文章來源： 中華骨科雜志,2020,40 (10): 680-688
作者：張保良 陳仲強
一、BMP信號通路
BMP是骨基質(zhì)中廣泛存在的一種酸性蛋白，屬于轉化生長因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）超家族成員，根據(jù)序列相似性和功能可分為4個亞族：①BMP-2和BMP-4；②BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8a和BMP-8b；③BMP-9和BMP-10；④BMP-3、BMP-3b、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、BMP-15和BMP-16，其中BMP-2、BMP-7、BMP-6、BMP-9能夠促進骨細胞分化、增生及骨損傷修復[10,11]。BMP受體包括7種Ⅰ型受體（ALK 1-7）和5種Ⅱ型受體（ActRⅡA、ActRⅡB、BMPRⅡ、TβRⅡ和AMHRⅡ）[12]。研究表明，BMP參與了軟骨內(nèi)成骨過程，其中BMP-2與Ⅰ型和Ⅱ型跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體蛋白形成的異四聚體復合物結合，經(jīng)BMP激活后，可使細胞內(nèi)信號分子Smad1、Smad5、Smad8磷酸化，而后聯(lián)合Smad4轉移到細胞核，與轉錄因子Runx2發(fā)生作用，上調(diào)成骨細胞基因的表達，從而促進成纖維細胞轉化為成骨細胞，誘導骨化形成（圖2）[12,13]。
圖2 BMP/TGF-β信號通路示意圖。BMP或TGF-β結合并激活其Ⅰ型或Ⅱ型受體，并導致相應的Smads磷酸化；活化的Smads與Smad4形成復合物，移位到細胞核，啟動并激活成骨細胞特異性轉錄因子（如Runx2、Sox9、Osterix等），從而誘導間質(zhì)干細胞向成骨細胞分化及骨形成
黃韌帶骨化的病理本質(zhì)是軟骨內(nèi)成骨，多項研究已證實BMP-2及相關信號通路參與了骨化的發(fā)生和發(fā)展。Moon等[14]將腺病毒介導的BMP-2基因轉染黃韌帶細胞，在應力作用下，黃韌帶細胞中膠原Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ的基因表達水平增加，TGF-β1水平也有明顯提升，證實經(jīng)刺激的黃韌帶可通過自分泌和旁分泌BMP的方式誘導周圍正常黃韌帶細胞向成骨細胞分化。Kim等[15]研究發(fā)現(xiàn)Runx2或BMP-2在原代培養(yǎng)的黃韌帶細胞中的高水平表達促進了細胞的成骨分化，而BMP-2和Runx2聯(lián)合處理較任一成分單獨處理能獲得更好的成骨細胞分化。此結果表明，雖然Runx2作為BMP信號通路的一部分，但Runx2和BMP-2通路同時擁有共同和獨立的靶基因，兩者聯(lián)合介導了黃韌帶骨化的形成。研究證實，BMP/Smad1信號通路調(diào)節(jié)成骨細胞生命周期的特定方面，包括從間質(zhì)干細胞向成骨細胞的分化、成骨細胞增殖、成骨細胞礦化的活力和破骨細胞偶聯(lián)[16]。Shunzhi等[17]研究了機械應力對黃韌帶細胞成骨分化的作用機制，他采用蛋白免疫印跡法分析測定BMP蛋白和Smad1蛋白表達，發(fā)現(xiàn)未拉伸組和對照組之間未觀察到顯著差異，而拉伸組OLF細胞中BMP蛋白和Smad1蛋白表達顯著增加；并且骨鈣素（osteocalcin，OCN）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）等成骨相關因子的表達上調(diào)，說明機械應力通過BMP/Smad1信號通路影響人類黃韌帶細胞的成骨分化。
二、MAPK信號通路
