原創(chuàng) 王立銘 知識分子 2023-01-07 08:11 發(fā)表于北京

1.7知識分子The Intellectual

“智識前沿學(xué)者”、深圳灣實驗室資深研究員王立銘

導(dǎo) 讀

本期介紹的“細胞焦亡”，有可能給腫瘤和免疫治療領(lǐng)域帶來一個全新的機會。靶向細胞焦亡的藥物屬于全新生物學(xué)機制的“first in category”藥物。如何成功開發(fā)，考驗的不光是科學(xué)發(fā)現(xiàn)的質(zhì)量，還有科學(xué)家、藥物開發(fā)者、臨床醫(yī)生之間的密切合作。

撰文 |王立銘

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眾所周知，細胞是地球生命的基本組成單元。人類這樣的多細胞生物，每個個體都由數(shù)十萬億個細胞按照復(fù)雜的時空組織邏輯構(gòu)建而來，這些細胞的使命就是竭盡全力保證我們的出生、成長、和繁殖。為了實現(xiàn)這些偉大的目標(biāo)，細胞生命本身是隨時可以犧牲和替代的；在很多場合，身體細胞甚至還會主動開啟死亡程序來協(xié)助人體更好地生存和繁殖。

本期報告要重點介紹的“細胞焦亡”，也是人體細胞內(nèi)生的一種死亡程序。這種特殊的細胞死亡程序在1990年代逐漸為人所知。研究者們發(fā)現(xiàn)，人體免疫細胞在被志賀桿菌、沙門氏菌等病原菌入侵后，會引發(fā)細胞死亡。這種情境下出現(xiàn)的細胞死亡具有鮮明的形態(tài)特征：進入死亡程序的細胞，細胞體積快速漲大，細胞膜上出現(xiàn)穿孔和鼓包，直至細胞的完整性徹底被破壞，細胞內(nèi)容物大量泄露，引發(fā)周圍組織的炎癥反應(yīng)。顯然這是一種非常“臟”和“暴烈”的死亡方式，其英文名稱(pyroptosis)也隱含了這層意思：希臘語詞根pyro-指“火焰”，而-ptosis則指“跌落”。

1細胞焦亡如何發(fā)生？

細胞焦亡和人體免疫系統(tǒng)對病原體的防御有密切關(guān)系。人體免疫系統(tǒng)的很多細胞，如巨噬細胞、中心粒細胞、樹突狀細胞、B細胞和T細胞等，在正常狀態(tài)下可以直接識別和殺傷病原微生物。但如果它們自己也被病原微生物感染且無力清除時，可能會選擇焦亡這類暴烈的死亡方式。在和病原體同歸于盡的同時，也向周圍環(huán)境釋放了明確的危險信號，進一步吸引免疫系統(tǒng)的火力，召集和激活更多的免疫細胞，幫助機體更好地清除病原體威脅。

在過去20年時間內(nèi)，人們也開始逐漸理解細胞焦亡具體是如何發(fā)生的。這些信息除了讓人們得以理解細胞焦亡的全貌，也為利用細胞焦亡過程開發(fā)腫瘤和免疫相關(guān)藥物奠定了基礎(chǔ)。

這里我們簡要的回顧和總結(jié)一下細胞焦亡研究路程中的關(guān)鍵性節(jié)點。

在2011年，美國基因泰克公司的Vishva Dixit實驗室發(fā)現(xiàn)，多種革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌、嚙齒類檸檬酸桿菌、霍亂弧菌）的感染，會誘導(dǎo)小鼠的巨噬細胞釋放大量促進炎癥反應(yīng)的細胞因子如白介素1b和白介素18等，也會誘導(dǎo)巨噬細胞的死亡[1]。在2013年和2014年，Dixit實驗室和邵峰實驗室又先后發(fā)現(xiàn)，被革蘭氏陰性菌感染后，革蘭氏陰性菌表面的脂多糖分子（LPS）可以結(jié)合和激活巨噬細胞內(nèi)的一個特殊蛋白酶（caspase-4/11），從而引發(fā)巨噬細胞的焦亡[2][3]。這是人們第一次開始理解細胞焦亡的具體機制。

