酒曲中高產(chǎn)糖化酶霉菌的篩選及其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化
劉茗銘，周陽(yáng)子，袁樂梅，劉新玉，邊名鴻*
(四川理工學(xué)院，釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢，643000)
摘 要 從酒曲中篩選高產(chǎn)糖化酶菌株，并對(duì)篩選得到的菌株進(jìn)行耐受性研究及固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化。耐受性試驗(yàn)結(jié)果表明：該菌株能耐受體積分?jǐn)?shù)10%的酒精，在pH值4以上能較好生長(zhǎng)，pH值3.5時(shí)生長(zhǎng)受到明顯抑制，在23～41 ℃范圍內(nèi)均能較好生長(zhǎng)。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶最佳條件為：糠殼添加量4%、接種量1.25%、初始pH值為5.5、料水比5∶3 (g∶mL)，在30 ℃下培養(yǎng)72 h，其糖化酶活性高達(dá)1 791.3 U/g。該菌株制作成淺盤曲：外觀符合要求、試飯?zhí)欠趾?4.76 g/100g。
關(guān)鍵詞 糖化酶；霉菌；固態(tài)發(fā)酵；產(chǎn)酶優(yōu)化
“曲為酒之骨”，小曲作為小曲白酒的糖化發(fā)酵劑，對(duì)于白酒的口感、風(fēng)味起到至關(guān)重要的作用，是近年來研究的熱點(diǎn) [1-2]。在小曲微生物群落結(jié)構(gòu)中，霉菌是微生物的主要菌群之一，在釀酒過程中主要起糖化作用。因其豐富的糖化型淀粉酶, 能將淀粉結(jié)構(gòu)中的α-1,4鍵和α-1,6 鍵切斷，使淀粉絕大部分轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖，從而提高淀粉利用率[3-4]，因此糖化酶活力也是釀酒曲藥質(zhì)量評(píng)定的主要指標(biāo)。
近年來，有許多科研工作者嘗試直接使用糖化酶制劑作為糖化劑來提高小曲酒出酒率[5-6]，但此方法水解葡萄糖速度過快，極易導(dǎo)致生產(chǎn)過程中微生物生態(tài)環(huán)境失衡，釀造出的白酒存在口感辣沖、苦澀、不醇厚等缺點(diǎn)[7]。糖化酶主要來源于米曲霉、黑曲霉、根霉等絲狀真菌[8]。唐玉明[9]等通過傳統(tǒng)的分離手段對(duì)小曲樣中高產(chǎn)糖化酶的根霉進(jìn)行了篩選，得到2株優(yōu)良菌株，試飯?zhí)欠直萉303高出271%和218%，且大生產(chǎn)制曲效果好，出酒率和酒質(zhì)均有提高。肖長(zhǎng)清[10]等通過制麩曲的方法，對(duì)高產(chǎn)糖化酶產(chǎn)生菌Aspergillus niger進(jìn)行了分離篩選，同時(shí)對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行了研究。宋毅[11]通過物理誘變對(duì)黑曲霉菌株進(jìn)行了誘變，得到了1株高產(chǎn)糖化酶菌株，產(chǎn)酶能力比出發(fā)菌株高31.7%。DONG [12]通過紫外線氯化鋰誘變糖化酵母As2.1548，成功獲得1株遺傳性能穩(wěn)定的高產(chǎn)糖化酶菌種。
本研究從酒曲中篩選出1株高產(chǎn)糖化酶的霉菌，初步鑒定為米曲霉，并研究該菌株在不同溫度、pH值、酒精條件下的生長(zhǎng)情況，再利用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化其固態(tài)發(fā)酵工藝，從而確定該菌株的最佳產(chǎn)酶條件，為小曲酒生產(chǎn)過程中高糖化酶酶活菌株的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
1.1.1 菌種與培養(yǎng)基
菌種：前期從酒曲中篩選出的23株霉菌。
PDA固體培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯(去皮)200，葡萄糖20，瓊脂20，pH值自然。
初篩培養(yǎng)基[13](g/L)：可溶性淀粉10，酵母膏1.5，NaNO3 1.5，K2HPO4 1，NaCl 0.5，MgSO4 0.5，F(xiàn)eSO4 0.01，瓊脂15，鏈霉素0.000 5，pH 7.0。
PDA液體培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值自然。
1.1.2 儀器與設(shè)備
