一、外周血樣本
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人外周血單個核細胞（Peripheralblood mononuclear cells ，PBMCs ）的分離制備：
1）醫(yī)院及其血液中心采取的新鮮的肝素抗凝的2ml外周靜脈血備用；
2）將肝素抗凝的靜脈血用等體積的PBS稀釋并充分混勻；
3）將人淋巴細胞分離液ficoll從 4 °C 取出，恢復至室溫，取4ml轉移至15ml 試管中備用；
4）用無菌吸管吸取稀釋后的靜脈血，沿管壁緩慢入至人淋巴細胞分離液液面上
（ficoll分離液：抗凝血1:1），緩緩地不要晃蕩，保持界面的清楚；
5）將加完外周靜脈血后的 50 ml 試管放入臺式離心機中，2200 rpm 水平離心，
室溫 25 min，注意離心機升降速都調至最慢，降速設置中一定要設置成no break，或者只有1成的制動。
6）離心完畢后，小心取出15 ml 試管，離心后管內可分為三層，在上、中層界面處有一層以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，即為我們所需要的單個核細胞；
7）用無菌吸管吸取白色云霧層狹窄帶的單個核細胞，并置于另一 15 ml 離心管
中，加入5mlPBS，1500 rpm，室溫離心 5min，并充分洗滌細胞兩次；
8）末次離心后，棄去上清，加入完全 RPMI 1640 培養(yǎng)液重懸細胞，充分混勻；
9）用白細胞計數(shù)液計數(shù)單個核細胞，根據(jù)實驗所需，加入完全 1640培養(yǎng)液調整細胞濃度到所需要的濃度。
二、組織樣本
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常見的組織類型：小鼠脾臟、肝臟、心臟、肺臟、腦組織、腫瘤組織、人腫瘤組織、皮膚組織……
傳統(tǒng)組織處理方法：
機械法：網(wǎng)搓法、研磨法
適用樣本類型：脾臟、淋巴結、胸腺
網(wǎng)搓法
1、將300 目尼龍網(wǎng)扎在無菌的小燒杯上；
2、把剪碎的組織放在網(wǎng)上，以眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊加生理鹽水沖洗，直到將組織搓完；
3、收集細胞懸液于離心管中， 1500rpm離心5min；
4、棄上清液，加紅細胞裂解液重懸沉淀，室溫作用5min，加等體積的PBS中和后，1500rpm離心5min，棄上清，用PBS洗滌一次，再用PBS重懸，細胞計數(shù)后即可使用。
研磨法
1、先將組織剪成1-2mm大小組織塊；
2、放入組織研磨器中，轉動研棒，研至勻漿；
3、加入10ml生理鹽水，沖洗研磨器；
4、收獲細胞懸液，并經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾，1500rpm離心5min；
5、棄上清液，加紅細胞裂解液重懸沉淀，室溫作用5min，加等體積的PBS中和后，1500rpm離心5min，棄上清，用PBS洗滌一次，再用PBS重懸，細胞計數(shù)后即可使用。
酶解法：胰蛋白酶類、膠原酶、溶菌酶、彈性蛋白酶
適用樣本類型：肝臟、腎臟、心臟、肺臟、脊髓、腦、腸道、皮膚、腫瘤等；
操作步驟：
1、先將組織剪成泥狀。
2 、用胰蛋白酶或膠原酶消化組織塊，胰蛋白酶適用千消化細胞間質較少的軟組織，如胚胎、上皮、肝、腎等組織。胰蛋白酌工作濃度一般為 0. 1 %—0 . 5 % 。對于纖維較多的組織或較硬的癌組織常用0 . 25 %膠原酶，膠原酌對組織中膠原蛋白類結構消化作用強，它僅對細胞間質有消化作用而對上皮細胞影響不大。膠原酶常用濃度為 0 . 1—0 . 3ug / ml ，用大于組織量30—50 倍的胰蛋白酶液或膠原酶液在 37°C ，搖床上消化組織，消化時間的長短依組織類型而定，一般來說，胰蛋白酶油作用 20—60 min，膠原酶需1—4h左右，一般還會加入DNA核酸內切酶。
3、消化完畢后，將細胞懸液通過200目孔徑尼龍網(wǎng)過濾，以除掉未充分消化的組織；
4、已過濾的細胞懸液經(jīng)1500rpm離心5min后，棄上清液，加紅細胞裂解液重懸沉淀，室溫作用5min，加等體積的PBS中和后，1500rpm離心5min，棄上清，用PBS洗滌一次，再用PBS重懸，細胞計數(shù)后即可使用。
下表整理了人和小鼠常見的不同組織處理方法，并附上參考文獻，此內容來源于Worthington：
Species | Cells | Enzyme(s) | Reference |
Human | 脂肪細胞 | 2型膠原酶:0.01-0.5% | Effect of Collagenase Concentration on The Isolation of Small Adipocytes from Human Buccal Fat Pad., J Oral Sci , 2018 |
Human | 脂肪細胞 | Collagenase Type 1: 0.1% | Epigenome-wide Association Study of Body Mass Index, and the Adverse Outcomes of Adiposity, Nature541, 81, 2017 |
Human | 基質細胞 | 膠原酶2型:0.075% | Ultrasound-Assisted Liposuction Provides a Source for Functional Adipose-Derived Stromal Cells., Cytotherapy 19, 1491-1500, 2017 |
Human | 骨髓基質細胞
| 膠原酶1型:0.075% | Mesenchymal Stromal Cells Protect Human Cardiomyocytes from Amyloid Fibril Damage, Cytotherapy 19, 1426-1437, 2017 |
