Activation of the Galpha subunit of a G-protein-coupled receptor
G蛋白偶聯(lián)受體簡(jiǎn)介
(GPCR，G-protein-coupled receptors)在人體中有超過(guò)800種家族成員，其中包括370類以上的非嗅覺(jué)功能性受體。GPCR、G蛋白及下游信號(hào)通路的功能異?；蛲蛔兊漠a(chǎn)生往往跟很多人類疾病相關(guān)，通過(guò)藥物對(duì)GPCR功能進(jìn)行干預(yù)也已成功應(yīng)用于諸多疾病的治療，如心血管疾病、內(nèi)分泌學(xué)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的疾病。毫不意外，目前包括處方藥在內(nèi)所有的獲批上市藥物中，約有40%通過(guò)作用于GPCR而發(fā)揮作用。GPCR信號(hào)可做用于細(xì)胞內(nèi)的多條信號(hào)傳導(dǎo)途徑。相應(yīng)的激活劑結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致GPCR發(fā)生構(gòu)象變化從而通過(guò)異源三聚體的G蛋白影響下游信號(hào)?；罨蟮腉PCR同G蛋白的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致分子亞基中GDP與GTP的交換，以及G蛋白亞基的解離。Gα與Gβγ隨后會(huì)激活下游信號(hào)通路，導(dǎo)致胞內(nèi)cAMP或鈣離子水平的改變、激活或抑制離子通道、激活其他一些級(jí)聯(lián)信號(hào)通路。GPCR信號(hào)的終止也存在多種機(jī)理，包括配體的解離、受體被特異性激酶磷酸化、β?arrestin的結(jié)合以及受體的內(nèi)吞過(guò)程。
G蛋白偶聯(lián)受體參與眾多生理過(guò)程，包括但不限于下述作用。
感光：視紫紅質(zhì)是一大類可以感光的G蛋白偶聯(lián)受體，它們可以將電磁輻射信號(hào)轉(zhuǎn)化成細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)信號(hào)，引導(dǎo)這一過(guò)程的反應(yīng)稱為光致異構(gòu)化(Photoisomerization)，具體細(xì)節(jié)為由視蛋白(Opsin)和輔因子視黃醛共價(jià)連接所構(gòu)成的視紫紅質(zhì)在光源的刺激下，分子內(nèi)的視黃醛會(huì)發(fā)生異構(gòu)化，從“11-順式”變成“全反式”，這個(gè)變化進(jìn)一步引起視蛋白的構(gòu)象變化從而激活與之偶聯(lián)的G蛋白，引發(fā)下游的信號(hào)傳遞過(guò)程。
嗅覺(jué)：鼻腔內(nèi)的嗅上皮(Olfactory epithelium)和犁鼻器上分布有很多嗅覺(jué)受體，可以感知?dú)馕斗肿印?/span>
行為和情緒的調(diào)節(jié)：哺乳動(dòng)物的腦內(nèi)有很多掌控行為和情緒的神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)應(yīng)的受體是G蛋白偶聯(lián)受體，包括血清素，多巴胺，γ-氨基丁酸和谷氨酸等。
免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)：很多趨化因子通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體發(fā)揮作用，這些受體被統(tǒng)稱為趨化因子受體；其它屬于此類的G蛋白偶聯(lián)受體包括白介素受體(Interleukin receptor)和參與炎癥與過(guò)敏反應(yīng)的組胺受體(Histamine receptor)等。
自主神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)：在脊椎動(dòng)物中，交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)的活動(dòng)都受到G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，它們控制著很多自律的生理功能，包括血壓，心跳，消化等。