全自動(dòng)高壓滅菌鍋(MLS-3020)，日本三洋公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱(MJ-250)，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；數(shù)控恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱(BS-2F)，常州精成國(guó)華儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)(UV-2000型)，上海尤尼柯有限公司；生物顯微成像系統(tǒng)(E100)，日本Nikon公司。
1.2.1 檢測(cè)分析方法
孢子個(gè)數(shù)的測(cè)定方法：血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法[14]；糖化酶活力測(cè)定方法：比色法[15]；試飯?zhí)欠郑篋NS法[16]。
1.2.2 高產(chǎn)糖化酶霉菌的篩選
初篩：用無菌接種針挑取少量各霉菌孢子分別點(diǎn)接在初篩培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h后，檢測(cè)透明圈直徑D，菌落直徑d，計(jì)算D/d值，選擇D/d值較大的作為復(fù)篩出發(fā)菌株。
復(fù)篩：將初篩后純種霉菌按文獻(xiàn)[17]中所報(bào)道的方法制成麩曲，通過測(cè)定麩曲的糖化酶活力，從而篩選出產(chǎn)糖化酶活力高的菌株，4 ℃下斜面保藏。
1.2.3 菌種鑒定
采用 SDS-酚氯仿抽提法提取霉菌微生物的 DNA[18]，此為模版， 采用引物 ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAAC-CTGCGG-3′) 和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATAT-GC-3′)參照WHITE等[19]的方法擴(kuò)增ITS區(qū)基因 ，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將最終測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，并對(duì)近似序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。
1.2.4 孢子菌懸液的制備
取1支保藏菌株的試管，用無菌水將菌株洗到150 mL含有玻璃珠的三角瓶中，在150 r/min的搖床上振蕩10 min后，稀釋至孢子含量為106 個(gè)/mL備用。
1.2.5 霉菌耐受性研究
(1)霉菌對(duì)溫度的耐受性：將霉菌接種于PDA液體培養(yǎng)基中，分別置于23、26、29、32、35、38、41 ℃，搖床培養(yǎng)72 h，稱菌體干重。
(2)霉菌對(duì)pH值的耐受性：將霉菌接種于pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的PDA液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)72 h，稱菌絲體干重。
(3)霉菌對(duì)酒精的耐受性：將霉菌接種于酒精體積分?jǐn)?shù)分別為0%、4%、6%、8%、10%、12%、14%的液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)72 h，稱菌絲體干重。
1.2.6 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件單因素研究
(1)培養(yǎng)溫度：稱取麩皮和糠殼共20 g(糠殼添加量為4%)，12 mL蒸餾水于250 mL的三角瓶中，混勻滅菌冷卻后，接入1 mL的孢子菌懸液，分別于26、28、30、32、34、36 ℃培養(yǎng)，72 h后進(jìn)行酶活力測(cè)定。
(2)接種量：稱取麩皮和糠殼共20 g(糠殼添加量為4%)，添加12 mL蒸餾水于250 mL的三角瓶中，混勻滅菌冷卻，分別接入0.625%、1.25%、2.5%、5%、10%、20%孢子菌懸液，30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h后進(jìn)行酶活力測(cè)定。
(3)糠殼添加量：稱取麩皮和糠殼共20 g，其中糠殼添加量分別為0%、2%、4%、6%、8%、10%，加12 mL蒸餾水于250 mL的三角瓶中，混勻滅菌冷卻后，接入1 mL的孢子菌懸液，30 ℃培養(yǎng)72 h后進(jìn)行酶活力測(cè)定。
(4)初始pH值：稱取麩皮和糠殼共20 g(糠殼添加量為4%)，12 mL蒸餾水于250 mL的三角瓶中，調(diào)節(jié)pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，混勻滅菌冷卻后，接入1 mL的孢子菌懸液，30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h后進(jìn)行酶活力測(cè)定。