Human | 間充質干細胞 | 膠原酶2型:0.2% | Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Alters Their Immunomodulatory Properties in a Tissue-Specific Manner., Stem Cells 35, 1636-1646, 2017 |
Human | 脂肪源內皮細胞 | 膠原酶1型:0.1% | Autologous Cell Sources in Therapeutic Vasculogenesis: In Vitro and In Vivo Comparison of Endothelial Colony-Forming Cells from Peripheral Blood and Endothelial Cells Isolated from Adipose Tissue., Cytotherapy 18, 242-52, 2016 |
Human | 脂肪干細胞 | 膠原酶1型:0.1% | High Glucose-Induced Reactive Oxygen Species Generation Promotes Stemness in Human Adipose-Derived Stem Cells,Cytotherapy 18, 371-83, 2016 |
Human | 骨髓基質細胞
| 膠原酶4型:0.2% | Effect of Mild Heat Stress on the Proliferative and Differentiative Ability of Human Mesenchymal Stromal Cells., Cytotherapy17, 359-68, 2015 |
Human | 脂肪干細胞
| 膠原酶2型:0.1% | Expression Analysis of Human Adipose-Derived Stem Cells During In Vitro Differentiation to an Adipocyte Lineage., BMC Med Genomics 8, 41, 2015 |
Human | 脂肪基質
| 膠原酶1型:0.075% | Therapeutic Potential of Adipose-Derived SSEA-3-Positive Muse Cells for Treating Diabetic Skin Ulcers.,Stem Cells Transl Med 4, 146, 2015 |
Human | 脂肪組織細胞
| 膠原酶1型:0.1% | Differential Effects of Processing Time and Duration of Collagenase Digestion on Human and Murine Fat Grafts.,Plast Reconstr Surg 136, 189e-199e, 2015 |
Human | 脂肪基質血管細胞 | 中性蛋白酶:2.4 u/ml 膠原酶:250 u /毫升 | Human White and Brite Adipogenesis is Supported by MSCA1 and is impaired by Immune Cells., Stem Cells 33, 1277-91, 2015 |
Human | 脂肪源性間充質干細胞 | 膠原酶2型:0.1% | Defined Serum-Free Media for In Vitro Expansion of Adipose-DerivedMesenchymal Stem Cells., Cytotherapy 16, 915, 2014 |
Human | 脂肪提取干細胞 | 膠原酶1型:0.15% | Choosing the Right Type of Serum for Different Applications of Human Adipose Tissue-Derived Stem Cells: Influence on Proliferation and Differentiation Abilities.,Cytotherapy 16, 789, 2014 |
Human | 間充質基質 | 膠原酶1型:0.1% | Proliferative and Phenotypical Characteristics of Human Adipose Tissue-Derived Stem Cells: Comparison of Ficoll Gradient Centrifugation and Red Blood Cell Lysis Buffer Treatment Purification Methods., Cytotherapy 16, 1220-8, 2014 |
Human | 脂肪間質干細胞 | 動物游離膠原酶:200u /ml | Xenofree Enzymatic Products for the Isolation of Human Adipose-Derived Stromal/Stem Cells., Tiss Eng 19, 473-8, 2013 |
Human | 基質血管成分 | 膠原酶1型:0.075% | Stromal Vascular Fraction Isolated from Lipo-Aspirates Using an Automated Processing System: Bench and Bed Analysis., J Tissue Eng Regen Med 7, 864, 2013 |