細(xì)胞密度的調(diào)節(jié)：最近在盤(pán)基網(wǎng)柄菌中發(fā)現(xiàn)了一種含有脂質(zhì)激酶活性的G蛋白偶聯(lián)受體，可以調(diào)控該種黏菌對(duì)細(xì)胞密度的感應(yīng)。
維持穩(wěn)態(tài)：如機(jī)體內(nèi)水平衡的調(diào)節(jié)等。
Two-dimensional schematic of a generic GPCR set in a Lipid Raft
經(jīng)典的GPCR分子由三部分構(gòu)成，分別是胞外長(zhǎng)度約10-600個(gè)氨基酸的N段結(jié)構(gòu)域、7次跨膜的α螺旋結(jié)構(gòu)域(TMDs)及胞內(nèi)的C端區(qū)域。胞外區(qū)域的抗體表位主要包括N端結(jié)構(gòu)域以及3個(gè)胞外的環(huán)狀區(qū)域(ECL1-3)。這些胞外區(qū)域可能以無(wú)固定結(jié)構(gòu)的可變?nèi)嵝詤^(qū)域存在，也可能形成固定的二級(jí)結(jié)構(gòu)；同時(shí)還伴隨著高頻率的糖基化現(xiàn)象發(fā)生。GPCR的胞外Loop大小不一，分布范圍在5-170個(gè)氨基酸之內(nèi)。在很多種GPCR成員中，存在一個(gè)高度保守的二硫鍵，從而將α螺旋3的頂部同ECL2連接在一起。N端結(jié)構(gòu)域則隨著超家族的不同而變化巨大。
已開(kāi)發(fā)的靶向于GPCR分子的藥物主要是小分子藥物及低分子量的多肽類藥物。然而，考慮到單克隆抗體藥物相比于小分子藥物的諸多好處，以及獲得某些靶向于特定GPCR小分子藥物的困難性，醫(yī)藥工業(yè)界對(duì)于靶向于GPCR分子的單克隆抗體類藥物的研發(fā)興趣日益增加。
單抗類藥物在靶向GPCR中的優(yōu)勢(shì)
Potential mAb interactions with a GPCR
盡管GPCR家族在所有成藥性靶點(diǎn)中占比最大，但仍有四分之三的GPCR成員尚未被開(kāi)發(fā)成藥物靶點(diǎn)；目前只有約80種GPCR分子具有相對(duì)應(yīng)的小分子藥物，近30種GPCR分子相應(yīng)藥物為多肽分子，通常與人體內(nèi)自然存在的配體相關(guān)。針對(duì)GPCR靶點(diǎn)的藥物開(kāi)發(fā)主要受困于尋找到具有合適選擇性以及類藥物性質(zhì)的分子。對(duì)于小分子藥物而言，其通常結(jié)合在配體結(jié)合的保守位點(diǎn)，因而對(duì)于相近的受體成員間的選擇性較差；而抗體則具有很高的特異性，還可靶向于非保守的位點(diǎn)區(qū)域。另外，對(duì)于高通量篩選而獲得的小分子化合物，往往還存在因高度親脂性及分子量特點(diǎn)所帶來(lái)的藥物脫靶毒性。
相比于小分子藥物，單克隆抗體類藥物具有以下優(yōu)點(diǎn)：具有更佳的特異性、用藥頻率優(yōu)勢(shì)以及能夠有限制的滲透入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而有潛力作用于小分子在體內(nèi)接觸不到的靶點(diǎn)。除此之外，單抗類藥物在不同患者個(gè)體間的藥代動(dòng)力學(xué)差異很??；并可通過(guò)人源化方式去除潛在的T細(xì)胞抗原表位，或者選擇合適的給藥途徑來(lái)降低免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)。除了具有所需的選擇性、高度靶點(diǎn)親和力以及提升的血漿半衰期外，單抗類藥物還能通過(guò)抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)，補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)及抗體依賴的細(xì)胞吞噬作用(ADCP)而殺死細(xì)胞。另外，單抗類藥物還存在不同形式，比如抗體片段、雙特異性及多特異性抗體以及抗體偶聯(lián)藥物(ADC)等。
