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CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)的多樣性、模塊性和高效性正在掀起一場生物技術(shù)革命。RNA指導的Cas酶已經(jīng)被用來作為在培養(yǎng)細胞，動物和植物中操縱基因組的工具。它不但加快了基礎研究的步伐，而且讓臨床和農(nóng)業(yè)突破成為可能。日前，CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)的鼻祖之一，加州大學伯克利分校的Jennifer A. Dounda博士和她課題組的Gavin J. Knott博士在《科學》雜志上撰文，對這一技術(shù)的優(yōu)勢、進化趨勢和應用進行了盤點。 

▲Jennifer A. Dounda博士（圖片來源：加州大學伯克利官網(wǎng)）

CRISPR-Cas系統(tǒng)是微生物體內(nèi)的一種RNA指導的適應性免疫系統(tǒng)。它利用RNA來引導核酸酶與特定核酸序列相結(jié)合并且將它們切斷。當病毒入侵細菌時，細菌能夠捕捉到外來遺傳物質(zhì)的片段并且將它們整合到自身基因組中的CRISPR序列中。CRISPR序列轉(zhuǎn)錄生成的CRISPR RNA（crRNA）能夠與Cas核酸酶相結(jié)合，通過與靶點核酸序列進行堿基配對為Cas核酸酶提供結(jié)合特異性。Cas核酸酶和crRNA結(jié)合之后，能夠在細菌體內(nèi)起到監(jiān)控病毒入侵的作用，當與crRNA匹配的遺傳片段再度出現(xiàn)時，Cas核酸酶能夠切斷這些遺傳片段，從而提供免疫保護作用。

▲CRISPR-Cas適應性免疫系統(tǒng)（圖片來源：《科學》）

在眾多天然CRISPR-Cas系統(tǒng)中，2類（class 2）系統(tǒng)只需要一個RNA指導的Cas核酸酶就能夠完成對靶點的切割。其中Cas9核酸酶成為了第一個被用于基因組編輯的Cas效應子。Cas9有諸多特點讓它能夠進行準確而有效的編輯。Cas9通過特異性識別crRNA和它與反式激活crRNA（tracrRNA）之間的相互作用保證Cas9只和對應的指導RNA相結(jié)合。而crRNA和tracrRNA可以被融合成一個指導RNA（sgRNA）。最后，Cas9需要與特定PAM序列旁邊的DNA片段相結(jié)合才能觸發(fā)Cas9的雙鏈DNA切割功能。世界各地的科學家們選擇Cas9作為基因編輯工具的原因正是因為這種核酸酶的可控性和通過修改sgRNA靶點就能改變Cas9切割位點的便捷性。 

雖然Cas9仍然是最常用的Cas效應子，但是科學家們已經(jīng)將Cas效應子的范圍擴展到其它類型的Cas蛋白中去。CRISPR-Cas12a能夠靶向DNA序列，而CRISPR-Cas13a能夠靶向RNA。這些由RNA指導的核酸酶系統(tǒng)的可編程（programmability）特點是CRISPR-Cas系統(tǒng)能夠在精準基因組編輯以外獲得廣泛應用的關(guān)鍵。

▲2類CRISPR-Cas系統(tǒng)（圖片來源：《科學》）

雖然Cas的應用范圍已經(jīng)得到擴展，但是精準基因組編輯仍然是CRISPR革命的前沿。Cas9和Cas12a能夠在特定位點觸發(fā)雙鏈DNA斷裂，在細胞通過非同源末端連接（NHEJ）或同源定向修復（HDR）對雙鏈DNA斷裂進行修復后基因組編輯就會發(fā)生。

作為精準基因組編輯工具，Cas9和Cas12a能夠在多種細胞種類和生物中起作用。它們可以用于全基因組篩選來研究基礎生物功能，或者發(fā)現(xiàn)和驗證復雜遺傳病的潛在藥物靶點。在臨床試驗中，Cas核酸酶可以治療由已知遺傳因素導致的疾病，例如在杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）中，使用基因編輯可以修正基因突變或者誘發(fā)轉(zhuǎn)錄過程跳過有缺陷的外顯子。Cas9可以用于讓導致肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）和亨廷頓?。℉untington’s disease, HD）等神經(jīng)疾病的致病基因失活。除了對體細胞進行基因編輯，這一系統(tǒng)還有在人類胚胎中修正基因突變的潛力，從而在人類生殖細胞中產(chǎn)生可遺傳的變化。

