功能呈現(xiàn)多樣性，核內(nèi)lncRNA多以順式調(diào)控cis、反式調(diào)控trans等方式影響基因表達；而胞漿定位的lncRNA以ceRNA機制為主。
今天我們不談機制，談談大家最關(guān)注的—lncRNA功能缺失的手段。
研究基因功能常規(guī)操作是功能獲得（過表達）以及功能缺失（干擾或敲除），RNAi技術(shù)是常用的敲減手段，但該技術(shù)針對lncRNA的敲減效果不盡如人意，這極大地阻礙了科研工作者對lncRNA的研究步伐。
我們來看看lncRNA沉默的方法及在應用中的優(yōu)劣勢。
方法一 RNAi
RNAi是由雙鏈RNA與Dicer酶形成的沉默復合物（RISC）介導的RNA降解，此方法助推了mRNA的功能研究，但lncRNA-RNAi效果差的原因如下：
1．lncRNA定位于細胞核，而Dicer酶位于細胞質(zhì)而非細胞核，也就是核定位lncRNA無法用RNAi實現(xiàn)敲減；
2．lncRNA含有復雜的結(jié)構(gòu)，自身形成互補配對，影響靶點結(jié)合，導致RNAi無效；
3．lncRNA與其他分子如蛋白質(zhì)、RNA、DNA等結(jié)合，影響靶點結(jié)合，導致RNAi無效；
……
所以，針對胞漿定位的lncRNA可以嘗試多設(shè)計一些靶點嘗試；而核定位的則不建議做RNAi。
RNAi
方法二 反義寡核苷酸（ASO）
ASO跟siRNA設(shè)計原理類似，只是化學成分上有區(qū)別。SiRNA是反義RNA，而ASO則是反義RNA、DNA的雜合物，胞漿定位的lncRNA由RNA-RNA形成的二元復合物以RISC的形式被Dicer酶講解，而核定位lncRNA則形成DNA-RNA復合物被RNase H分解（核糖核酸酶H，是一種核糖核酸內(nèi)切酶，可以特異性地水解DNA-RNA雜合鏈中的RNA）。
ASO是多能選手，但是化學合成的ASO只適合常規(guī)的細胞學實驗，不能做成穩(wěn)轉(zhuǎn)株進行長期研究，更不適合動物水平的基因功能研究。
ASO結(jié)合示意圖
方法三 轉(zhuǎn)錄抑制（CRISPRi）
CRISPRi系統(tǒng)是在DNA水平實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄抑制，dCas9（失去切割活性的cas9）與轉(zhuǎn)錄抑制域KRAB融合，表達的融合蛋白在gRNA介導下結(jié)合到啟動子區(qū)，并通過KRAB抑制PolII與啟動子的結(jié)合，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。
CRISPRi是在轉(zhuǎn)錄前發(fā)揮作用，所以不必考慮lncRNA本身的特質(zhì)，具有較廣闊的應用前景。但依然有兩方面的限制，一是受限于不同lncRNA的啟動子區(qū)染色體狀況，此種轉(zhuǎn)錄抑制并不能做到像RNAi那樣的干擾效率，也就是下調(diào)程度不穩(wěn)定；二是需要設(shè)計多個靶點并篩選，由此花費較高的成本。
方法四 敲除（KO）
上面介紹的3種方法，都有各自擅長的應用領(lǐng)域，接下來要給大家介紹一個比較全能的方法以及如何應用的？！
傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9廣泛用于編碼基因的敲除，具有DNA切割活性的CAS9搭配gRNA的引導，可完成指定染色體的斷裂，編碼基因的KO只需要一條設(shè)計在編碼區(qū)的gRNA即可，但lncRNA由于沒有像mRNA那樣明確的功能區(qū)，所以單條靶點的操作不適用。
針對lncRNA的cas9-ko，至少得一對靶點進行區(qū)段切除，那么區(qū)域的選擇就顯得至關(guān)重要。目前都是在以下區(qū)域進行設(shè)計的：
1. 針對lncRNA啟動子區(qū)設(shè)計：基因的表達都需要啟動子進行轉(zhuǎn)錄，缺失啟動子也就是失去了轉(zhuǎn)錄活性，無法表達;
2. 針對lncRNA本身：雙靶點分別設(shè)計在lncrna轉(zhuǎn)錄起始點和終止處，完成對lncRNA-exon+intron從基因組上的全部去除，達到ko的目的。
為了提升KO效率，小編特定搜羅了CRISPRlnc數(shù)據(jù)庫，收集了來自部分物種的經(jīng)驗證的lncRNA-CRISPR / Cas9 sgRNA，直接查詢基因名稱即可。
攜帶雙靶點的cas9病毒進入細胞之后進行DNA敲除，但是此法的限制是即便雙靶點都有效，并不能直接完成區(qū)段的敲除，而可能形成各自區(qū)域的錯配，達不到敲除的目的，因此驗證單個靶點有效性的錯配酶法不適用lncRNA的KO驗證，KO驗證方法如下：
1. 單/雙病毒感染細胞，以病毒載體攜帶的標記基因（熒光、抗性）篩選出混合細胞株；將混合細胞株分離一部分，進行基因組抽提；
2. 針對靶點兩端設(shè)計一對檢測引物，直接擴增步驟1抽提的基因組（PCR延伸時長根據(jù)NC中長度設(shè)定），然后以凝膠電泳鑒定。由于NC含有目的lncRNA，擴增產(chǎn)物較大或者擴增不出條帶（長度超過5k，擴增酶就很難擴增出來），而陽性細胞由于刪除的目的lncRNA，擴增產(chǎn)物較小，出現(xiàn)陽性條帶就表示有l(wèi)ncRNA-ko的細胞。
