2017年即將過去，如果要評(píng)選本年度最熱研究領(lǐng)域，RNA的m6A修飾一定榜上有名，BioArt在2017年報(bào)道了差不多十篇相關(guān)的研究論文了。而去甲基化酶FTO的研究是最有爭(zhēng)議的。
2011年10月，芝加哥大學(xué)的何川教授在Nature Chemical Biology上發(fā)表論文“N6-Methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO”，首次證明FTO是m6A的去甲基化酶，結(jié)合1997年鑒定m6A甲基化酶METTL3的結(jié)果【1】，m6A作為mRNA上最豐富的可逆修飾受到了關(guān)注，開啟了m6A研究熱潮的序幕。
以這篇文章為基礎(chǔ)，2016年12月，何川教授與陳建軍教授合作，在Cancer cell上發(fā)表研究成果“FTO Plays an Oncogenic Role in Acute Myeloid Leukemia as a N6-Methyladenosine RNA Demethylase”（陳建軍、何川組Cancer Cell報(bào)道肥胖基因FTO過表達(dá)導(dǎo)致白血病），該研究第一次闡明了m6A在急性髓系白血病中的作用，并建立了系統(tǒng)的m6A與癌癥研究方法和體系，具有重要的意義。一時(shí)間，m6A在不同腫瘤中的作用成為新的研究方向。
然而，2017年1月，Samie R. Jaffrey等人在Nature上發(fā)表研究“Reversible methylation of m6Am in the 5′ cap controls mRNA stability”，直指FTO不是m6A去甲基化酶，而是與其具有非常相似結(jié)構(gòu)的m6Am的去甲基化酶（真的搞錯(cuò)了嗎？RNA去甲基化酶FTO的作用底物解讀丨特別推薦）。有趣的是，雖然只是一個(gè)甲基的區(qū)別，m6A和m6Am對(duì)mRNA的作用卻完全不同：前者促進(jìn)mRNA降解，而后者卻能提高mRNA的穩(wěn)定性。
同年5月，Cancer cell刊登來自德克薩斯大學(xué)健康科學(xué)中心Ricardo C.T.Aguiar的研究“IDH Mutation, Competitive Inhibition of FTO, and RNA Methylation”，該研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)IDH基因突變時(shí)，其催化產(chǎn)物可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制FTO的活性，使FTO不能發(fā)揮m6A去甲基化酶的功能（【爭(zhēng)鳴】重審FTO在白血病中的癌基因作用）。
一時(shí)間，無論是FTO作為m6A去甲基化酶的身份，還是其在白血病中的作用，都變得撲朔迷離。
12月14日，Cell 在線了一篇文章“R-2HG Exhibits Anti-tumor Activity by Targeting FTO/m6A/MYC/CEBPA Signaling”，這是何川教授與陳建軍教授合作的第2篇關(guān)于FTO在白血病中的作用研究（浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院的Jie Jin為該文的共同通訊作者），這項(xiàng)工作非常漂亮的回答了兩個(gè)問題：
1.在IDH基因突變的情況下，F(xiàn)TO真的沒有功能嗎？
2.FTO在白血病中的功能是m6A介導(dǎo)的，還是m6Am介導(dǎo)的？
論文解讀：
撰文丨黃蔚 （中山大學(xué)）
基因IDH1和IDH2編碼代謝酶，可以催化異檸檬酸的氧化脫羧反應(yīng)，生成α-酮戊二酸（α-KG）。而α-KG是許多Fe(II)/a-KG依賴的雙加氧酶的底物，包括DNA羥化酶（TET家族蛋白）（Cell未遠(yuǎn)，Nature又至：維生素C抗癌記丨深度關(guān)注），組蛋白去甲基化酶（Jumonji家族）和RNA的m6A去甲基化酶（FTO等）。當(dāng)IDH突變時(shí)，其催化產(chǎn)物從α-KG變成了R-2HG，兩者具有相似的結(jié)構(gòu)，但R-2HG卻能抑制Fe(II)/a-KG依賴雙加氧酶的活性【2】（下圖）。
因?yàn)?em>IDH突變導(dǎo)致分化受阻和促進(jìn)細(xì)胞癌變，而R-2HG的抑制劑可以逆轉(zhuǎn)這一過程，因此長(zhǎng)期以來，R-2HG被認(rèn)為是促癌代謝物。2013年Science發(fā)表Kaelin WG Jr.等人的研究“(R)-2-hydroxyglutarate is sufficient to promote leukemogenesis and its effects are reversible”，幾乎給R-2HG的在白血病中的促癌功能下了實(shí)錘。
意外的是，臨床研究表明，具有IDH突變的神經(jīng)膠質(zhì)瘤病人的生存期比IDH野生型的病人更長(zhǎng)，并且，在急性髓系白血病人中觀察到類似的現(xiàn)象。那么，IDH突變的產(chǎn)物R-2HG在白血病中究竟是發(fā)揮了什么作用呢？
研究者用R-2HG處理了27個(gè)白血病細(xì)胞系（均不含IDH突變），發(fā)現(xiàn)R-2HG對(duì)細(xì)胞增殖和活力的抑制呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴的趨勢(shì)（圖1）.
