闡明癌癥干細(xì)胞的分裂和擴散機制，將有助于解釋腫瘤是如何生長和逃避治療的。
Arnold Kriegstein和他的團隊觀察到，癌細(xì)胞能在培養(yǎng)皿中快速移動，在分裂前的1小時內(nèi)，這些癌細(xì)胞有時能夠移動其自身長度30倍的距離。通常只有某些胚胎干細(xì)胞在胎兒大腦發(fā)育過程中能快速移動。而這些癌細(xì)胞來自一種非常難以治療的腦腫瘤——膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，這是一種特別難治好的腦腫瘤，部分是因為其擴散極快。
加利福尼亞大學(xué)舊金山分校（University of California, San Francisco，UCSF）的發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)家Kriegstein認(rèn)為，這種行為暗示了癌細(xì)胞與干細(xì)胞的相似之處，而干細(xì)胞在胚胎發(fā)育中非常重要。“重新激活原本只有在胚胎發(fā)育中表達的基因程序，往往是細(xì)胞癌變的一部分原因。” Kriegstein想研究其中的聯(lián)系。
Kriegstein小組與UCSF放射腫瘤學(xué)家David Raleigh合作，將膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣品分為兩部分：一部分富含能快速移動的干細(xì)胞樣細(xì)胞，另一部分包含已分化的更成熟類型的癌細(xì)胞。研究人員將兩部分細(xì)胞分別接種于人腦類器官（模仿器官的簡化結(jié)構(gòu)）中，預(yù)期只有干細(xì)胞樣細(xì)胞組會重建原始腫瘤。但令他們驚訝的是，兩組細(xì)胞均重建了完整的癌細(xì)胞譜系[1]。Kriegstein說：“剛開始時在每個分組中幾乎只有一種類型的細(xì)胞，但最終卻產(chǎn)生了大量異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞。這是如何發(fā)生的呢？這仍然像一個黑箱?！?/p>
腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人的小塊組織，可用于培養(yǎng)類器官模型，研究腫瘤干細(xì)胞在癌癥中的作用。。圖源：Jessica Kourkounis/The Washington Post
自20世紀(jì)90年代以來，研究人員一直懷疑癌癥中的干細(xì)胞是癌癥復(fù)發(fā)、擴散（或轉(zhuǎn)移）和耐藥的關(guān)鍵。但癌癥干細(xì)胞卻似乎難以描述：它們沒有明確的分子標(biāo)記，也可能并非在每個腫瘤中都存在；可能最令人沮喪的是，它們與癌癥的侵襲性或治療效果的關(guān)系很小。
“在某些癌癥中，幾乎所有細(xì)胞都起干細(xì)胞的作用；而在其他癌癥中，干細(xì)胞和分化程度更高的腫瘤細(xì)胞則具有清晰的層次結(jié)構(gòu)，”阿姆斯特丹大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的干細(xì)胞研究員Louis Vermeulen說，“真正的爭議是：在一種癌癥中有多少干細(xì)胞，以及它們是否總是同一種細(xì)胞？”
為了回答這些問題，癌癥生物學(xué)家正在擴展他們的工具箱。除了改良培養(yǎng)方法（例如Kriegstein的研究小組使用的類器官）之外，研究人員還在開發(fā)來自發(fā)育生物學(xué)的方法。其中之一是譜系追蹤，它通常用于追蹤胚胎細(xì)胞如何生長并分化為成體組織，但也可以揭示單個癌細(xì)胞如何重建其腫瘤親本中的遺傳多樣性?，F(xiàn)在，癌癥生物學(xué)家正在將該方法與單細(xì)胞方法相結(jié)合，以便更清晰地了解癌癥干細(xì)胞是否以及如何引發(fā)疾病。
不斷擴展的培養(yǎng)方式
Kriegstein和Raleigh之所以決定使用類器官，是因為缺乏好的動物模型（例如，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤很難在小鼠和大鼠中培養(yǎng)），類器官也比嚙齒動物更能代表人類的組織環(huán)境，而且使用起來非常容易，Kriegstein團隊的前博士后研究員Aparna Bhaduri說。通過顯微鏡觀察，研究人員只需將腫瘤細(xì)胞移至類器官表面，然后等待約45分鐘即可形成腫瘤。Bhaduri認(rèn)為這比動物實驗要容易得多。
但Bhaduri認(rèn)為，類器官仍然無法替代動物，特別是因為其在結(jié)構(gòu)上缺乏血管，因此無法發(fā)現(xiàn)腫瘤與循環(huán)系統(tǒng)的相互作用，而且它們很易變。她目前在加利福尼亞大學(xué)洛杉磯分校，主持自己的干細(xì)胞生物實驗室?！拔覀兛赡苓€需要進行更多優(yōu)化，以確保發(fā)現(xiàn)特定腫瘤中可能存在的所有異質(zhì)性?！彼f。