然而，值得注意的是精準編輯仍然是一個挑戰(zhàn)，因為NHEJ導致的修復結(jié)果可能與期待的HDR導致的修復結(jié)果競爭。另一種策略是將Cas效應子與堿基編輯器（base editor）融合在一起。這可以限制不想要的編輯并且消除修復模板的需求。與切割DNA然后進行修復不同，切口酶Cas9（nCas9）媒介的堿基編輯將單堿基編輯器攜帶到指定靶點，并且在促進堿基變換的同時不產(chǎn)生雙鏈DNA切割。如今Cas9媒介的單堿基編輯器讓研究人員能夠在特定基因組位點生成任意一種堿基變換結(jié)果。展望未來，下一代的Cas媒介的基因組編輯器很可能包括堿基編輯器，它們的堿基編輯活性可能通過構(gòu)象變化，與Cas9媒介的靶點DNA結(jié)合偶聯(lián)在一起。

▲CRISPR-Cas系統(tǒng)的各種應用（圖片來源：《科學》）

Cas9是一個模塊式的平臺，它的DNA結(jié)合能力和核酸酶活性分屬不同的模塊。通過在Cas9核酸酶蛋白域引入突變，可以生成催化活性缺失的Cas9（dCas9）。它可以成為募集蛋白的骨架，在干擾特定位點轉(zhuǎn)錄過程時不會對DNA產(chǎn)生永久的影響。使用dCas9為功能性基因篩檢帶來革命性的變化，因為它讓在多種細胞中進行迅速，特異性，高通量的基因敲低成為可能。這些研究進展凸顯出在操作基因組的同時不引入永久性DNA損傷的實用性。例如，將dCas9與TET1（一種去甲基化酶）融合，可以在脆性X綜合征（fragile X syndrome）神經(jīng)元和小鼠模型中靶向失調(diào)的FMR1位點，并且逆轉(zhuǎn)表型。

與產(chǎn)生永久基因變化相對，Cas效應子可以通過靶向RNA對轉(zhuǎn)錄組進行暫時干擾。利用呈現(xiàn)PAM序列的寡核苷酸，Cas9系統(tǒng)可以被改造成可編程的RNA編輯工具（RCas9）。RCas9可以用于消除致病RNA，修復mRNA剪接錯誤，或者降低三核苷酸重復序列表達的蛋白水平。目前獲得的成功表明，Cas9可能在轉(zhuǎn)錄后基因工程領域大有作為，例如與單堿基RNA調(diào)控子融合來實現(xiàn)對特定RNA位點的調(diào)控。

Cas13是靶向RNA領域最新涌現(xiàn)的多功能工具。Cas13a系統(tǒng)是一個RNA指導的核糖核酸酶（RNase），它可以在哺乳動物和植物體內(nèi)用于有特異性地敲低RNA。與Cas13a功能和進化相似的Cas13b具備可編程的RNase活性，它已經(jīng)被用于在哺乳動物細胞中實現(xiàn)RNA干擾和RNA編輯。Cas9和Cas13靶向RNA的系統(tǒng)除了支持基礎研究以外，在臨床上可以達到和反義寡核苷酸療法相似的臨床應用，在不產(chǎn)生永久性遺傳變化的情況下，治療急性非孟德爾疾病（acute Mendelian patholgies)。

對于特定基因組位點，mRNAs，和非編碼RNAs來說，在細胞中的特定時空分布對它們的功能至關(guān)重要。將dCas9與熒光報告基因融合在一起，研究人員已經(jīng)能夠?qū)蚪M中的重復位點在活細胞中進行成像。然而，限制dCas9在基因組特定位點分布研究中應用的原因是，對于非重復序列，這一手段的信噪比較低?？朔旁氡炔蛔愕囊粋€方法是在sgRNA上附加多個MS2序列，這些MS2序列能夠與MS2序列結(jié)合蛋白相結(jié)合，而將MS2序列結(jié)合蛋白與熒光蛋白融合在一起，則能夠有效地增強信號強度。使用靶向RNA的RCas9讓研究人員能夠在活細胞中追蹤RNA，從而讓追蹤攜帶重復擴增序列的RNA成為可能，這具有重要臨床意義。 

在Cas13a和Cas12a中RNA指導的核酸酶活性促進了創(chuàng)新核酸檢測工具的研發(fā)。對于Cas13和Cas12a來說，靶點核酸通過與指導RNA的堿基配對，會激活普通的核酸酶活性。利用這種可控的核酸酶活性，Cas13被用于從大量RNA中檢測特定RNA序列的存在?；谶@一研究開發(fā)出的SHERLOCK技術(shù)平臺，能夠同時檢測出登革熱和寨卡病毒的單鏈RNA的存在。

▲SHERLOCK系統(tǒng)科學論文（圖片來源：《科學》）

Cas12a有著與Cas13相似的靶向單鏈DNA的可控核酸酶活性。利用這種活性，DETECTR系統(tǒng)是一個基于CRISPR的DNA檢測和診斷技術(shù)平臺。與等溫預擴增相結(jié)合，DETECTR系統(tǒng)能夠迅速準確地檢測出人乳頭瘤病毒（HPV）的臨床相關(guān)類型。