背景介紹
DNA甲基化是基因組表觀遺傳修飾的重要組成部分，在調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、個體發(fā)育等方面起重要作用。DNA甲基化水平的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
基因組甲基化模式的建立和維持由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶負責完成。其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNMT3A）是從頭甲基化的兩種甲基轉(zhuǎn)移酶之一，通過控制基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)調(diào)節(jié)該基因的表達水平。DNMT3A可以與細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶以及microRNA作用，協(xié)同完成對腫瘤相關(guān)基因的調(diào)控，是近年來腫瘤表觀遺傳機制研究的重要分子。
已有的研究發(fā)現(xiàn)DNMT3A基因突變可見于多種血液系統(tǒng)腫瘤，尤其在急性髓系白血病中發(fā)生頻率較高，并提示不良預(yù)后。在實體瘤中，雖然DNMT3A已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)存在表達異常，但其臨床意義及具體的功能機制尚不完全清楚，有待進一步的研究。
現(xiàn)有的報道DNMT3A含有至少兩個異構(gòu)體，DNMT3Aa（全長蛋白，由基因DNMT3Aa編碼）以及DNMT3Ab（較短的異構(gòu)體，由位于DNMT3Aa第六個內(nèi)含子內(nèi)的啟動子調(diào)控轉(zhuǎn)錄）。其中DNMT3Ab是胚胎干細胞、胚胎性癌細胞中主要表達的異構(gòu)體。
文章概括
在這篇文章中，研究人員報道了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A的異構(gòu)體DNMT3Ab，對于胃癌中上皮間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)換（EMT）過程及腫瘤轉(zhuǎn)移非常重要。
在這篇文章中，研究者通過對胃癌樣本的分析、以及體內(nèi)外的功能學研究，證明了DNMT3Ab可以促進胃癌細胞的遷移以及侵襲能力，對胃癌的轉(zhuǎn)移非常重要。進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)DNMT3Ab被招募到E-cadherin的啟動子區(qū)調(diào)控該區(qū)域的DNA甲基化，并與H3K9me2和H3K27me3修飾協(xié)同作用，抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，從而影響胃癌細胞的轉(zhuǎn)移能力，并且這一過程依賴于轉(zhuǎn)錄因子Snail。研究者的發(fā)現(xiàn)加深了對DNMT3A及其異構(gòu)體在胃癌轉(zhuǎn)移過程中作用的了解，從表觀遺傳調(diào)控的角度為胃癌的治療提供了新的潛在靶點。
DNMT3Ab調(diào)控胃癌EMT過程模式圖
研究結(jié)果
1. DNMT3Ab在胃癌中過表達并具有臨床重要性
研究者首先運用免疫印跡法檢測了胃癌樣本中DNMT3Aa和DNMT3Ab的表達量，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比， DNMT3Aa和DNMT3Ab在腫瘤組織中顯著過量表達（圖1a-1c），并且DNMT3Aa與DNMT3Ab的表達無相關(guān)性（圖1d），提示DNMT3Aa、DNMT3Ab在胃癌中可能具有不同的生物學功能。
進一步的臨床病理相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)DNMT3Ab的過量表達與TNM分期、陽性淋巴結(jié)數(shù)目增多相關(guān)；而DNMT3Aa過表達則與腫瘤細胞分化和血管侵襲相關(guān)（表1）。在原位腫瘤組織中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移伴隨DNMT3Ab高表達，而DNMT3Aa表達量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移沒有相關(guān)性（圖1e，1f），提示DNMT3Ab可能對胃癌患者的轉(zhuǎn)移具有重要性。