(5)料水比：稱取麩皮和糠殼共20 g(糠殼添加量為4%)，分別加入料水比為2∶1、20∶11、5∶3、20∶13、10∶7、4∶3 (g∶mL)的蒸餾水于250 mL三角瓶中，混勻滅菌冷卻后，接入1 mL的孢子菌懸液，30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h后進(jìn)行酶活力測(cè)定。
1.2.7 正交試驗(yàn)
本試驗(yàn)在單因素結(jié)果分析的基礎(chǔ)上，選取接種量(A)，溫度(B)，料水比(C)3個(gè)因子，每個(gè)因子設(shè)3個(gè)水平因素，正交試驗(yàn)優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件，因素水平設(shè)計(jì)表見表1。
表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表
Table 1 Orthogonal test factor level design table
1.2.8 試飯?zhí)欠?/p>
試飯?zhí)欠趾慷x：100 g米飯經(jīng)過曲藥糖化后的含糖質(zhì)量(g)。
蒸飯：取大米200 g，用水淘洗干凈，加水至總質(zhì)量為420 g，進(jìn)行蒸飯，上大汽后蒸40～50 min。要求飯粒熟而不爛，米飯含水量60%。
培菌糖化：稱取60 g米飯(稱取3個(gè)樣)涼至35 ℃，拌入米飯質(zhì)量0.14%的曲霉曲樣品(即84 mg)，拌勻后裝入滅過菌的培養(yǎng)皿中，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)46 h后取出，測(cè)定其試飯?zhí)欠趾俊?/p>
每組試驗(yàn)重復(fù)3組，試驗(yàn)結(jié)果以x±Se表示，用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行編輯作圖。
2.1.1 初篩
將23株霉菌活化后接入選擇培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h后，檢測(cè)結(jié)果。霉菌菌落直徑(d)、透明圈直徑(D)以及比值(D/d)是表征霉菌糖化酶活力高低的指標(biāo)。初篩部分透明圈圖片及菌株顯微形態(tài)見圖1；測(cè)量結(jié)果見表2。由表2可知，透明圈直徑D/d ≥1.30的菌株共有3株，其中M21最大，D/d值達(dá)到1.71，選擇M5、M21、M22，D/d≥1.3的菌株作為復(fù)篩菌株。
圖1 初篩部分透明圈
Fig.1 The initial screen is partially transparent
注：自上到下分別是M5、M21、M22菌株的透明圈、菌落及顯微形態(tài)。
表2 高產(chǎn)糖化酶菌株初篩結(jié)果
Table 2 The results of high yield glycosylase strain were
first screened
注：共有23株菌株，編號(hào)為M1～M23，以上表格中未出現(xiàn)編號(hào)的菌株即為無透明圈。
2.1.2 復(fù)篩
將M5、M21、M22三株菌分別制成麩曲，測(cè)定麩曲的糖化酶活力，結(jié)果見表3。由表3可知，M5、M21、M22三株菌的糖化酶酶活均高于1 000 U/g，但M21 的糖化酶活力最高，為1 512.7 U/g。因此，選擇M21進(jìn)一步研究其耐受性能和產(chǎn)酶特性。
表3 高產(chǎn)糖化酶菌株復(fù)篩結(jié)果 單位：U/g
Table 3 The production of high yield glycosylated enzyme
was rescreened
2.1.3 菌種鑒定
采用MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，菌株M21與3株Aspergillus oryzae(米曲霉)聚在一起，且相似度為100%。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，初步將該菌株歸屬于米曲霉。
圖2 高產(chǎn)糖化酶菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析
Fig.2 Phylogenetic analysis of high yield glucoamylase strains
2.2.1 溫度的耐受性
由于小曲酒糖化發(fā)酵時(shí)間短，在糖化發(fā)酵過程中升溫幅度較大，耐高溫的微生物更有利于小曲酒釀造。因此確定菌株對(duì)溫度的耐受能力很有必要。由表4可知，溫度的改變對(duì)霉菌M21的生長(zhǎng)影響較小，菌株在26～35 ℃之間均能較好的生長(zhǎng)；當(dāng)溫度為38 ℃時(shí)，菌株生長(zhǎng)受到一定抑制，高溫可導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞、代謝活動(dòng)減弱，而在41 ℃時(shí)霉菌還能生長(zhǎng)，說明其耐溫性良好。