Human | 脂肪干細胞 | 膠原酶1型:0.1% | Platelet-Rich Plasma Greatly Potentiates Insulin-Induced Adipogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stem Cells Through a Serine/Threonine Kinase Akt-dependent Mechanism and Promotes Clinical Fat Graft Maintenance., Stem Cells Transl Med 1, 206-20, 2012 |
Human | 血管周圍干細胞 | 膠原酶2型:0.1% | An Abundant Perivascular Source of Stem Cells for Bone Tissue Engineering., Stem Cells Transl Med 1, 673, 2012 |
Human | 脂肪來源的間質血管 | 膠原酶1型:0.1% | Concise Review: Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells and Platelet-Rich Plasma: Basic and Clinical Implications for TissueEngineering Therapies in Regenerative Surgery., Stem Cells Transl Med 1, 230-6, 2012 |
Mouse | 脂肪基質 | 膠原酶1型:0.1% | Adipose Stromal Vascular Fraction-Mediated Improvements at Late-Stage Disease in a Murine Model of Multiple Sclerosis., Stem Cells 35, 532-544, 2017 |
Mouse | 脂肪間質細胞 | 膠原酶2型:0.2% | Adipose Mesenchymal Stromal Cells Minimize and Repair Radiation-Induced Oral Mucositis.,Cytotherapy 18, 1129-45, 2016 |
Mouse | 脂肪基質
| 膠原酶1型:0.1% | Improved Mobilization of Exogenous Mesenchymal Stem Cells to Bone for Fracture Healing and Sex Difference., Stem Cells 34, 2587-2600, 2016 |
Mouse | 脂肪細胞 | 膠原酶:0.1% | The Effects of A Single Developmentally-Entrained Pulse of Testosterone in Female Neonatal Mice On Reproductive and Metabolic Functions in Adult Life., Endocrinology 156, 3737, 2015 |
Mouse | 間質血管細胞 | 膠原酶2型:0.2% | Natural Killer T Cells in Adipose Tissue are Activated in Lean Mice., Exp Anim 62, 319, 2013 |
Mouse | 脂肪干細胞 | 膠原酶2型:0.1% | Biological and Clinical Availability of Adipose-Derived Stem Cells for Pelvic Dead Space Repair., Stem Cells Transl Med 1, 803, 2012 |
三、貼壁細胞
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貼壁細胞（adherent cells）:活體體內細胞當離體置于體外培養(yǎng)時大多數(shù)以貼壁方式生長，主要包括正常細胞（例如：成纖維細胞、巨噬細胞、神經(jīng)膠質細胞、心肌細胞以及肝、肺、腎、乳腺、皮膚細胞等）和腫瘤細胞。
胰蛋白酶消化
胰蛋白酶：最常用，濃度一般0.25%-5%，37℃消化時間一般1-5min，用血清終止；
四、脫落細胞
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臨床上常見的脫落細胞經(jīng)過簡單處理就能制備成單細胞懸液，用于后續(xù)實驗，具體操作：
1、食管拉網(wǎng)細胞的單細胞懸液的制備：
（1）將食管拉網(wǎng)器上的細胞洗脫到10ml PBS液中， 1500rpm，5min離心后，再用PBS液洗2次，800rpm，離心2min，棄上清；
（2）再加入PBS液5ml，以300目尼龍濾網(wǎng)過濾，離心沉淀去上清；
（3）加少許PBS液混勻沉淀細胞，備用。
2、胸、腹水脫落細胞的制備
（1）抽取胸、腹水50ml，加入1000U/ml肝素液1ml，放鹽水瓶中置于4℃冰箱中靜置6~12h，棄去上清；
（2）將底部10~20ml用長吸管移入試管中，用PBS液洗3次，以1500r/min離心沉淀5min；
（3）再加5ml PBS液混勻，用300目尼龍濾網(wǎng)過濾，離心沉淀去上清；
（4）加少許PBS液，混勻；加固定液或低溫保存，備用。
3、沖洗液細胞樣品的制備
（1）用300~500ml生理鹽水沖洗膀胱，沖洗一定時間后，吸出沖洗液放入容器中于冰箱內置6~12h；
（2）取沉淀液20~40ml，離心沉淀并以生理鹽水洗2次，吸上清；
（3）加10ml PBS液，混勻，以300目尼龍濾網(wǎng)過濾，離心沉淀去上清；
（4）過濾后1000rpm/min，10min，離心沉淀，去上清；加固定液或低溫保存?zhèn)溆谩?/p>
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