作者：蚍蜉玉
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一天tRNA急急忙忙找到mRNA告訴他：聽朋友圈里說課題組核酸界里多了一個環(huán)形的胖子RNA，功能齊全更重要的是可以編碼蛋白，mRNA一聽，像熱鍋上的螞蟻火急火燎的來看看到底這個環(huán)形的胖子如何編碼蛋白的？
那么今天分析的文章題目是《Extensive translation of circular RNAs driven by N 6 -methyladenosine》（回復170828可下載，一周有效）。circRNA主要通過反式剪切內(nèi)含子而來，與mRNA相比其可是去了頭又掐了尾，一個非經(jīng)典的剪切過程。
有大量的報道研究circRNA可以作為miRNA sponges與miRNA競爭性結(jié)合mRNA，也被稱為ceRNA，從而調(diào)控mRNA的翻譯和表達。大部分的環(huán)狀RNA的生物學功能還未曾可知。但是一個有趣的觀點是circRNA可以翻譯成蛋白，編碼蛋白，那么就來看看其是如何編碼的吧！
背景知識普及
N6甲基化（m6A）的基本介紹：
（1）m6A 在真核細胞中的表達廣泛。
（2）m6A 腺苷的甲基化被甲基轉(zhuǎn)移酶復合物（METTL3，METTL14以及Wilms’ tumor 1相關(guān)蛋白）所催化；m6A 可以被脂肪、FTO以及AKLBH5去甲基化。
（3）m6A 能夠被YTH家族（YTHDF1, YTHDF12 和YTHDF13）結(jié)構(gòu)域所識別。
（4）含有IRES的環(huán)狀RNA可翻譯蛋白，正如IRES一樣，含有m6A的環(huán)狀RNA中也翻譯蛋白。
以下就是文章的主要內(nèi)容介紹
（一）含m6A 基序的環(huán)狀RNA可以被翻譯
第一：含有m6A 基序的環(huán)狀RNA能夠表達GFP蛋白。
作者早前的研究工作已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含有IRES元件的反向拼接形成的環(huán)狀RNA可表達完整的GFP蛋白，課題組進一步驗證該現(xiàn)象時，發(fā)現(xiàn)一個驚人的結(jié)果：其它三個陰性對照組（不含IRES元件）都可以促進GFP的翻譯。為什么會出現(xiàn)這個奇怪的現(xiàn)象，原因是在起始位點附近都包含了RRACH片段，聚集了m6A 序列。
第二：m6A 最近被發(fā)現(xiàn)增加信使rna 的翻譯效率。
研究觀察的結(jié)果顯示m6A 聚集的RRACH的序列，可能卷入到了環(huán)狀RNA的起始翻譯過程中。
為了驗證這個假說，課題組在circRNA報告基因起始密碼子之前插入了含m6A 保守基序不同拷貝數(shù)的短片段，并檢測在293細胞中GFP蛋白的表達量。
如課題組預想的一樣，包含一個或者兩個基序的circRNA都翻譯了蛋白，而且突變的兩個基序明顯減少了GFP的表達量。另外有一個基序位點的環(huán)狀RNA與擁有兩個的基序位點相比有著同樣的翻譯效率，表明一個基序位點足夠引起翻譯，而當circRNA插入空白腺苷酸序列的時候，GFP就不表達了。
另外，課題組也檢測了其它兩種序列RSV 和RSVns，這兩個序列已經(jīng)被報道可以被m6A 修飾，而且這兩種序列可以明顯的增加蛋白翻譯。更重要的是突變該序列在減少了m6A 的甲基化水平的同時，也同樣削減了翻譯效率，進一步證明了m6A 能夠促使環(huán)狀RNA翻譯蛋白。
（二）環(huán)狀RNA中m6A 表達水平的變化影響著翻譯效率
第一：驗證m6A 序列是否一定要被甲基化才能促使環(huán)狀RNA翻譯。
課題組通過m6A 的抗體沉淀了中包含RSV m6A 位點的環(huán)狀RNA以及SON mRNA的蛋白，但是對照組卻不能沉淀下來。包含m6A 序列突變的環(huán)狀RNA也能被m6A 的抗體沉淀下來，但是翻譯效率急劇下降。
這些結(jié)果顯示，突變能夠減少部分但不能完全消減在RSV 位點上的m6A 的甲基化。
第二：共轉(zhuǎn)m6A 的去甲基化酶 FTO顯著減少了SON mRNA和circRNA 中GFP的蛋白表達量。
這些都表明具有m6A 位點的circRNA/mRNA是甲基化的，而且環(huán)狀RNA的翻譯需要m6A 的甲基化。
第三：共轉(zhuǎn)m6A 的甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3/14可以顯著增加 RNA-IP的信號。
在具有m6A基序的環(huán)狀RNA組和mRNA組中，而在對照組中是沒有增加的。同時，環(huán)狀RNA組中，也顯示增加了蛋白的翻譯水平。
有趣的是，當單獨轉(zhuǎn)染METTL14 時效果是不穩(wěn)定的，但是當共轉(zhuǎn)METTL3/14時不僅穩(wěn)定了METTL14而且也誘導了GFP蛋白的翻譯，這也可能提供了一個信息：METTL3/14很可能形成了一個復合物。
課題組還發(fā)現(xiàn) FTO 或者 METTL3/14的表達不能夠改變環(huán)狀RNA的水平，表明m6A 的修飾對環(huán)狀RNA的穩(wěn)定性不影響。這個觀察結(jié)果與之前報道的m6A 的修飾促進線性RNA的降解不同，這也從側(cè)面反映了環(huán)狀RNA有很好地穩(wěn)固性，m6A 的修飾帶來的小的不穩(wěn)定不明顯或者環(huán)狀RNA的降解與線性RNA的機制不同。