2.2.2 pH值的耐受性
小曲酒發(fā)酵周期短，產(chǎn)酸快，pH值較低[20]，因此對(duì)釀酒微生物耐酸性要求較高。同時(shí)pH值能改變微生物細(xì)胞中的電解質(zhì)，從而對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝造成一定影響。由表5可知隨著pH值的減小，霉菌的生長(zhǎng)受到影響，pH 4以下生長(zhǎng)受到明顯抑制，而在pH 4以上均能較好的生長(zhǎng)，菌株M21的pH耐受性良好。
表4 不同溫度對(duì)霉菌M21生長(zhǎng)的影響
Table 4 The effect of different temperatures on the growth of mould M21
表5 不同pH值對(duì)霉菌M21生長(zhǎng)的影響
Table 5 The effect of different pH values on the growth of mould M21
2.2.3 酒精的耐受性
酒精是小曲中酵母菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)物，酒精濃度的高低直接影響白酒發(fā)酵，霉菌和酵母本身在高濃度酒精環(huán)境中都受到一定的抑制作用，因此在小曲發(fā)酵的過程中，霉菌酒精的耐受能力對(duì)小曲的出酒率也有較大影響。由表6可以看出，霉菌隨著酒精濃度的升高，菌體存活率逐漸減低。隨著小曲酒發(fā)酵過程的進(jìn)行，酒精體積分?jǐn)?shù)逐漸升高，發(fā)酵后期能達(dá)到14%，霉菌M21在8%的酒精環(huán)境生長(zhǎng)受到抑制，但在10%的酒精體積分?jǐn)?shù)仍有一定的生長(zhǎng)能力，高于其他常見霉菌[21]，因此該菌株耐酒精性能較好。
表6 不同酒精濃度對(duì)霉菌M21生長(zhǎng)的影響
Table 6 The effect of different alcohol concentration on the growth of mould M21
2.3.1 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)糖化酶活力的影響
本試驗(yàn)選擇26～36 ℃溫度區(qū)間，試驗(yàn)結(jié)果如圖3。由圖3可知，霉菌糖化酶活力伴隨著溫度的上升呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。霉菌的生長(zhǎng)代謝受溫度的影響較大，同時(shí)溫度對(duì)酶的代謝也有很大的影響[22]。培養(yǎng)溫度較低微生物生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)酶稀少；培養(yǎng)溫度過高會(huì)抑制甚至殺死微生物。當(dāng)培養(yǎng)溫度為30 ℃產(chǎn)酶最多，因此選擇30 ℃為最佳培養(yǎng)溫度。
圖3 不同溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶活力的影響
Fig.3 The effect of different temperature on the enzyme
activity of fermentation products
2.3.2 接種量對(duì)產(chǎn)糖化酶活力的影響
在固體發(fā)酵過程中，微生物的接種量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有著較大的影響，接種量過大培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)不足，接種量過小菌體繁殖能力不夠，發(fā)酵動(dòng)力不足。由圖4可知，隨著接種量的逐漸增大，糖化酶活力呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)接種量達(dá)到2.5%時(shí)，其糖化酶酶活達(dá)最大值1 698.3 U/g。繼續(xù)加大接種量，菌體變得密集，消耗培養(yǎng)基的速度加快，菌體所能利用的資源空間相對(duì)減少，不利于發(fā)酵產(chǎn)酶，因此2.5%為最佳接種量。
圖4 不同接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶活力的影響
Fig.4 The effects of different inoculations on the enzyme
activity of fermentation products
2.3.3 糠殼添加量對(duì)產(chǎn)糖化酶活力的影響