MAPK是一組廣泛存在于細胞中的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，能被多種細胞外信號刺激發(fā)生磷酸化而激活[18]。MAPK信號通路由MAPK激酶激酶（MAP kinase kinase kinase，MAPKKK）、MAPK激酶（MAP kinase kinase，MAPKK）和MAPK三種連續(xù)作用的蛋白激酶組成，每個下游激酶作為上游激活劑的底物發(fā)揮作用，即活化的MAPKKK磷酸化并激活下游的MAPKK，隨后MAPKK磷酸化再激活MAPK，以級聯(lián)方式將細胞外信號放大并傳入細胞核內(nèi)，然后調(diào)節(jié)轉錄因子調(diào)控下游靶基因的表達，從而調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡等[19,20]。MAPK家族包括多個亞家族，其中細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、p38激酶（p38）和c-Jun末端激酶（JNK）在細胞的成骨分化過程中發(fā)揮了重要的作用（圖3）[21]。
圖3 MAPK信號通路示意圖。MAPK信號通路被細胞外信號刺激發(fā)生磷酸化而激活，首先MAPKK激酶（Raf、MLK3、TAK1、MEKK1/4等）被激活并磷酸化MAPK激酶（MEK1/2、MEK3/6、MEK4/7），而后磷酸化激活相應的MAPKs[細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2、p38激酶（p38）、c-Jun末端激酶（JNK）]，活化的ERK、p38、JNK進入細胞核激活Runx2、Sox9、Osterix等成骨轉錄因子，調(diào)節(jié)成骨細胞分化及骨形成
已有大量研究表明，多種細胞外因素通過MAPK信號轉導通路影響黃韌帶骨化的進程。Fan等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在牽拉應力作用下，胸椎黃韌帶細胞中的ERK1/2和p38通路被激活，而JNK通路未受影響。此外，p38特異性抑制劑SB203580顯著抑制牽拉刺激誘導的Osterix表達和ALP活化，而ERK1/2特異性抑制劑U0126僅輕微減弱了ALP活性，但完全抑制了Runx2表達，提示不同的MAPK信號通路在黃韌帶細胞成骨分化中的不同活化狀態(tài)。Zhong等[23]也證明了重組人生長分化因子5（growth differentiation factor 5, GDF-5）促進黃韌帶細胞的成骨分化是通過特異性地誘導ERK1/2和p38的磷酸化來實現(xiàn)，而不是JNK通路。李學斌等[24]首次提出骨橋蛋白（osteopontin，OPN）參與了黃韌帶骨化的發(fā)病過程，且證明MAPK信號通路在骨橋蛋白介導黃韌帶骨化中的重要作用，p38是誘導黃韌帶細胞成骨分化的關鍵因子。Zhang等[25]通過實驗證明了促炎性細胞因子——腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α）通過絲裂原活化蛋白激酶ERK途徑激活Osterix表達，促進黃韌帶細胞的成骨分化。另外，盧昌懷等[26]研究證明p38 MAPK信號通路通過介導TGF-β1/結締組織生長因子對人腰椎黃韌帶增生肥厚起重要的調(diào)控作用。許國峰等[27]研究了骨橋蛋白和自噬在黃韌帶骨化發(fā)生中的作用機制，發(fā)現(xiàn)經(jīng)骨橋蛋白誘導后，ERK、JNK和p38通路均磷酸化而激活，其中ERK、JNK磷酸化明顯，p38相對較弱。這與之前研究結果有一定差異，可能與樣本量或不同干預方式有關。總之，以上研究均表明MAPK信號通路在黃韌帶骨化發(fā)生、發(fā)展中起了一定的作用。
三、Wnt信號通路