此外，研究者對130例胃癌樣本進行IHC染色，發(fā)現(xiàn)DNMT3Aa主要位于細胞核，而DNMT3Ab在全細胞彌散表達（圖1g）。且DNMT3Ab表達量越高，預(yù)后越不良，是影響患者生存率的獨立風險因子（圖1h）。
圖1. 胃癌組織中DNMT3Ab過量表達
表1. DNMT3Ab表達量與胃癌腫瘤組織的臨床病理相關(guān)性分析
2. DNMT3Ab促進胃癌細胞的轉(zhuǎn)移
在細胞層面，研究者發(fā)現(xiàn)與胃黏膜上皮細胞系GES-1相比，DNMT3Ab在胃癌細胞中表達量上調(diào)。研究者在轉(zhuǎn)移能力較弱的MKN45、BGC-823胃癌細胞株中構(gòu)建了DNMT3Ab的穩(wěn)定過表達株，在轉(zhuǎn)移能力較強的MKN28細胞株中構(gòu)建了DNMT3Ab穩(wěn)定敲低細胞株，進而在體內(nèi)、體外檢測DNMT3Ab對胃癌細胞轉(zhuǎn)移能力的影響。
體外實驗發(fā)現(xiàn)過表達DNMT3Ab顯著增強了胃癌細胞的遷移和侵襲能力，而不影響細胞增殖（圖2a, 2b）；與之相反，敲低DNMT3Ab則導(dǎo)致細胞的遷移、侵襲能力顯著減弱（圖2c）。
體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，尾靜脈注射過表達DNMT3Ab胃癌細胞的裸鼠胃癌肺轉(zhuǎn)移增加，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目也增加（圖2d, 2e）。通過IHC染色，發(fā)現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移病灶中DNMT3Ab表達量上升（圖2f）。
圖2. DNMT3Ab增強胃癌細胞體外運動能力及體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力
3. DNMT3Ab過表達引起上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換EMT
研究者觀察到過表達DNMT3Ab的胃癌細胞形態(tài)發(fā)生改變，從單層上皮樣細胞變?yōu)樗笮蔚睦w維細胞樣形態(tài)，提示細胞可能發(fā)生了EMT過程；而過表達DNMT3Aa則不引起細胞形態(tài)變化（圖3a）。與表型一致，在分子層面，免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)過表達DNMT3Ab的細胞中上皮標志物E-cadherin、β-catenin表達量降低，間充質(zhì)標志物Vimentin、N-cadherin表達量上升；而DNMT3Aa則不改變標志物的表達量（圖3b）。免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)過表達DNMT3Ab導(dǎo)致E-cadherin表達量降低，Vimentin表達量升高，同時F-catin染色結(jié)果提示細胞內(nèi)肌動蛋白細胞骨架發(fā)生重排（圖3c）。這些結(jié)果提示DNMT3Ab可能是通過引起EMT促進了胃癌細胞的侵襲能力。
圖3. DNMT3Ab引起EMT過程
4. DNMT3Ab調(diào)控E-cadherin啟動子區(qū)DNA甲基化，抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄
EMT的標志之一是E-cadherin的功能丟失，而之前的研究報道DNA甲基化對E-cadherin的抑制與胃癌細胞的轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。
通過定量甲基化特異性PCR（Q-MSP）檢測，研究者發(fā)現(xiàn)過表達DNMT3Ab引起E-cadherin啟動子區(qū)甲基化水平上升；而敲低DNMT3Ab引起甲基化水平下降（圖4a-4c）。焦磷酸測序技術(shù)也發(fā)現(xiàn)過表達DNMT3Ab后E-cadherin啟動子區(qū)DNA甲基化發(fā)生頻率顯著上升（圖4d）。同時，ChIP實驗表明過表達DNMT3Ab時E-cadherin啟動子區(qū)域的DNMT3Ab結(jié)合增加（圖4e）。
同時研究者發(fā)現(xiàn)DNMT3Ab過表達細胞中E-cadherin表達量下降，DNMT3Ab敲低細胞中E-cadherin表達量增加（圖4f, 4g）；而過表達或敲低DNMT3Aa則不能影響細胞中E-cadherin的表達水平（圖4h）。
此外，研究者比較了24例胃癌樣本，發(fā)現(xiàn)DNMT3Ab與E-cadherin的表達呈負相關(guān)，而DNMT3Aa與E-cadherin的表達之間則沒有相關(guān)性（圖4i）。
