競爭性內(nèi)源RNA(competingendogenous RNA,ceRNA)是指編碼RNA及非編碼RNA相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，目前ceRNA在人疾病中的研究十分火熱，對于研究非編碼RNA無疑是一種捷徑，但是由于ceRNA的預(yù)測相對已經(jīng)比較簡單，想要發(fā)表較高分的雜志，后期機(jī)制研究必須足夠嚴(yán)謹(jǐn)和充分，下面解讀的這篇文獻(xiàn)在研究思路和實(shí)驗(yàn)方法上，可以說是一篇完整的研究ceRNA功能的文章。
胃癌（GC）是最常見的癌癥之一，其中轉(zhuǎn)移成為GC臨床實(shí)踐中一個重大的挑戰(zhàn)，是GC死亡和復(fù)發(fā)的主要原因。目前已有很多關(guān)于轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究，但mRNA和非編碼RNA（ncRNAs）之間潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的作用還未被完全闡明。
6對胃癌組織和癌旁組織進(jìn)行mRNAs、miRNAs和lncRNAs microarray分析。
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CLDN4是miR-596和miR-3620-3p的靶標(biāo)
為了確定GC中mRNA和ncRNAs的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使用microarray 分析6對胃癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)的mRNAs、miRNAs和lncRNAs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，235種miRNAs，4329種lncRNAs，以及3369種mRNAs在兩種組織中差異表達(dá)。然后將microarray分析結(jié)果與差異表達(dá)的miRNAs的預(yù)測靶標(biāo)取交集。
根據(jù)差異表達(dá)mRNAspathway富集分析結(jié)果及miRNAs和lncRNAsmicroarray分析結(jié)果，選擇與癌癥發(fā)展有關(guān)的經(jīng)典通路中的經(jīng)典基因進(jìn)行ceRNA分析。
結(jié)果表明，Tight junction信號通路中, CLDN4和癌癥發(fā)生密切相關(guān)。進(jìn)而對CLDN4及相關(guān)的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，表明miR-596和miR-3620-3p直接靶定CLDN4，負(fù)調(diào)控CLDN4的表達(dá)。
圖1 GC中mRNA-lncRNA -miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
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CLDN4體外生物學(xué)功能
為了驗(yàn)證CLDN4的生物學(xué)功能以及與miR-596和miR-3620-3p的關(guān)系，在三種胃癌細(xì)胞系中，SGC-7901、AGS和HGC-27，過表達(dá)CLDN4。
結(jié)果表明，過表達(dá)CLDN4顯著上調(diào)GC細(xì)胞的增殖和侵襲能力，同時過表達(dá)miR-596或miR-3620-3p時可以消除這種影響。反之，在GC細(xì)胞系中敲降CLDN4時，細(xì)胞的增殖和侵襲能力受到抑制，同時抑制miR-596或miR-3620-3p的表達(dá)則恢復(fù)大部分影響。
同時，作者注意到過表達(dá)CLDN4誘導(dǎo)GC細(xì)胞出現(xiàn)間充質(zhì)樣形態(tài)特征，隨后對CLDN4與EMT相關(guān)基因的相關(guān)性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，相較于pEX2-NC細(xì)胞系，在GC細(xì)胞系中過表達(dá)CLDN4能夠誘導(dǎo)EMT。綜合這些結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CLDN4促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲以及EMT，同時miR-596和miR-3620-3p可消除部分影響。
圖2 CLDN4促進(jìn)GC細(xì)胞增殖和侵襲
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CLDN4和miRNAs在GC組織中的表達(dá)情況
對104對GC組織和癌旁組織中的CLDN4表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，76.92%的患者在癌組織中顯示更高的CLDN4表達(dá)水平，并且較高的CLDN4表達(dá)水平與總體存活率顯著相關(guān)。多因素Cox分析結(jié)果顯示較高的CLDN4表達(dá)是GC不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子。
同時，miR-596和miR-3620-3p在GC組織中表達(dá)水平顯著降低。20例GC組織原位雜交結(jié)果顯示，CLDN4、miR-596和miR-3620-3p主要在上皮和癌細(xì)胞中表達(dá)，主要定位于胞漿。
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lncRNAs通過直接結(jié)合與miRNAs相互作用
研究發(fā)現(xiàn)，在“Tightjunction”網(wǎng)絡(luò)中的14個候選lncRNA中，lncRNA-KRTAP5-AS1在過表達(dá)miR-596后下調(diào)最顯著，過表達(dá)miR-3620-3p后，lncRNA-TUBB2A和lncRNA-KRTAP5-AS1表達(dá)降低程度最明顯，并且過表達(dá)lncRNA-KRTAP5-AS1或lncRNA-TUBB2A上調(diào)CLDN4的表達(dá)。
構(gòu)建GFP-MS2-lncRNA融合表達(dá)載體，利用GFP蛋白進(jìn)行pull down,并對下拉產(chǎn)物進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，lncRNA-KRTAP5-AS1RIP的產(chǎn)物顯著富集miR-596和miR-3620-3p，同樣，lncRNA-TUBB2A RIP產(chǎn)物顯著富集miR-3620-3p。隨后RNA pull down實(shí)驗(yàn)為miRNAs和lncRNAs之間的相關(guān)性提供了更確切的證據(jù)，miR-596和miR-3620-3p可被生物素標(biāo)記的lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A拉下。
這些證據(jù)揭示了lncRNA-KRTAP5-AS1可以結(jié)合miR-596和miR-3620-3p，lncRNA-TUBB2A可以結(jié)合miR-3620-3p。
圖3 lncRNAs通過直接結(jié)合與miRNAs相互作用
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lncRNA作為ceRNA在體外調(diào)節(jié)細(xì)胞功能
基于Ago的RIP分析，可以通過免疫共沉淀富集到miRNA的結(jié)合靶標(biāo)。在GC細(xì)胞系中分別過表達(dá)lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A，Ago抗體下拉的產(chǎn)物中，富集到的CLDN4轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物顯著下降，存在較少的CLDN4與miRNA結(jié)合，表明lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A可以與CLDN4競爭性結(jié)合miRNAs。
lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A作為ceRNA調(diào)節(jié)CLDN4的表達(dá)，促進(jìn)GC細(xì)胞增殖、侵襲和EMT，lncRNA-KRTAP5-AS1充當(dāng)miR-596和miR-3620-3p的ceRNA，lncRNA-TUBB2A充當(dāng)miR-3620-3p的ceRNA。
圖4 LncRNA-KRTAP5-AS1和LncRNA-TUBB2A充當(dāng)ceRNAs
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ncRNAs在體內(nèi)調(diào)控CLDN4的功能
通過皮下移植的腫瘤模型和腫瘤轉(zhuǎn)移模型檢測不同細(xì)胞克隆對體內(nèi)增殖和轉(zhuǎn)移的影響，發(fā)現(xiàn)CLDN4促進(jìn)體內(nèi)增殖和轉(zhuǎn)移，其可以被miR-596和miR-3620-3p所抑制，但能被過表達(dá)lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A所增強(qiáng)。
1.通過構(gòu)建胃癌ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，尋找與胃癌發(fā)展密切相關(guān)的經(jīng)典mRNA及其ceRNA。
2.確定目標(biāo)分子-ceRNA后，在體內(nèi)體外對調(diào)控機(jī)制及功能進(jìn)行驗(yàn)證。
3.本文功能驗(yàn)證部分實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)且豐富，可以作為ceRNA后期驗(yàn)證的參考。
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