Wnt是一類富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，其構成的Wnt信號通路被看作是調(diào)控細胞在整個生命周期中增殖、分化、衰老等活動的重要分子級聯(lián)反應之一[28]。Wnt信號通路包括依賴于β-catenin功能的經(jīng)典信號通路（Wnt/β-catenin通路）和獨立于β-catenin運行的非經(jīng)典通路（Wnt/Ca2+通路和平面細胞極性通路）[28]。目前發(fā)現(xiàn)的Wnt配體至少有19個，大多數(shù)信號通過經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮作用，其中β-catenin是該信號通路的中心靶點和必需成分[29]。在正常穩(wěn)態(tài)下，β-catenin作為降解復合物的一部分而穩(wěn)定存在，當分泌的Wnt通過與跨膜受體Frizzled和輔助受體LRP 4、5或6結合，誘導LRP胞質(zhì)尾部磷酸化，抑制GSK-3β活性，使β-catenin磷酸化并以單體形式從其降解復合物中釋放出來，在細胞質(zhì)中逐漸積累，最終移位至細胞核，與轉錄因子TCF/LEF結合，促使靶基因激活，從而調(diào)節(jié)細胞的生命活動（圖4）[30,31]。
圖4 Wnt/β-catenin信號通路示意圖。當細胞外有Wnt蛋白時，與跨膜受體Frizzled和輔助受體LRP 4、5或6結合而磷酸化，抑制GSK-3β活性，促使β-catenin自降解復合體釋放，在細胞內(nèi)大量聚集并進入細胞核內(nèi)，繼而啟動下游靶基因的表達，促進成骨細胞分化及骨形成
Wnt信號通路作為調(diào)節(jié)骨代謝和骨形成的重要通路之一，在黃韌帶骨化的發(fā)生機制中扮演著重要的角色。Cai等[32]研究發(fā)現(xiàn)，來源于黃韌帶骨化患者的黃韌帶細胞與對照組樣本相比，β-catenin、Runx2、Sox9和骨橋蛋白表達水平更高；并且將周期性拉伸應力作用于培養(yǎng)的細胞24 h，則進一步上調(diào)了黃韌帶骨化細胞中β-catenin、Runx2、Sox9和骨橋蛋白的表達水平，而對照組細胞中蛋白表達幾乎未受影響。機械應力下轉錄因子和β-catenin信號的mRNA表達水平較高，表明β-catenin信號的瞬時激活是黃韌帶骨化發(fā)生、發(fā)展中的重要過程。Yayama等[33]對骨化的黃韌帶組織進行免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)Wnt共受體LRP 6和LRP 5在骨化前沿周圍的間質(zhì)細胞和軟骨細胞中高水平表達，而在對照組樣本中，未觀察到Wnt共受體免疫反應；黃韌帶組織骨化區(qū)附近的間質(zhì)細胞中觀察到Wnt 3a免疫反應性。此外，在骨化黃韌帶組織中的間質(zhì)細胞，尤其骨化前沿的未成熟軟骨細胞中，β-catenin免疫組化染色呈陽性，對照組呈陰性。這說明Wnt信號在OLF骨化成熟過程中具有關鍵作用。
四、Notch信號通路
Notch蛋白是廣泛存在于細胞表面介導細胞信號轉導的受體蛋白。Notch信號通路主要包括Notch受體、Notch配體和靶基因，4種受體為Notch 1~4，5種Delta/Serrate/Lag-2 (DSL)配體，分別為Jagged (Jag) 1和2及Delta-like (Dll) 1、3和4，均為單通道跨膜蛋白[34]。Notch胞內(nèi)結構域（NICD）與DSL配體結合后被裂解釋放，轉位至細胞核，與EB病毒潛伏C啟動子結合因子1（CBF1）/hairless抑制因子/Lag1（CSL）等轉入因子形成蛋白復合物，共同啟動靶基因的表達[35]。Notch信號通路越來越被認為是人類骨骼發(fā)育和骨代謝平衡過程的重要參與者。Notch通路能夠調(diào)控細胞的成軟骨分化和成骨分化，Notch通路的失調(diào)可能導致骨硬化、骨質(zhì)疏松、軟骨發(fā)育不良、骨關節(jié)炎、骨肉瘤等一系列骨骼疾?。▓D5）[36,37]。
圖5 Notch信號通路示意圖。當Notch受體與Notch配體結合后，信號通路被激活，Notch受體在TACE及γ-分泌酶的作用下水解釋放出NICD片段，并轉移至細胞核內(nèi)與CSL蛋白，激活并啟動其下游靶基因及成骨轉錄因子（Runx2、Osterix等）的表達，調(diào)控成骨分化及骨形成