除此之外，單抗類藥物相比于小分子及多肽類藥物還有其他一些優(yōu)點(diǎn)。比如，CCR4特異性的單抗藥物mogamulizumab在CCR4拮抗劑缺失的情況下可通過(guò)消除惡性CCR4陽(yáng)性的T細(xì)胞而發(fā)揮作用；目前尚不清楚采用小分子CCR4拮抗劑類藥物能否達(dá)到相似的治療效果。單抗類藥物作用于受體的胞外區(qū)域，可以穩(wěn)定多種不同的分子構(gòu)象；而小分子藥物只能作用于TMD結(jié)構(gòu)域。總體上單抗類藥物可以通過(guò)多種方式改變GPCR信號(hào)，而其中一些同小分子藥物的作用機(jī)制完全不同。首先，單抗分子可以封閉天然配體在受體上的結(jié)合，或者結(jié)合于相同或者重疊的區(qū)域，或者作用于活性位點(diǎn)外的區(qū)域。其次，抗體有可能通過(guò)空間位阻而直接封閉掉配體進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)的可能。第三，抗體的結(jié)合能夠穩(wěn)定受體的非活化狀態(tài)，從而阻止對(duì)于G蛋白或其它信號(hào)傳導(dǎo)所必須的構(gòu)象變化的發(fā)生。第四，抗體可以在天然配體缺失的情況下，通過(guò)穩(wěn)定受體活化形式而激活信號(hào)通路。抗體可以通過(guò)降低激活劑的解離等級(jí)制，穩(wěn)定激活劑結(jié)合的受體構(gòu)象，從而增加信號(hào)的傳導(dǎo)。第六，抗體有可能引起受體的內(nèi)吞，從而降低信號(hào)強(qiáng)度。第七，雙價(jià)抗體有望通過(guò)促進(jìn)分子的二聚化而改變GPCR信號(hào)的傳導(dǎo)。以上作用機(jī)制如上圖所示。
最后，生物制品類藥物(單抗類藥物占據(jù)了絕大多數(shù))的總體失敗率遠(yuǎn)小于小分子藥物：約有25%的進(jìn)入臨床前研究的生物制品最終獲批上市，而對(duì)小分子藥物而言這一數(shù)字為7%。另外，在研發(fā)過(guò)程的任一階段，生物制品表現(xiàn)都要優(yōu)于小分子藥物，并且具有更高的轉(zhuǎn)化率。
靶向GPCR的單抗類藥物應(yīng)用領(lǐng)域
The landscape of GPCRs targeted by antibodies
GPCR成員可通過(guò)序列保守性而在人類基因組中加以確認(rèn)；但仍有很多分子目前其相應(yīng)的內(nèi)源性配體未知，被稱為孤兒受體。盡管科學(xué)家們做了很多常來(lái)試圖確認(rèn)這些受體的天然配體，迄今仍有127種受體尚處于孤兒狀態(tài)。GPCR家族中的孤兒受體具有很高的藥物靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)價(jià)值，因?yàn)樗麄冎械暮芏嗤姸嗉膊∶芮邢嚓P(guān)，如癌癥、精神紊亂、糖尿病與肥胖以及各類炎癥性疾病等。從另一個(gè)角度講，直接作用于孤兒GPCR的抗體是一種探索該類受體功能機(jī)理的很好的工具，有望闡明他們?cè)诩膊≈械陌悬c(diǎn)性作用；同時(shí)也是在配體未知情況下，開(kāi)發(fā)靶向于該類別受體藥物的一種有效方式。與功能相對(duì)應(yīng)，靶向于GPCR分子的抗體類藥物有望在多個(gè)疾病治療領(lǐng)域發(fā)揮作用，目前占比較大的仍是癌癥、炎癥性疾病及代謝性疾病三大類別。
靶向GPCR的單抗類藥物研發(fā)現(xiàn)狀
GPCR-targeting antibodies in clinical development
