在去年圣誕節(jié)期間的加拿大落基山脈冰攀之旅中，兩位來自華盛頓大學(xué)的年輕研究人員：Michael Schmitt和Jesse Salk突發(fā)奇想，談到了一個簡單但功能強大，可用于檢測癌細胞，獲得更好結(jié)果的新方法——如果他們能降低DNA測序中的錯誤率，那么就可以更好的檢測出這些細胞中的變異，這種改進能用于癌癥的早期診斷，以及幫助醫(yī)師們了解哪些細胞會對化療產(chǎn)生抗性。
當時他們的想法是對DNA的兩條鏈都進行測序。如果發(fā)現(xiàn)了一條鏈出現(xiàn)了一個突變，而另一條沒有出現(xiàn)，那么這就是測序上的失誤，而不是一個真實的突變。
這一相關(guān)的研究成果公布在美國《國家科學(xué)院院刊》（PNAS）雜志上，一經(jīng)公布后就吸引了多方關(guān)注。
“如果這種雙重測序（duplex sequencing）方法得到驗證，那么就能提高我們對于人類癌癥克隆結(jié)構(gòu)的認識，修改罕見基因突變目錄，幫助找到突變產(chǎn)生的機制，并有可能確定的增變表型”，Christopher Klein等人在隨后的社論中表示，“最終這將會打開臨床應(yīng)用的一道大門，因為臨床應(yīng)用中診斷準確率是非倫理治療決定中的一項必要條件。”
文章的通訊作者是華盛頓大學(xué)Lawrence Loeb博士，其癌癥研究實驗室的研究人員證明利用這種方法，能將錯誤率減少到少于每五十萬核苷酸測序錯誤率，而且理論錯誤率可低至十億分之一，而標準方法中的錯誤率是200分之一。
“據(jù)我們的估算，這似乎能將準確性提高千萬倍，”文中的第一作者Michael Schmitt說，“利用新一代測序檢測超罕見基因突變 ”，“這在理論上有可能實現(xiàn)一個細胞的全基因組序列測序，而不出現(xiàn)一個單錯誤，”一個細胞的基因組為60億個核苷酸。
華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員希望能利用這種方法來檢驗Loeb在1974年提出的增突變表型（mutator phenotype）假說，這一假說認為腫瘤是突變表型，即腫瘤細胞中存在成千上萬個基因突變。當時Loeb提出這一假說時，被認為過于激進，但這一假說解釋了一些癌癥如何擴散，以及如何快速產(chǎn)生對化療的抗性的，如果研究人員能觀察到哪些細胞變異快，那么就有可能在更容易治療的階段里，更快的發(fā)現(xiàn)細胞。
Loeb表示，在1974年，科學(xué)界中還只有少部分人接受這一假說，但現(xiàn)在大概一半的人都已接受。
“制藥公司都希望能出現(xiàn)一種治療癌癥的靈丹妙藥，”他說。
然而現(xiàn)實的方法并不是什么靈丹妙藥，一治就好，而是通過大幅減緩控制住癌癥的發(fā)展步伐，使患者最終死于其它方面的疾病，Loeb說，他認為抗癌藥物能殺死一些細胞，但存在突變的細胞還是能增殖和擴散。
Loeb還表示，如果利用這一新技術(shù)分析來自同一個體正常組織和癌變組織中的DNA，那么就能為其增突變表型假說平凡，而且如果一切順利的話，這種雙重測序技術(shù)能在兩到三年內(nèi)，為患者提供有意義的臨床信息，第一個可以應(yīng)用的方面就是尋找復(fù)發(fā)性腫瘤。
Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing
Michael W. Schmitt, Scott R. Kennedy, Jesse J. Salk, Edward J. Fox, Joseph B. Hiatt, and Lawrence A. Loeb
Next-generation DNA sequencing promises to revolutionize clinical medicine and basic research. However, while this technology has the capacity to generate hundreds of billions of nucleotides of DNA sequence in a single experiment, the error rate of ～1% results in hundreds of millions of sequencing mistakes. These scattered errors can be tolerated in some applications but become extremely problematic when “deep sequencing” genetically heterogeneous mixtures, such as tumors or mixed microbial populations. To overcome limitations in sequencing accuracy, we have developed a method termed Duplex Sequencing. This approach greatly reduces errors by independently tagging and sequencing each of the two strands of a DNA duplex. As the two strands are complementary, true mutations are found at the same position in both strands. In contrast, PCR or sequencing errors result in mutations in only one strand and can thus be discounted as technical error. We determine that Duplex Sequencing has a theoretical background error rate of less than one artifactual mutation per billion nucleotides sequenced. In addition, we establish that detection of mutations present in only one of the two strands of duplex DNA can be used to identify sites of DNA damage. We apply the method to directly assess the frequency and pattern of random mutations in mitochondrial DNA from human cells.
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