在固體發(fā)酵過程中，糠殼添加量的多少?zèng)Q定了曲料的疏松程度，同時(shí)也影響著微生物的繁殖與產(chǎn)酶。由圖5可知，隨著糠殼的加入，發(fā)酵產(chǎn)物糖化酶活力先增大后減小。糠殼加量過少，曲餅過于緊實(shí)，氧氣含量不足，同時(shí)不利于發(fā)酵散熱；糠殼加量過大，曲料過于疏松造成麩皮曲不易形成餅狀，保水性減弱，曲料容易干，影響糖化霉菌的生長(zhǎng)及酶的合成[23]。在糠殼添加量為4%時(shí)，曲料疏松度較好，氧氣含量高，利于微生物前期增殖和酶的合成[24]，此時(shí)糖化酶活力最大，為1 639.0 U/g。
圖5 不同糠殼添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶活力的影響
Fig.5 The effect of the addition of different bran shells on
the enzyme activity of fermentation products
2.3.4 初始pH值對(duì)產(chǎn)糖化酶活力的影響
由圖6可知，隨著pH值的增大，糖化酶活力先增大后減小，在初始pH值為5.5時(shí)，糖化酶活力達(dá)到最大為1 605.4 U/g。
圖6 不同初始pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶活力的影響
Fig.6 The effect of different initial pH on the enzyme
activity of fermentation products
2.3.5 料水比對(duì)產(chǎn)糖化酶活力的影響
合理料液比可以使培養(yǎng)基有較好的疏松性，增加空氣傳遞，使菌體代謝產(chǎn)生的酶更好地傳輸[20]。由圖7可知，糖化酶活力隨著水分的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)。水分含量過低，培養(yǎng)基后期表面會(huì)逐漸干燥 ，不利于微生物生長(zhǎng)繁殖及產(chǎn)酶[25]；水分含量過高又會(huì)導(dǎo)致曲料結(jié)合緊密，無法充分散熱，致使曲料溫度難以控制，影響菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。當(dāng)料水比為20∶13 g/mL時(shí)，糖化酶活力達(dá)到最大值為1 621.7 U/g。
圖7 不同料水比對(duì)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶活力的影響
Fig.7 The effect of different water content on the enzyme
activity of fermentation products
通過正交試驗(yàn)的結(jié)果如表7所示，所選中的3種處理?xiàng)l件對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶效果的影響由大到小依次為溫度>料水比 >接種量。通過比較3因素的水平均值，可以得出最佳處理?xiàng)l件為A1B2C1。以最佳處理?xiàng)l件進(jìn)行驗(yàn)證，此時(shí)糖化力為1 791.3 U/g，相應(yīng)的最佳糖化酶產(chǎn)酶條件為溫度30 ℃、料水比5∶3 g/mL、接種量1.25%。
表7 正交試驗(yàn)結(jié)果
Table 7 Orthogonal test results
注：“k”表示糖化力平均值，“R”表示極差。
將霉菌M21進(jìn)行試飯?jiān)囼?yàn)，46 h后測(cè)定其試飯?zhí)欠帧Ｒ话愕奶腔咕囷執(zhí)嵌仍?0 g/100 g左右[17,26]，而經(jīng)過優(yōu)化發(fā)酵條件后的霉菌M21試飯?zhí)欠诌_(dá)到24.76 g/100 g，表明該菌株糖化能力良好，有一定的應(yīng)用價(jià)值。
采用淀粉平板透明光圈法從實(shí)驗(yàn)室保存的23株霉菌中初篩得到M5、M21、M22共3株糖化酶活力較高的霉菌菌株。通過制作純種麩曲測(cè)定其糖化酶活力，復(fù)篩得到1株高糖化酶酶活菌株M21，初步鑒定為米曲霉。該菌株能耐受體積分?jǐn)?shù)10%的酒精，在pH 4以上能較好地生長(zhǎng)，pH 3.5時(shí)生長(zhǎng)受到明顯抑制，在23～41 ℃范圍內(nèi)均能較好生長(zhǎng)。該霉菌在培養(yǎng)溫度30 ℃、糠殼添加量4%、接種量1.25%、初始pH值為5.5、料水比5∶3 (g∶mL)條件下，培養(yǎng)72 h得到的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物糖化酶活性可高達(dá)1 791.3 U/g。將該菌株制作成淺盤曲：外觀符合要求、試飯?zhí)欠趾?4.76 g/100 g，預(yù)期采用此方法可增加出酒率。
由于本試驗(yàn)主要對(duì)該菌株的產(chǎn)糖化酶條件進(jìn)行了一定研究，并未研究該菌株蛋白酶酶活、發(fā)酵、生香等特性，所以對(duì)其綜合能力尚需進(jìn)一步研究。
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