隨著單抗類藥物開(kāi)發(fā)技術(shù)的進(jìn)步，GPCR也成為該類別藥物開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)，目前主要工作集中于腫瘤學(xué)、炎癥性疾病、自體免疫性疾病及代謝性疾??；另外也有很多研發(fā)項(xiàng)目在感染性疾病、疼痛、偏頭疼和纖維化等領(lǐng)域開(kāi)展。靶向于GPCR家族的單抗類藥物管線正吸引了越來(lái)越多的商業(yè)關(guān)注，進(jìn)入了快速發(fā)展的軌道。目前至少有74個(gè)研發(fā)項(xiàng)目集中于37種GPCR分子上，共有57中單抗類藥物正處于發(fā)現(xiàn)及臨床前研究階段，而39種則已經(jīng)進(jìn)入了不同的臨床研發(fā)階段；各項(xiàng)數(shù)字相比于2010年有了巨大飛躍，部分在研藥物信息總結(jié)如下。
Mogamulizumab
Mogamulizumab
迄今為止，只有Mogamulizumab一種靶向于GPCR的單抗類藥物獲批上市。Mogamulizumab由日本協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會(huì)社(Kyowa Hakko Kirin)研發(fā)，于2012年3月30日獲得日本PMDA批準(zhǔn)上市并在日本市場(chǎng)銷售，商品名為Poteligeo?。Mogamulizumab是一種靶向于CC趨化因子受體4 (CCR4)的人源化單克隆抗體，CCR4則是表達(dá)于調(diào)節(jié)T細(xì)胞和輔助T細(xì)胞上的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。該藥批準(zhǔn)的適應(yīng)癥為CCR4陽(yáng)性成人T細(xì)胞白血病、CCR陽(yáng)性外周T細(xì)胞淋巴瘤和CCR4陽(yáng)性皮膚T細(xì)胞淋巴瘤。Poteligeo?是一種靜脈滴注用溶液，每瓶共5mL含20mg Mogamulizumab。推薦劑量為每次1mg/kg，每周一次，共8次。
潛力研發(fā)方向
伴隨著抗體開(kāi)發(fā)技術(shù)及靶點(diǎn)生物學(xué)功能基礎(chǔ)研究的推進(jìn)，抗體藥物的發(fā)現(xiàn)及開(kāi)發(fā)過(guò)程也迎來(lái)了快速發(fā)展期。除了經(jīng)典抗體藥物研發(fā)路線外，新技術(shù)平臺(tái)基礎(chǔ)上的以下研發(fā)思路也值得重視：
Mechanism of ADC
抗體偶聯(lián)藥物(ADC)
抗體偶聯(lián)藥物占據(jù)了所有單抗類藥物臨床研發(fā)管線的11%，如果只看針對(duì)腫瘤領(lǐng)域的研發(fā)管線，則占比高達(dá)20%。近幾年，全球已掀起抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)研發(fā)的熱潮。ADC類藥物被認(rèn)為能夠更加高效和有效的治療腫瘤等疾病，在未來(lái)將成為治療疾病的重要手段。根據(jù)全球知名市場(chǎng)調(diào)研公司Research & Markets發(fā)布的一份報(bào)告，未來(lái)10年，ADC市場(chǎng)將經(jīng)歷飛速發(fā)展。目前，F(xiàn)DA總共批準(zhǔn)了3種ADC藥物(Mylotarg，Adcetris，Kadcyla)上市，其中Mylotarg于2010年從美國(guó)撤市。未來(lái)10年，預(yù)計(jì)將會(huì)有7-10個(gè)ADC新藥上市，2024年ADC市場(chǎng)將達(dá)到100億美元。
LGR5是第一個(gè)被用于ADC藥物靶向的GPCR成員，其他還包括一類新型人源化的靶向CXCR4的ADC類藥物，可輸送LCK抑制劑Dasatinib至人體T淋巴細(xì)胞用于選擇性的免疫抑制；以及通過(guò)AmbrX制備的靶向于CXCR4的ADC，可用于免疫性疾病及銀屑病的治療。近期還有一類可將基于Auristatin的微管抑制劑類藥物輸送至內(nèi)皮素B受體的ADC正在開(kāi)展臨床前測(cè)試，來(lái)觀察單獨(dú)給藥或同BRAF及MEK激酶小分子抑制劑聯(lián)用時(shí)對(duì)黑色素瘤的治療效果。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，抑制BRAF或MEK的活力會(huì)增加內(nèi)皮素B受體的表達(dá)量，從而可以提升該ADC藥物的抗腫瘤活性；目前該抗體已在黑色素瘤中開(kāi)展一期臨床研究。另外，一種靶向于FZD7的ADC類藥物也已被Concortis公司列上研發(fā)管線。伴隨著GPCR作為靶點(diǎn)基礎(chǔ)生物學(xué)研究的深入，以及人類對(duì)于生物制劑及化學(xué)物靶點(diǎn)選擇性的掌控，將會(huì)逐步提高ADC類藥物的療效，并降低脫靶效應(yīng)的影響。
