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本文開講前回顧下

研究?jī)?nèi)容概述：

    假設(shè)要對(duì)H基因功能進(jìn)行研究，通常情況下，是對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行特殊處理后，觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中H基因表達(dá)mRNA或者蛋白的情況，分析后推測(cè)其功能。用到的方法一般有RT-PCR、Western Blot、克隆目標(biāo)基因啟動(dòng)子，構(gòu)建報(bào)告基因表達(dá)載體等，但這些方法過程繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，很難做到高通量篩選。

    而若采用CRISPR-Cas9介導(dǎo)的靶向基因組插入技術(shù)，建立H-Luciferse細(xì)胞系，就能通過檢測(cè)Luciferase表達(dá)變化即可真實(shí)反映H基因的相對(duì)表達(dá)量及表達(dá)變化情況，具有方便快捷、安全直觀的優(yōu)點(diǎn)，能夠通過Luciferase表達(dá)變化做到高通量篩選。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>

    采用CRISPR-Cas9介導(dǎo)的靶向基因組插入技術(shù)建立H-Luciferse細(xì)胞系，并通過一系列方法驗(yàn)證其正確性，將有助于H基因功能研究及篩選影響H表達(dá)的小分子化學(xué)藥物，為H基因相關(guān)研究提供一種新的實(shí)驗(yàn)思路及解決方案。

圖1 CRISPR-Cas9介導(dǎo)的靶向基因組插入技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞系示意圖

實(shí)驗(yàn)步驟

sgRNA的篩選：

    首先在目的基因H的終止密碼子后的打靶區(qū)（TSF）設(shè)計(jì)sgRNA，并與表達(dá)Cas9蛋白的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞（我們選用的是HEK293細(xì)胞，Cas9質(zhì)粒量與sgRNA質(zhì)粒量比例為2:1 ），來測(cè)試、篩選出能引導(dǎo)高切割效率的sgRNA。實(shí)驗(yàn)采用的是用T7E1酶來進(jìn)行sgRNA打靶效率的檢測(cè)。（檢測(cè)結(jié)果事例見下圖）

圖2.sgRNA打靶效率的檢測(cè)

1、把篩選好的sgRNA與Cas基因構(gòu)建在一個(gè)載體上，用于接下來的與供體載體共轉(zhuǎn)。（也可以分兩個(gè)質(zhì)粒，按照Cas9質(zhì)粒量與sgRNA質(zhì)粒量比例為2:1來轉(zhuǎn)染）

圖3. Cas9/sgRNA 載體示意圖

2、構(gòu)建如下圖的Donor載體，之后把Cas9/sgRNA載體和Donor載體（質(zhì)量比為4μg:8μg）共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)使用HEK293細(xì)胞，60mm；使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染），建立KI細(xì)胞系。

圖4.CRISPR-Cas9介導(dǎo)的靶向基因組插入技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞系示意圖

1、轉(zhuǎn)染之后的細(xì)胞，分別加G418（針對(duì)Neomycin）和GCV（針對(duì)PGK TK）藥物來篩選細(xì)胞（加完G418需要等到細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，再加GCV）。

2、存活下來的細(xì)胞，可以觀察其熒光情況（Donor帶GFP和mcherry），并測(cè)定其luciferase的活性，等待接下來克隆化操作。

圖5.克隆化操作前，觀察細(xì)胞帶綠色熒光情況

3、篩選細(xì)胞（有限稀釋法）：之后進(jìn)行細(xì)胞的克隆化，是基于有限稀釋法的操作，希望得到成功KI的單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)成的細(xì)胞系。

圖6.cas9介導(dǎo)的同源修復(fù)示意圖

    通過PCR后產(chǎn)物條帶大小的檢測(cè)來判斷得到的細(xì)胞系是否需要繼續(xù)克隆化。

圖7.KI細(xì)胞系PCR鑒定示意圖

    在通過了PCR、測(cè)序分析后，確定得到了KI的細(xì)胞系，接下來應(yīng)該驗(yàn)證得到的細(xì)胞系是否有功能，以便能順利進(jìn)行接下來的實(shí)驗(yàn)。

    實(shí)驗(yàn)中是利用CRISPR/dCas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活或抑制系統(tǒng)來進(jìn)行驗(yàn)證，如下圖，利用sgRNA介導(dǎo)的dCas9-VP64/KRAB來對(duì)H基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行激活或者抑制。

圖8.CRISPR/dCas介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)示意圖

    對(duì)KI細(xì)胞系進(jìn)行CRISPR/dCas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活或抑制操作為實(shí)驗(yàn)組，用相同系統(tǒng)操作的WT細(xì)胞為對(duì)照組，通過實(shí)驗(yàn)組測(cè)得的luciferase值與對(duì)照組H基因的Western Blot、RT PCR結(jié)果進(jìn)行比較，即可確定構(gòu)造的KI細(xì)胞系是否可以通過luciferase值來真實(shí)地反映H基因的表達(dá)情況。