（三）m6A 促使環(huán)狀RNA的翻譯需要哪些蛋白因子的參與
第一：m6A 能夠促進環(huán)狀RNA的翻譯需要蛋白因子eIF4G2的參與。
課題組使用穩(wěn)定的細胞系表達兩種eIF4G2的干擾RNA，而后在環(huán)狀RNA和線性RNA中分別檢測編碼蛋白GFP的情況。
如所想的一樣，eIF4G2敲除的顯著減少了環(huán)狀RNA翻譯成蛋白，但是對線性RNA生成蛋白不影響。同樣的，去除eIF3A時，eIF3A是eIF3的一個亞基，可與病毒IRES相結(jié)合，能夠顯著減少環(huán)狀RNA對蛋白的翻譯但是對線性RNA沒有影響。
第二：課題組探索識別m6A 的蛋白是否是環(huán)狀RNA翻譯蛋白的必須蛋白。
課題組發(fā)現(xiàn)通過RNAi技術(shù)在環(huán)狀RNA和線性RNA中都敲除YTHDF1后不能夠影響翻譯成蛋白，而且YTHDF2敲除后輕度的抑制了GFP蛋白的生成，然而敲除YTHDF3后顯著的抑制了環(huán)狀RNA中GFP蛋白的生成而對線性RNA沒有影響，表明YTHDF3是m6A促使環(huán)狀RNA起始翻譯的識別蛋白。
而且通過CO-IP分析YTHDF3可以與eIF4G2相互結(jié)合，YTHDF3招募eIF4G2促使m6A翻譯蛋白。
以上實驗部分已經(jīng)做了豐富的驗證，那么接下來就是計算機的事了
（四）識別內(nèi)源性含m6A 基序修飾的環(huán)狀RNA
為了評估細胞中的環(huán)狀RNA m6A 修飾調(diào)節(jié)的重要性，課題組進行了測序，并且通過m6A -IP鑒定出13%總環(huán)狀RNA具有m6A修飾特性。
（五）評估編碼蛋白環(huán)狀RNA在人類基因組中的表達情況
第一：根據(jù)以上的觀察，課題組開發(fā)了一個計算機通道去預測內(nèi)源性可翻譯的環(huán)狀RNA。
首先在Hs68細胞系中通過耐RNase R性質(zhì)篩選7771個環(huán)狀RNA，第一次課題組就篩選出了623個環(huán)狀RNA 包含m6A 峰值。再用pre-mapped TIS技術(shù)又一次篩選出124個環(huán)狀RNA。最后課題組應(yīng)用了一個任意長度的開放閱讀框進行篩選，篩選出25個環(huán)狀RNA。在25個環(huán)狀RNA中與核糖體有關(guān)系的。
第二：以上的這些結(jié)果促使課題組驗證這些具有翻譯性質(zhì)的環(huán)狀RNA在人基因組信息中的匹配信息。
首先用梯度離心純化出多蛋白體相關(guān)的RNAs，然后將樣本用RNaseR消化處理后進行高通量測序。篩選出了250個與多蛋白體相關(guān)的環(huán)狀RNA，只有二十五分之一可翻譯的環(huán)狀RNA被預測到，可能是因為實驗方法尚有不足。
當與所有的環(huán)狀RNA做比較時，發(fā)現(xiàn)多蛋白體相關(guān)的環(huán)狀RNA有很少的外顯子組成而且基本上都很短；但是具有較長的開放閱讀框，這一點與預想的編碼蛋白一致。
第三：課題組將單體和多蛋白體相關(guān)的環(huán)狀RNA用熒光定量PCR技術(shù)去驗證，所選的7個環(huán)狀RNA是已經(jīng)確認與核糖體相關(guān)。
以上這些結(jié)果表明，包含m6A 并具有編碼蛋白功能的環(huán)狀RNA在人類基因組中是廣泛分布。
（六）質(zhì)譜分析環(huán)狀RNA翻譯的肽段
為了直接驗證環(huán)狀RNA編碼的內(nèi)源性蛋白，課題組設(shè)計了一個數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫包含測序分析出的反式剪切的環(huán)狀RNA的肽段，而且將這些肽段與蛋白數(shù)據(jù)庫聯(lián)系起來。結(jié)果課題組篩選出33個肽段，但是與蛋白數(shù)據(jù)庫匹配的不是很多。
為了更深一步探索候選的環(huán)狀RNA編碼的肽段，課題組使用化學方法人工合成候選環(huán)狀RNA編碼的肽段然后去進行質(zhì)譜分析。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)有兩個合成的環(huán)狀RNA的肽段與原始的肽段相匹配，表明經(jīng)過蛋白質(zhì)組學鑒定的肽段可能是產(chǎn)生于環(huán)狀RNA的翻譯。這些肽段僅僅是環(huán)狀RNA編碼蛋白質(zhì)組的一小撮，因為只有肽段測序到反式剪接相連才是環(huán)狀RNA編碼的產(chǎn)物。
如果你覺得文中內(nèi)容太多，那看看作者嘔心瀝血作的m6A 促使環(huán)狀RNA翻譯的模式圖吧！如下：
m6A 促使的起始翻譯需要起始轉(zhuǎn)錄因子eIF4G2和m6A 閱讀器YTHDF3的參與，增強翻譯的是甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3/14，抑制翻譯的是去甲基化酶 FTO。
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