Schematic overview of the different strategies used to generate bispecific antibodies (bsAbs)
雙特異性抗體
雙特異性抗體占據(jù)了所有單抗類藥物臨床研發(fā)管線的9%，如果只看針對(duì)腫瘤領(lǐng)域的研發(fā)管線，則占比提升至11%。迄今為止，總共有兩種雙特異性抗體獲批上市，1種處在三期臨床階段，12種處在二期臨床階段，41種則正在開(kāi)展一期或一/二期臨床研究。對(duì)于腫瘤適應(yīng)癥而言，約有一半的雙特異性抗體靶向于腫瘤特異性抗原及CD3，從而引導(dǎo)T細(xì)胞至腫瘤細(xì)胞，而使其選擇性殺死腫瘤細(xì)胞。雙特異性抗體相比于小分子藥物，多肽類藥物及單純的單抗類藥物有優(yōu)勢(shì)，并且能夠克服腫瘤細(xì)胞的多重耐藥性。預(yù)計(jì)未來(lái)的6-8年，將會(huì)有更多的雙特異性抗體類藥物獲得批準(zhǔn)上市。
MCLA-158是一類靶向于LGR5及EGFR的雙特異性抗體，目前正開(kāi)展針對(duì)結(jié)直腸癌的臨床前研究，并計(jì)劃于2017年底啟動(dòng)臨床研究。該藥物采用了Merus公司的獨(dú)特技術(shù)開(kāi)發(fā)，采用了兩種不同的作用機(jī)制：阻斷腫瘤干細(xì)胞生長(zhǎng)及存活的信號(hào)通路；召集并促進(jìn)免疫因子細(xì)胞對(duì)于腫瘤干細(xì)胞的直接殺傷作用，后者往往存在于實(shí)體瘤中并于腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
A shark (left) and a camelid (middle) heavy-chain antibodyin comparison to a common antibody (right)
單域抗體
其他類別的抗體形式或蛋白支架類藥物同樣可用來(lái)靶向于GPCR分子。這些不同的抗體形式為探索GPCR分子的識(shí)別決定因子提供了多樣化的工具；并且當(dāng)克服了免疫原性及藥代動(dòng)力學(xué)的諸多問(wèn)題后，有望開(kāi)發(fā)成為新型藥物。納米抗體使用的單域抗體平臺(tái)來(lái)自免疫羊駝和僅有重鏈的抗體庫(kù)。最小的抗體來(lái)源的結(jié)合結(jié)構(gòu)為獨(dú)立的V型結(jié)構(gòu)域。最新的研究發(fā)現(xiàn)，駱駝及軟骨魚(yú)類具有的高親和力的V型結(jié)構(gòu)裝載于Fc等效性結(jié)構(gòu)與上作為他們免疫系統(tǒng)的一部分。這些V型結(jié)構(gòu)域在駱駝中稱之為VHH或納米抗體，而在鯊魚(yú)中則稱之為VNARs。駱駝中的納米抗體通常分子量為12-15kDa。除了用于GPCR結(jié)構(gòu)研究外，一些靶向于GPCR的納米抗體也在藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中脫穎而出。目前兩類分別靶向于CXCR2及CX3CR1的納米抗體已經(jīng)進(jìn)入了一期臨床研究階段，分別用于腫瘤及慢性腎病的治療；另有一類CXCR4-CD4雙特異性納米抗體用于阻斷艾滋病毒感染。
總結(jié)