近年來有學者發(fā)現(xiàn)Notch信號通路也參與了黃韌帶骨化的病理過程。Qu等[38]測定了在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)的黃韌帶骨化患者和對照組患者的黃韌帶細胞中Notch信號的時空表達差異，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，OLF細胞中JAG1/Notch2/HES1表達在第7天增加，并在第14天維持，且早期成骨指標ALP和晚期指標OCN、OPN也顯著上調(diào)，第7天可見礦化結節(jié)的形成，第14天明顯升高。另外，當使用shRNA慢病毒載體敲除Notch 2時，黃韌帶細胞的成骨分化受到抑制，而pN2ICD載體使Notch 2過表達時，黃韌帶細胞的成骨分化能力增強。這些結果支持Notch信號通路在人黃韌帶細胞成骨分化中的作用。Qu等[39]在此基礎上進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-199b-5p可以通過靶向結合JAG1，并通過抑制Notch信號來抑制黃韌帶細胞的成骨分化。由此推測JAG1和miR-199b-5p可能是黃韌帶骨化，甚至其他骨化性疾病的治療靶點。Yang等[40]闡明了Notch信號通路在血管生成和黃韌帶骨化過程中的作用，刺激血管生成素2（angiopoietin 2, ANGPT2）的表達增強了Notch2的表達和成骨分化，而抑制ANGPT2則表現(xiàn)出相反的作用；此外，下調(diào)Notch 2表達不能影響ANGPT2的表達。這一系列結果表明Notch信號通路是ANGPT2調(diào)節(jié)黃韌帶細胞成骨分化的機制之一，盡管不能排除其他可能機制。
五、STAT3信號通路
JAK-STAT信號轉導通路與細胞增殖、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應密切相關[41]。JAK是一類蛋白酪氨酸激酶，共包括4個成員：JAK1、2、3和Tyk2，STAT是JAK的底物，共包含7個成員：STAT1~4、STAT5a、STAT5b、STAT6[41]。該信號通路可被許多細胞因子和生長因子激活。細胞外信號作用于相應的受體后，與受體偶合的JAK激酶發(fā)生磷酸化并被活化，并使酪氨酸殘基處的STAT蛋白磷酸化，磷酸化的STAT蛋白以二聚體形式移位至細胞核內(nèi)，與靶基因結合并誘導其轉錄與翻譯[42]。STAT3廣泛存在于不同類型的細胞和組織中，且多項研究證明STAT3信號通路調(diào)控多種細胞的成骨分化（圖6）[42,43,44]。
圖6 Stat3信號通路示意圖。細胞外信號作用于相應的受體后，與受體偶合的JAK激酶發(fā)生磷酸化并被活化，并使酪氨酸殘基處的STAT蛋白磷酸化，磷酸化的STAT蛋白以二聚體形式移位至細胞核內(nèi)，與靶基因結合并啟動相應成骨轉錄因子的表達，從而調(diào)控成骨分化及骨形成
目前，關于STAT3信號通路在黃韌帶骨化發(fā)生機制的研究較少。Fan等[45]在研究瘦素刺激OLF患者黃韌帶細胞成骨分化的分子機制時，發(fā)現(xiàn)給予一定時間瘦素處理的OLF細胞與對照組相比，磷酸化的STAT3表達水平隨時間的延長而逐漸升高，而STAT3的總表達水平并無變化；然后用選擇性抑制劑AG490阻斷STAT3磷酸化可顯著減少瘦素誘導的OLF細胞成骨分化。此外，進一步實驗發(fā)現(xiàn)STAT3與Runt相關轉錄因子2（Runx2）在細胞核中相互作用，STAT3、Runx2和類固醇受體共激活因子-1（SRC-1）是Runx2靶基因啟動子募集的轉錄復合體的組成部分，在瘦素刺激OLF細胞成骨分化的過程中起重要作用。類似地，Sugimoto等[46]在研究腰椎黃韌帶肥厚的發(fā)生機制中也發(fā)現(xiàn)了STAT3信號通路的參與；他對黃韌帶肥厚組織的成纖維細胞進行體外實驗，結果顯示，IL-6通過誘導STAT3信號的磷酸化增加了基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的表達、分泌和活化，刺激彈性蛋白降解進而導致黃韌帶的纖維化，并且使用STAT3抑制劑處理可終止該作用過程。這些結果證明STAT3信號通路在炎性因素致黃韌帶退變中的具有調(diào)控作用，為研究黃韌帶骨化提供了一個新方向。