而細胞焦亡本身又是如何發(fā)生的呢？

2015年，Dixit實驗室和邵峰實驗室利用截然不同的實驗手段，證明細胞焦亡是被激活的caspase蛋白酶切割一個名叫Gasdermin D的蛋白質(zhì)所引發(fā)的[4][5]。具體而言，Gasdermin D是一個接近500個氨基酸長度的蛋白質(zhì)，在中間部位有一段序列可以被caspase蛋白酶切割。在未切割狀態(tài)下，Gasdermin D的前半部分和后半部分可以相互結(jié)合，進入一種功能深度抑制的結(jié)構(gòu)。一旦被切割開后，Gasdermin D的前半部分蛋白就被釋放出來，直接推動焦亡的發(fā)生。需要順便說明的是，在2015年之前，Gasdermin蛋白的功能幾乎是完全的空白，Dixit實驗室是通過小鼠突變體篩選的方法尋找對LPS不敏感的基因缺陷找到了Gasdermin D，而邵峰實驗室則是通過當(dāng)時剛剛發(fā)明的CRISPR/cas9篩選的方法在細胞系中找到了Gasdermin D。

在2016年，被切割的Gasdermin D如何導(dǎo)致焦亡也有了更進一步的信息。數(shù)個研究組（包括邵峰實驗室和Dixit實驗室，還有哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的吳皓實驗室和Judy Lieberman實驗室等）在同一時間發(fā)現(xiàn)，Gasdermin D在被蛋白酶切割后，其前半段能夠插入細胞膜，大約27個Gasdermin D單體能夠組裝形成一個直徑18納米的巨型孔洞，正是這個孔洞使得了細胞外水分涌入細胞，細胞膜膨大，細胞內(nèi)容物泄露，最終導(dǎo)致細胞的暴裂死亡[6][7]。在2018年，吳皓實驗室還詳細解析了Gasdermin聚集成環(huán)形成細胞孔洞的結(jié)構(gòu)信息[8]。

至此，細胞焦亡發(fā)生的完整脈絡(luò)得到了充分的說明，在此歷程中，邵峰實驗室、Vishva Dixit實驗室、Judy Lieberman實驗室和吳皓實驗室作出了重要的奠基性工作。其中特別是邵峰和Vishva Dixit實驗室找到了焦亡的具體執(zhí)行者，即在被切割后能夠組裝成環(huán)、引起細胞破孔的Gasdermin蛋白。這些發(fā)現(xiàn)為我們深入理解細胞焦亡在免疫和腫瘤中的具體生物學(xué)功能，以及響應(yīng)的藥物開發(fā)鋪平了道路。

我們可以粗略的將細胞焦亡的過程分為三個步驟：

啟動階段：病原體入侵細胞，暴露出其特征識別信號（如革蘭氏陰性菌表面的脂多糖分子）；

準(zhǔn)備階段：細胞內(nèi)防御機制識別出上述信號，并開始準(zhǔn)備焦亡所需的元件（如脂多糖分子被caspase蛋白酶所識別，進一步切割Gasdermin D蛋白）；

完成階段：細胞膜結(jié)構(gòu)破裂，導(dǎo)致細胞焦亡(如被切割后的Gasdermin D蛋白插入細胞膜，形成孔洞）。

2細胞焦亡與天然免疫

值得特別指出的是，在上述“主干”之外，研究者們也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)細胞焦亡的每個步驟也有不同的分支，讓我們對細胞焦亡在免疫反應(yīng)中的角色有了更深刻的理解。

例如，除了革蘭氏陰性菌的脂多糖之外，病原體分泌的毒素（例如炭疽毒素和志賀毒素）、細胞內(nèi)游離的RNA和雙鏈DNA（往往來自病毒感染）、細菌的特征性結(jié)構(gòu)（例如長長的鞭毛和狀如注射器的3型/5型分泌系統(tǒng)）、病原體代謝產(chǎn)物（例如合成脂多糖過程的中間產(chǎn)物ADP-庚糖）等，都能通過不同的細胞內(nèi)檢測機制被識別，啟動炎癥反應(yīng)和細胞焦亡[9][10][11][12]。