作為一類重要的藥物靶點(diǎn)分子，GPCR在藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域吸引著越來(lái)越多的關(guān)注，特別是在單抗藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域。越來(lái)越多的臨床藥物實(shí)驗(yàn)拓展至靶向GPCR的抗體藥物中。人類對(duì)于GPCR在腫瘤學(xué)中生物性質(zhì)的認(rèn)識(shí)，特別是腫瘤免疫學(xué)方面，已經(jīng)極大推進(jìn)了該領(lǐng)域靶向治療藥物的研發(fā)。新一代蛋白藥物開(kāi)發(fā)策略的應(yīng)用，如雙特異性抗體及抗體偶聯(lián)藥物等，也推動(dòng)了該領(lǐng)域的前進(jìn)?？紤]到科研人員在通過(guò)突變或過(guò)表達(dá)受體方式在穩(wěn)定受體分子領(lǐng)域取得的進(jìn)展，盡管一些技術(shù)性的障礙依舊存在，但并非不可克服。以上基礎(chǔ)研究的進(jìn)展，連同高通量篩選技術(shù)的進(jìn)步、對(duì)GPCR結(jié)構(gòu)的深入了解，及生物學(xué)/臨床學(xué)意義的闡釋，將會(huì)為靶向GPCR的抗體藥物發(fā)現(xiàn)及開(kāi)發(fā)過(guò)程中遇到的技術(shù)性瓶頸的解決，打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
縮略詞：
ATL:adult T cell lymphoma
C5aR:C5a anaphylatoxin receptor
CB1:cannabinoid receptor 1
CCR:C-C chemokine receptor
CGRPR:calcitonin gene-related peptide receptor
CRTH2:chemoattractant receptor-homologous molecule expressed on T helper 2 cells
CX3CR1:CX3C chemokine receptor 1
CXCR:C-X-C chemokine receptor
EGFR:epidermal growth factor receptor
ELTD1:EGF，latrophilin and seven transmembrane domain-containing protein 1
FZD: Frizzled
GCGR:glucagon receptor
GLP1R:glucagon-like peptide 1 receptor
GPCR:G-protein-coupled receptor
GVHD:graft-versus-host disease
LGR:leucine-rich repeat-containing GPCR
NSCLC:non-small-cell lung cancer
PTCL:peripheral T cell lymphoma
RSPO3:R-spondin 3
S1PR3:sphingosine 1?phosphate receptor 3
SLE:systemic lupus erythematosus
T2DM:type 2 diabetes mellitus
參考文獻(xiàn)：
1.https://en.wikipedia.org/wiki/G_protein-coupled_receptor
2.Therapeutic antibodies directed at G protein-coupled receptors. MAbs. 2010 (6):594-606.doi: 10.4161/mabs.2.6.13420.
3.Opportunities for therapeutic antibodies directed at G-protein-coupled receptors. Nat Rev Drug Discov. 2017 Sep； 16 (9):1-24. doi:10.1038/nrd.2017.91.
4.Discovery of functional monoclonal antibodies targeting G-protein-coupled receptors and ion channels. Biochem Soc Trans. 2016 Jun 15； 44(3):831-7. doi: 10.1042/BST20160028.
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