六、其他相關信號通路
Wang等[47]探索了表觀遺傳學與黃韌帶骨化相關性，發(fā)現(xiàn)AKT信號通路調(diào)控了黃韌帶細胞成骨分化的過程。首先實驗證明了m6A去甲基化酶ALKBH5在黃韌帶骨化細胞中表達，進一步發(fā)現(xiàn)ALKBH5的過表達使AKT磷酸化，激活了AKT信號通路，使成骨基因表達增加，促進了黃韌帶的骨化；而當ALKBH5被敲除時，與對照組相比，AKT的磷酸化被抑制，成骨分化能力明顯減弱。另外，當單獨過表達ALKBH5時，礦化和ALP活性可通過BMP-2的去甲基化進行調(diào)節(jié)。然而，ALKBH5的這種作用依賴于BMP-2的表達水平和AKT信號通路的激活，抑制BMP-2和AKT的活性時，ALKBH5的作用明顯受限。因此，研究揭示了ALKBH5通過激活AKT信號通路使BMP-2去甲基化，從而促進黃韌韌骨化的機制。Jun和Kim[48]為了探索FGF2基因、FGFR基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）與脊柱韌帶骨化之間的相關性，對157例脊柱韌帶患者的血液樣本進行直接測序并進行分析，發(fā)現(xiàn)所有相關的9個SNP中，F(xiàn)GF2基因中的RSl47621與OLF有顯著的相關性，可以推測FGF信號通路可能調(diào)控TOLF的發(fā)生、發(fā)展，但尚需進一步的研究證實。此外，研究發(fā)現(xiàn)MiR-132-3p[49]、MiR-615-3p[50]、MiR-490-3p[51]等多種因子可與叉頭轉錄因子（forkhead box O1，F(xiàn)OXO1）靶向結合來抑制黃韌帶細胞成骨分化，這也提示FOXO1及其相關通路可能是胸椎黃韌帶骨化可行的治療靶點。
綜上所述，TOLF作為一個多基因參與、多因素作用、涉及多步驟的復雜生物過程，目前已證實多條分子信號通路在這一過程中起重要的調(diào)控作用，其中多個信號分子直接或間接影響Runx2、Osx、OPN、ALP等成骨相關因子的表達，從而調(diào)控黃韌帶細胞的成骨分化（圖7）。然而，現(xiàn)階段研究尚存在一定的局限性。參與TOLF的多條信號通路之間必然存在著相互聯(lián)系和相互作用，形成一個復雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡，但目前的研究以單一通路為主，無法徹底揭示TOLF具體的發(fā)病機制。因此，未來的研究既要繼續(xù)探索更多的與TOLF發(fā)病相關的信號通路，多角度地理解黃韌帶細胞成骨分化的分子機制，又要更深入研究各通路的精確機制及通路與通路之間的關聯(lián)機制，從而尋找關鍵靶點，為早期預防和治療TOLF提供依據(jù)。
圖7 各信號通路參與調(diào)控黃韌帶骨化的病理過程。不同的外界刺激或病理改變，包括機械應力、炎癥刺激（TNF-α、IL-6）、內(nèi)分泌及代謝異常（瘦素）、血管因素（angiotensin-2）、細胞分子（microRNA、OPN、GDF-5等）及表觀遺傳等，可直接或間接激活相應的細胞信號通路（BMP信號通路、MAPK信號通路、Wnt信號通路、Notch信號通路、Stat3信號通路及AKT信號通路等），促進特異性成骨轉錄因子Sox9、Runx2、Osterix等轉錄增加，從而調(diào)節(jié)骨髓間質(zhì)干細胞、成骨細胞和軟骨細胞的分化和增殖，最終引起OLF形成和進
參考文獻（略）
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