同時，在焦亡的準(zhǔn)備階段，除了上文介紹過的caspase-4/11蛋白酶，其他類型的caspase蛋白酶（例如caspase-1/3/8），在特定條件下也能通過切割Gasdermin，引起炎癥反應(yīng)。還有研究提示在某些條件下Gasdermin的切割甚至可以完全擺脫對caspase的依賴。例如，在腫瘤免疫微環(huán)境中，免疫細胞可以通過直接釋放顆粒酶進入腫瘤細胞，切割Gasdermin從而誘導(dǎo)細胞焦亡[13]。換句話說，焦亡的第二階段主要服務(wù)于Gasdermin蛋白的切割和激活，具體的操作途徑則是比較靈活的。

還有，在上述這些多樣化的啟動和準(zhǔn)備分支之后，細胞也能引發(fā)不同類型的免疫反應(yīng)。例如細胞能通過釋放白介素1b和白介素18等方式吸引和激活周圍的免疫細胞，促進機體的炎癥反應(yīng)，以更好地清除病原體入侵。當(dāng)然，這里的重點是我們重點介紹的細胞焦亡，而細胞焦亡的最終“出口”都要依靠Gasdermin蛋白的組裝成環(huán)。除了上面描述的Gasdermin D之外，人類基因組中還有四個Gasdermin家族成員（A/B/C/E）都表現(xiàn)出了類似的引發(fā)焦亡的功能[14]。

根據(jù)如上的分析，我們其實可以在人體天然免疫這個更大的框架下理解焦亡。所謂天然免疫，指的是不依賴后天經(jīng)驗和訓(xùn)練，直接識別入侵異源物質(zhì)的某些固有特征，并對其進行清除和殺傷的機制。在這個框架下，焦亡可以看成是天然免疫系統(tǒng)的“兜底”措施。

圖：細胞焦亡和機體天然免疫系統(tǒng)（
https://www.nature.com/articles/s41423-021-00740-6）

當(dāng)人體的天然免疫系統(tǒng)，例如巨噬細胞，識別到了人體中正常條件下不會出現(xiàn)、往往由入侵病原體攜帶的某些特征（諸如革蘭氏陰性菌的脂多糖外殼），就會啟動一系列免疫反應(yīng)對其進行殺傷。如果上述防御機制沒有起到期望中的效果，巨噬細胞就可能啟動自身的焦亡，用一種更加暴烈的方式殺傷內(nèi)部的病原菌，并將能夠引發(fā)免疫反應(yīng)的信號更強烈地釋放出去，以激發(fā)更大范圍的免疫反應(yīng)。

3

細胞焦亡與藥物開發(fā)

如上所述，我們可以把細胞焦亡看成人體應(yīng)對病原體入侵的免疫防御機制的一部分。和人體其他類型的免疫機制類似，焦亡也需要被小心地維持在一個合理的強度。過強（“不該死的死了”），可能會產(chǎn)生過度的免疫反應(yīng)，引發(fā)慢性炎癥和自身免疫性疾?。欢^弱（“該死的沒死”），則可能促進癌細胞的繁殖復(fù)制，或者影響了腫瘤治療方案的效果。

這當(dāng)然不是焦亡特有的屬性。在過去二三十時間里，圍繞免疫系統(tǒng)的過度活躍或者抑制，人們闡明了許多疾病的發(fā)病機理，也開發(fā)出了相應(yīng)的藥物。