圖4. DNMT3Ab抑制E-cadherin表達
5. 抑制DNMT3Ab削弱了胃癌細胞的EMT及轉(zhuǎn)移
DNMT3Ab抑制E-cadherin的表達，那么DNMT3Ab是否在胃癌細胞的EMT過程中發(fā)揮作用呢？研究者首先用TGF-β處理胃癌細胞，獲得了間充質(zhì)表型、及與之相符的分子marker變化，同時觀察到DNMT3Ab、及EMT相關(guān)因子Snail的表達水平上調(diào)（圖5a, 5b）；并且這種由TGF-β所引起的EMT過程在siRNA抑制DNMT3Ab表達后被抑制（圖5c），伴隨E-cadherin啟動子區(qū)DNA甲基化修飾的減少及E-cadherin表達量的上調(diào)（圖5d, 5e）。進一步的ChIP實驗發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)TGF-β處理的胃癌細胞中抑制DNMT3Ab表達后，E-cadherin啟動子區(qū)域DNMT3Ab、H3K9me2、H3K27me3的富集降低（圖5f）。
此外，體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，尾靜脈注射DNMT3Ab敲低胃癌細胞的裸鼠發(fā)生轉(zhuǎn)移的概率降低（圖5g）。
圖5. DNMT3Ab的沉默抑制了EMT過程及胃癌細胞的轉(zhuǎn)移
6. DNMT3Ab對E-cadherin的調(diào)控依賴于Snail
為了研究DNMT3Ab與Snail在調(diào)控E-cadherin中的關(guān)系，研究者進行了免疫沉淀實驗，發(fā)現(xiàn)DNMT3Ab與Snail直接相互作用，而DNMT3Aa則不能（圖6a），并且在DNMT3Ab過表達細胞中，Snail在E-cadherin啟動子區(qū)域的結(jié)合增加。
在DNMT3Ab過表達細胞中用siRNA抑制Snail表達，導(dǎo)致E-cadherin表達量上調(diào)，E-cadherin啟動子區(qū)域DNA甲基化下降，并且E-cadherin啟動子區(qū)域DNMT3Ab、H3K9me2、H3K27me3的富集顯著減少（圖6b-6d）。同時，表型實驗發(fā)現(xiàn)胃癌細胞在DNMT3Ab過表達后增強的的轉(zhuǎn)移和侵襲能力在抑制Snail后顯著減弱（圖6e, 6f）。
圖6. DNMT3Ab對E-cadherin的抑制依賴于Snail
7. DNMT3Ab改變了轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達譜
為了研究DNMT3Ab如何特異性調(diào)控胃癌細胞的轉(zhuǎn)移及EMT過程，研究者分析了對照細胞及DNMT3Ab過表達細胞的基因表達譜，并與前期實驗中DNMT3Aa過表達細胞及對照細胞的基因表達譜進行比較，找到了317個表達受到DNMT3Ab特異性調(diào)控的基因（圖7a）。通過GO分析，發(fā)現(xiàn)過表達DNMT3Ab主要影響細胞運動和TGF-β信號通路（圖7b, 7c）；這其中一系列與腫瘤細胞侵襲、EMT過程相關(guān)的基因如CLDN7、MMP7、FN1等表達發(fā)生改變，qPCR進一步驗證了這些變化（圖7d, 7e），提示DNMT3Ab通過調(diào)控多個轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達，對胃癌細胞轉(zhuǎn)移、侵襲的能力進行調(diào)控。
圖7. DNMT3Ab調(diào)控轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達水平
討論
DNA異常甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、細胞癌變有著密切的聯(lián)系。胃癌是最為常見的惡性腫瘤之一，且容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后不良。而DNMT家族蛋白在胃癌中的作用還不十分清楚。這篇文章中，研究者從臨床樣本出發(fā)，發(fā)現(xiàn)了DNMT3Ab在胃癌組織中的過量表達，并通過進一步的體內(nèi)外的功能學實驗，闡明了DNMT3Ab在胃癌轉(zhuǎn)移過程中的重要調(diào)控作用，及其調(diào)控機制。研究者的工作為表觀遺傳修飾如何精細調(diào)控胃癌的轉(zhuǎn)移提供了更多的證據(jù)， DNMT3Ab/Snail/E-cadherin信號軸可能為伴隨DNMT3Ab高表達的轉(zhuǎn)移性胃癌提供了新的治療策略。
原文鏈接：
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