3. 若鑒定出陽性條帶，將混合細胞分離多皿單細胞培養(yǎng)（培養(yǎng)的皿數(shù)根據(jù)步驟2陽性條帶跟陰性條帶的差異而定，如果陽性條帶明顯強于陰性條帶，則分離到陽性細胞的概率就高，反之就低；常規(guī)推薦分離20-30皿）
4. 將分離的單細胞重復步驟2，即分離一部分抽提基因組再以相同引物驗證，直至能夠擴增出陽性片段，而沒有陰性產(chǎn)物（或者陰性產(chǎn)物條帶較弱為止）。此步驗證陽性的細胞即缺失了lncRNA的穩(wěn)定株。
5. 穩(wěn)定株可進行QPCR驗證以及進行下游功能實驗。
CRISPR/Cas9介導的lncRNA-KO最大優(yōu)勢是不受lncRNA本身特征的影響，做到完全敲除的效果；而其風險包含兩點：其一是靶點有效性—這點可以通過查詢有效靶點或者設(shè)計多套靶點以規(guī)避風險；其二是后期需要培養(yǎng)單細胞株，單細胞培養(yǎng)時間偏長（時間視細胞類型而定，常規(guī)在一個月左右）。
總之，針對lncRNA的下調(diào)，根據(jù)自己lncRNA的特征，選擇合適的操作工具才是王道。對于難敲減的lncRNA，cas9-ko永遠是最后的王牌，吉凱基因采取此法幫助多位科研大咖發(fā)表了高分文章，快來咨詢訂購吧?。?！
吉凱CRISPR/Cas9 慢病毒產(chǎn)品體系
產(chǎn)品名稱 | 簡介 | 產(chǎn)品規(guī)格 |
CAS9-定制-慢病毒（KO） | 用于敲除編碼基因，需提供靶點序列 | 1E+8TU（含等量對照） |
CAS9-Easy-慢病毒（KO） | 用于敲除編碼基因，提供3個sgRNA靶點，確保其中1個有效 | 1E+8TU（含等量對照） |
CAS9-定制-慢病毒(SAM) | 用于過表達編碼基因，需提供靶點序列 | 1E+8TU（含等量對照） |
CAS9-Easy-慢病毒(SAM) | 用于過表達編碼基因，提供3個sgRNA靶點，確保其中1個有效 | 1E+8TU（含等量對照） |
CAS9文庫（KO） | 高通量敲除基因的慢病毒文庫 | 1E+7TU-5E+8TU |
CAS9文庫（SAM） | 內(nèi)源性高通量上調(diào)編碼基因的慢病毒文庫 | 1E+7TU-5E+8TU |
使用吉凱CRISPR/Cas9 慢病毒產(chǎn)品發(fā)表的文獻
（部 分）
1. Negative feedback–defective PRPS1 mutants drive thiopurine resistance in relapsed childhood ALL，2015,Nature Medicine（IF:28.054），上海交通大學附屬兒童醫(yī)學中心.
吉凱產(chǎn)品：Cas9&RNAi 慢病毒
2. Long noncoding RNA lnc-TSI inhibits renal fibrogenesis by negatively regulating the TGF-β /Smad3 pathway.2018, Science Translational Medicine (IF=16.71),南方醫(yī)科大學.
吉凱產(chǎn)品：CRISPR-Cas9敲除慢病毒
3. A Novel Long Non-coding RNA Lnc-HC Binds hnRNPA2B1 to Regulate Expressions of Cyp7a1 and Abca1 in Hepatocytic Cholesterol Metabolism, 2016, Hepatology (IF=14.079),西安交通大學.
吉凱產(chǎn)品：CRISPR/Cas9 慢病毒
4. Loss of ERα induces amoeboid-like migration of breast cancer cells by downregulating vinculin,2017, Nature Communications (IF=12.124),.
吉凱產(chǎn)品：shRNA 和 CRISPR/Cas9 慢病毒
5. HMGB1 represses the anti-cancer activity of sunitinib by governing TP53 autophagic degradation via its nucleus-to-cytoplasm transport.2018, Autophagy(IF=11.1), 浙江大學.
吉凱產(chǎn)品：CRISPR/Cas9 慢病毒
6. Long noncoding RNA NEAT1, regulated by the EGFR pathway, contributes to glioblastoma progression through the WNT/β-catenin pathway by scaffolding EZH2,2018,Clinical Cancer Research(IF=10.199),哈爾濱醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院.
吉凱產(chǎn)品：Cas9&luciferase 慢病毒
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