針對免疫系統(tǒng)的過度活躍，一個經(jīng)典案例是1960-70年代發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子TNF-α。和上面介紹的焦亡過程類似，TNF-α也是機體抵御病原體入侵的重要防御手段。在諸如細菌脂多糖等危險信號的刺激下，TNF-α主要由巨噬細胞等免疫細胞大量產(chǎn)生和分泌，吸引和激活各種免疫細胞，引發(fā)機體炎癥反應(yīng)，以消滅入侵病原體。但TNF-α的異常增高也能導(dǎo)致一系列慢性炎癥和自身免疫疾病，因此靶向TNF-α也成為治療這些疾病的重要途徑。在醫(yī)療市場上，多個抑制TNF-α的藥物，諸如阿達木單抗（Adalimumab）、英夫利昔單抗（Infliximab）、依那西普（Etanercept）等，都是橫跨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎等多種炎癥適應(yīng)癥的重磅藥物[15]。

后者的經(jīng)典應(yīng)用則更廣為人知。1990年代，研究者們先后發(fā)現(xiàn)了CTLA4和PD-1兩個在免疫細胞中表達的細胞表面蛋白，且都介導(dǎo)了對免疫機能的抑制作用。敲除CTLA4或PD-1的小鼠都表現(xiàn)出了全身性的自身免疫癥狀。后續(xù)研究更是進一步發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞可以通過高表達PD-1的配體PD-L1的方式抑制免疫機能，逃逸免疫系統(tǒng)的識別和殺傷，從而促進自身的生存和繁殖。這一系列研究最終指向了引發(fā)腫瘤治療領(lǐng)域革命的癌癥免疫療法。靶向PD-1/PD-L1通路的藥物納武單抗（Nivolumab）、帕博麗珠單抗（Pembrolizumab），靶向CTLA通路的伊匹單抗（lpilimumab）等，也成為了適應(yīng)癥覆蓋十幾種不同腫瘤類型的重磅藥物[16]。

延續(xù)類似的邏輯，細胞焦亡的異常激活或者抑制，或者更廣泛的天然免疫系統(tǒng)的異常激活和抑制，是否有可能和人類疾病有直接關(guān)聯(lián)，從而可以用于指導(dǎo)藥物的開發(fā)呢？

當(dāng)然如此。我們?nèi)匀幌扔懻摷毎雇鲞^程的異常激活。研究者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，天然免疫和焦亡通路的蛋白，如果出現(xiàn)功能增強的基因變異，確實可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的自身免疫疾病。例如Pyrin的基因變異會導(dǎo)致家族性地中海熱，發(fā)病過程中也伴隨著Gasdermin D介導(dǎo)的細胞焦亡[17]；ALPK1的基因變異會導(dǎo)致罕見的ROSAH綜合征[18]，等等。在更為常見的自身免疫病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎中，也觀察到了細胞焦亡過程的異常激活[19][20][21]。還有，病原微生物入侵人體如果長時間得不到有效清除，人體的天然免疫反應(yīng)和焦亡過程會過度激活，引起致命的膿毒血癥[22]。那么，設(shè)計藥物反其道而行之，抑制焦亡的過度激活，也許就能夠治療這些疾病。

細胞焦亡的異常抑制也和人類疾病有關(guān)。在不少腫瘤類型中，焦亡通路的基因，特別是Gasdermin家族，處于深度抑制狀態(tài)[23]。這本身很容易理解，因為誘導(dǎo)細胞死亡，包括凋亡和焦亡，本就是人體免疫系統(tǒng)消滅異常細胞的手段之一。癌細胞自然需要通過逃逸這些控制手段來保護自身的生存和繁殖。而相應(yīng)的，2020年來自邵峰實驗室和Judy Lieberman實驗室的兩項研究也分別證明，免疫細胞也可以通過一個非常特別的機制繞過上述逃逸機制殺傷腫瘤細胞。具體來說，免疫細胞可以釋放一類叫做顆粒素（Granzyme）的蛋白酶，借由細胞之間的穿孔素通道進入癌細胞，直接切割并激活Gasdermin蛋白，誘導(dǎo)腫瘤細胞的焦亡[24][25]。