圖1 體外實(shí)驗(yàn)證明R-2HG抑制細(xì)胞增殖
顏色表示不同的處理，直徑表示細(xì)胞的相對(duì)活力?？梢钥闯觯琑-2HG可以抑制細(xì)胞的增殖，但是不同細(xì)胞的敏感性不同。以上是體外實(shí)驗(yàn)，那么在體內(nèi)又是什么情況呢？研究者通過給荷瘤小鼠注射R-2HG以及利用轉(zhuǎn)基因的方法導(dǎo)入可誘導(dǎo)表達(dá)的IDH1突變基因，發(fā)現(xiàn)對(duì)于注射R-2HG敏感細(xì)胞系的小數(shù)，兩者均能顯著延長(zhǎng)它們生存期。（圖2）
圖2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明R-2HG延長(zhǎng)小鼠生存期
對(duì)于前文我們提到的Science關(guān)于R-2HG促進(jìn)白血病的研究，研究者非常貼心的重復(fù)了該研究，發(fā)現(xiàn)只有在細(xì)胞因子GM-CSF存在的條件下，R-2HG可以促進(jìn)TF1細(xì)胞的增殖，而在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，R-2HG則抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。
那么，R-2HG抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制是什么？通過RNA測(cè)序分析，研究者發(fā)現(xiàn)Fe(II)/a-KG依賴的雙加氧酶在敏感細(xì)胞系中普遍表達(dá)量更高，并且FTO的表達(dá)量與細(xì)胞對(duì)R-2HG的敏感度成正比。（圖3）
圖3 FTO在敏感細(xì)胞中高表達(dá)
結(jié)合Ricardo C.T.Aguiar等人的研究， R-2HG有可能特異性的抑制了FTO的活性，使m6A水平升高，造成細(xì)胞增殖降低。通過dot blot實(shí)驗(yàn)，研究者發(fā)現(xiàn)只有在對(duì)R-2HG敏感的細(xì)胞中，R-2HG才能顯著的升高m6A的水平，而對(duì)R-2HG不敏感的細(xì)胞，R-2HG的處理并不能使m6A上升。(圖4)
圖4 R-2HG抑制FTO的活性并提高敏感細(xì)胞m6A水平
那么，F(xiàn)TO活性被R-2HG抑制后，引起了哪些基因的變化呢？通過MeRIP-seq和RNA-seq，研究者發(fā)現(xiàn)大量轉(zhuǎn)錄本的m6A水平發(fā)生了變化，主要中在MYC，E2F1和G2M等信號(hào)通路?？紤]到FTO被報(bào)道催化m6Am的去甲基化，而m6Am集中在5UTR最前端，研究者仔細(xì)分析了差異的甲基化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)主要集中在CDS區(qū)以及5UTR的后半段，說明在白血病中，F(xiàn)TO主要催化m6A，而不是m6Am的去甲基化。
鑒于著名的癌基因MYC在R-2HG處理后，發(fā)生了明顯的降低，研究者將研究方向主要集中在R-2HG如何通過抑制FTO，提高m6A水平，導(dǎo)致MYC降低上。實(shí)驗(yàn)顯示，R-2HG可以顯著提高敏感細(xì)胞的MYC m6A水平，而對(duì)耐藥細(xì)胞的MYC m6A水平?jīng)]有影響。當(dāng)穩(wěn)定敲低FTO后，R-2HG不能提高敏感細(xì)胞的MYC m6A水平，而當(dāng)過表達(dá)FTO后，R-2HG能升高MYC m6A水平，這說明R-2HG依賴FTO影響MYC m6A水平。（圖5）由于m6A的閱讀蛋白YTHDF2主要介導(dǎo)mRNA的講解，研究者進(jìn)一步證實(shí)了YTHDF2可以結(jié)合MYC，促進(jìn)其降解。
圖5 R-2HG影響MYC m6A水平
至此，研究者完整地回答了R-2HG如何通過抑制FTO活性，增加MYC m6A水平，而不是m6Am，導(dǎo)致MYC降解，從而抑制白血病細(xì)胞增殖。（圖6）
圖6 working model
然而，研究并沒有結(jié)束。既然R-2HG對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)是不利的，那么為什么在AML中存在10-20%的IDH突變呢？帶著這個(gè)問題，研究者分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)IDH突變的病人樣品中，MYC的表達(dá)量更好，F(xiàn)TO的表達(dá)量更低。MYC和FTO的穩(wěn)態(tài)可能決定了癌細(xì)胞是否對(duì)R-2HG敏感。對(duì)IDH突變的癌細(xì)胞，R-2HG和MYC抑制劑（JQ1及其他一線抗癌藥物）的聯(lián)合使用，對(duì)細(xì)胞的殺傷力更強(qiáng)，說明二者的聯(lián)合有望成為針對(duì)IDH突變白血病的新療法。
而對(duì)于大部分IDH野生型的白血病，該研究是否有指導(dǎo)意義呢？研究者發(fā)現(xiàn)R-2HG或FTO抑制劑的單獨(dú)使用，以及它們分別與其他化療藥物的使用，都有很好的療效。
總的來說，該研究推翻了長(zhǎng)期以來認(rèn)為R-2HG是促癌代謝物的觀念，為IDH突變型和野生型白血病的治療都提供了新的思路。
參考文獻(xiàn)：
1、Bokar, J. A., Shambaugh, M. E., Polayes, D., Matera, A. G., & Rottman, F. M. (1997). Purification and cDNA cloning of the AdoMet-binding subunit of the human mRNA (N6-adenosine)-methyltransferase. RNA, 3(11), 1233-1247.
2、Xu, W., Yang, H., Liu, Y., Yang, Y., Wang, P., Kim, S. H., ... & Xiong,Y (2011). Oncometabolite 2-hydroxyglutarate is a competitive inhibitor of α-ketoglutarate-dependent dioxygenases. Cancer cell, 19(1), 17-30.
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