按照此邏輯推演，激活腫瘤細胞內(nèi)被深度抑制的焦亡通路，是一條很有前途的腫瘤藥物開發(fā)路徑。事實上，2020年人們也發(fā)現(xiàn)，如果將Gasdermin蛋白特異性的導(dǎo)入腫瘤細胞，確實觀察到了顯著的腫瘤殺傷效果[26]。特別值得注意的是，腫瘤細胞焦亡可能不僅僅是殺死了這枚腫瘤細胞自己。我們在前文反復(fù)提到，細胞焦亡這種暴烈的細胞死亡過程，能夠最大限度的刺激機體免疫反應(yīng)。一枚腫瘤細胞的焦亡，可能發(fā)揮所謂的“旁觀者效應(yīng)”，吸引和激活更多的免疫細胞來到腫瘤位置，殺傷周圍更多的腫瘤細胞。作為旁證，2017年的一項研究也證明，化療藥物的腫瘤殺傷作用，也可能是通過誘導(dǎo)焦亡、激活病灶部位的免疫反應(yīng)來實現(xiàn)的[27]。

值得一提的是，不同的Gasdermin家族成員體現(xiàn)出了不同的組織特異性，這一點既反映了它們不同的生理功能，也為后續(xù)藥物開發(fā)給出了重要的提示。

例如，Gasdermin D的表達范圍最為廣泛，因此可以用來治療全身性的炎癥疾病，例如病原菌感染引起的膿毒血癥[28]；Gasdermin B的基因變異和異常表達和哮喘、潰瘍性結(jié)腸炎等慢性炎癥的發(fā)病有關(guān)，因此對它的抑制可能治療這些疾病[29]；而Gasdermin B/E在某些腫瘤類型中高表達（但功能被深度抑制），因此如果設(shè)計藥物激活它們則可能成為有效的癌癥藥物。

4

細胞焦亡作為藥物靶點：展望和挑戰(zhàn)

根據(jù)上面的討論，細胞焦亡作為腫瘤和免疫相關(guān)疾病的全新靶點，在科學(xué)上已經(jīng)有了相當(dāng)充分的證據(jù)。簡單總結(jié)的話，抑制細胞焦亡通路可能治療和人體免疫活動過強有關(guān)的疾病，包括各種慢性炎癥、自身免疫疾病、細菌感染引發(fā)的膿毒血癥等；而激活細胞焦亡通路則可能殺傷癌細胞，治療各種癌癥，或者提升其他癌癥藥物的殺傷效率。

當(dāng)然，這只是一個較為簡化的總結(jié)。真實的疾病場景和藥物開發(fā)過程顯然要復(fù)雜得多。就Gasdermin蛋白家族來說，其促進焦亡的機制并非是簡單的酶學(xué)反應(yīng)，而是是被切割后大量單體組裝成環(huán)、形成細胞膜上的孔洞，因此如何篩選和設(shè)計藥物阻止Gasdermin的切割和組裝，本身就是很有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。同時因為Gasdermin家族有五個成員都可以引起焦亡，可能我們還需要區(qū)分不同成員在不同免疫疾病中的作用，設(shè)計有靶點專一性的藥物。

更重要的是，上面我們討論的研究固然主要在免疫細胞（特別是天然免疫的核心成員巨噬細胞）中完成，但焦亡通路卻是普遍存在于人體細胞中的固有機制。因此如果不加選擇地抑制或者激活焦亡通路，可能會引發(fā)全身性的毒副作用。因此，在這類藥物用于疾病治療時，可能也需要審慎地對適應(yīng)癥和適用人群進行選擇。

這些問題是所有真正原創(chuàng)性的新藥上市之前都必須面臨和克服的問題。對于靶向全新生物學(xué)機制（而非僅僅是全新生物學(xué)靶點）的“first in category”藥物來說更是如此。

就拿我們剛剛討論過的腫瘤免疫藥物為例，事實上，即便人們已經(jīng)在實驗室研究中理解了CTLA4和PD-1/PD-L1信號確實能夠抑制免疫細胞的功能，特別是腫瘤細胞還能夠通過PD-L1信號逃逸免疫系統(tǒng)的識別和殺傷，當(dāng)這些藥物進入臨床試驗后，仍然還需要一個漫長的探索過程去挖掘真正的適應(yīng)癥和適用人群。

靶向CTLA4的伊匹單抗因副作用較大，最終僅在黑色素瘤這一個適應(yīng)癥上獲得批準(zhǔn)。而靶向PD-1的納武單抗和帕博麗珠單抗雖然目前獲批了多個癌種的適應(yīng)癥，但其臨床探索過程也可謂一波三折。主導(dǎo)納武單抗臨床試驗的美國BMS公司在一期臨床試驗中納入了多個實體瘤類別的受試者，并看到了較為積極的療效[30]，BMS公司一鼓作氣推動了更大規(guī)模的多瘤種臨床試驗，但卻遭遇了數(shù)個意料之外的失敗，2016年該藥物在非小細胞肺癌中的慘烈失敗更是動搖了整個市場對癌癥免疫藥物的信心[31]。所幸在2015-2017年，約翰霍普金斯大學(xué)的Bert Vogelstein實驗室證明，存在DNA錯配修復(fù)障礙、從而帶有高突變載荷的腫瘤細胞更容易對PD-1藥物產(chǎn)生響應(yīng)[32][33],才為這類藥物找到了真正準(zhǔn)確的適用人群。

近年來，在天然免疫領(lǐng)域也有一個類似的明星分子可供參照，就是NLRP3分子。這個分子廣泛參與了免疫細胞對多種病原體特征信號（如ATP和雙鏈RNA）、以及人體內(nèi)異常生理信號(如飽和脂肪酸和尿酸鈉結(jié)晶)的識別，也能通過激活caspase誘導(dǎo)包括焦亡在內(nèi)的炎癥反應(yīng)[34]。根據(jù)我們上面的討論，靶向NLRP3分子也可能成為治療各種慢性炎癥和自身免疫疾病的新方式。近年來也有多家公司致力于開發(fā)靶向NLRP3的藥物，其中不乏資本市場的寵兒，例如在2019年被諾華以15億美金總價收購的IFM Therapeutics公司，以及2018年上市、市值約15億美元的Ventyx Biosciences公司。但即便如此，靶向NLRP3的藥物目前仍未能明確其適應(yīng)癥和適用人群，估計還需要多個大規(guī)模臨床試驗的摸索才能塵埃落定。

從本質(zhì)上說，這個探索過程其實是基礎(chǔ)科學(xué)研究向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化的必經(jīng)之路。在實驗室里，科學(xué)家們?nèi)粘Ｌ幚淼氖亲兞繂我?、參?shù)可控的“完美”實驗條件，相對容易獲得干凈和純粹的研究結(jié)論。但一旦進入人體真實應(yīng)用，特別是諸如慢性炎癥和腫瘤這樣動態(tài)變化、成因復(fù)雜、千人千面的疾病，需要考慮的干擾因素驟然變多，而藥物本身的影響也更為復(fù)雜廣泛。如何完成這中間的轉(zhuǎn)換，考驗的不光是科學(xué)發(fā)現(xiàn)的質(zhì)量，還有科學(xué)家、藥物開發(fā)者、臨床醫(yī)生之間的密切合作。

和此目標(biāo)相一致的，2020年邵峰也主導(dǎo)創(chuàng)立了炎明生物，旨在開發(fā)靶向Gasdermin和ALPK1蛋白的全新藥物。根據(jù)公開信息，炎明生物已經(jīng)開發(fā)了靶向ALPK1蛋白的小分子激活劑，以及靶向Gasdermin的小分子抑制劑。我當(dāng)然也非常期待，邵峰實驗室積累的科學(xué)發(fā)現(xiàn)，能夠以炎明生物為載體，完成一個萬眾期待的證明：在中國的土地上，不光能完成高度原創(chuàng)性的生物醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)，還能通過科學(xué)家、藥物開發(fā)者、臨床醫(yī)生的緊密配合，完成原創(chuàng)性科學(xué)發(fā)現(xiàn)到“first in category”藥物開發(fā)的順利轉(zhuǎn)化，惠澤全世界的疾病患者。

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