賓夕法尼亞州匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)中心（University of Pittsburgh Medical Center）的神經(jīng)腫瘤學(xué)家Jeremy Rich認(rèn)為，與常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)相比，類器官具有不同的營養(yǎng)和生長要求，這使其難以用于高通量的研究。他的團隊通過生物打印——一種類似于3D打印的過程，細(xì)胞和培養(yǎng)基代替了惰性材料——研究炎癥和免疫系統(tǒng)如何促進膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞行為。免疫功能障礙是許多癌癥的一個關(guān)鍵因素，但這很難在類器官和動物模型中進行研究：前者沒有免疫系統(tǒng)，而后者則是人為設(shè)計的免疫力受損的動物，以便人類腫瘤細(xì)胞可以在其中生長。
Rich和同事們使用不同細(xì)胞類型和透明質(zhì)酸等前體材料混合來打印水凝膠。在打印的時候，水凝膠生長培養(yǎng)基形成一個3D支架，并接種可用作腫瘤模型的細(xì)胞。當(dāng)Rich和他的團隊嘗試將膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞與不同組合的其他神經(jīng)細(xì)胞混合使用時，他們發(fā)現(xiàn)，在免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞）存在的情況下，腫瘤細(xì)胞表達與促進膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人腫瘤侵襲和耐藥相關(guān)的基因[2]。他們還發(fā)現(xiàn)，在有其它類型細(xì)胞存在的情況下，干細(xì)胞更接近它們在現(xiàn)實中的行為，這表明組織環(huán)境在對干細(xì)胞的行為特征發(fā)揮了影響。
來自膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(一種侵襲性腦腫瘤)的癌細(xì)胞。圖片來源：Steve Gschmeissner/ SPL
同樣，法國巴黎居里研究所（Curie Institute）的細(xì)胞生物學(xué)家Silvia Fre發(fā)現(xiàn)，在成年健康小鼠的乳腺組織包含的干細(xì)胞是已分化的，不能形成腫瘤，但如果將這些細(xì)胞從組織中取出，它們將迅速重新激活多能性或者分化為包括癌細(xì)胞在內(nèi)的不同類型細(xì)胞的能力，這凸顯了組織環(huán)境在腫瘤發(fā)展中的關(guān)鍵作用[3]。
更簡單的培養(yǎng)模型也可能具有啟發(fā)性。Vermeulen和同事們在2018年的一項研究中[4]，使用了被稱之為球體培養(yǎng)的簡單模型系統(tǒng)（人腫瘤細(xì)胞在自由漂浮的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中生長）和腫瘤異種移植（將腫瘤細(xì)胞接種于免疫缺陷小鼠體內(nèi)，使其生長成為腫瘤）。通過這些研究方法發(fā)現(xiàn)，人類結(jié)腸癌細(xì)胞越靠近腫瘤邊緣就越具有干細(xì)胞特征。當(dāng)研究小組將腫瘤中心的非增殖細(xì)胞取出并移植到邊緣時，這些細(xì)胞便表達了增殖標(biāo)志物。作者總結(jié)道，決定人結(jié)腸癌干細(xì)胞的不是其內(nèi)在的基因表達模式，而是其所在的位置。Vermeulen說：“發(fā)現(xiàn)腫瘤環(huán)境是決定干細(xì)胞的主導(dǎo)因素，我非常驚訝。哪些細(xì)胞的行為與干細(xì)胞相似，是一直在變化的，這取決于這些細(xì)胞在腫瘤中的位置?！?/p>
捕獲細(xì)胞軌跡
環(huán)境和細(xì)胞特性的相互作用意味著癌細(xì)胞可能在某些實驗條件下看起來像干細(xì)胞，而在其它條件下則不然，或因鄰近細(xì)胞的不同而表達不同的基因。癌細(xì)胞還缺乏通用的表面標(biāo)志，使得標(biāo)記和研究它們變得更加棘手，但研究人員設(shè)計了一系列替代策略來追蹤細(xì)胞的軌跡，其中許多是從發(fā)育生物學(xué)的工具箱中借用而來。
為了研究胚胎乳腺中的干細(xì)胞，F(xiàn)re和她的團隊使用了一種名為Confetti的小鼠（因這種小鼠的細(xì)胞可以表達四種不同的熒光報告基因而得名）。當(dāng)研究人員在小鼠發(fā)育過程中的不同時間點用一種化學(xué)物質(zhì)處理動物以誘導(dǎo)報告蛋白表達時，這些蛋白表達在不同的位置被激活，通過熒光顯微鏡可以觀察到不同譜系的細(xì)胞在成體組織中的最終分布。在細(xì)胞培養(yǎng)研究中，Vermeulen及其同事們也使用了類似的基于熒光的方法來了解環(huán)境如何影響結(jié)腸癌干細(xì)胞的[5]。
當(dāng)細(xì)胞發(fā)生突變并分化為不同的亞群時，遺傳條形碼是跟蹤細(xì)胞的另一種選擇。該方法為每個細(xì)胞群體提供固定的遺傳條形碼，該條形碼隨著細(xì)胞的分裂而不斷發(fā)展。通過對細(xì)胞中的所有條形碼進行測序并進行比較，研究人員可以得出不同細(xì)胞之間的相互關(guān)系以及它們對腫瘤生長的相關(guān)作用。
早期，這類方法依賴于用慢病毒將攜帶的靜態(tài)條形碼序列隨機插入至一個細(xì)胞庫，而現(xiàn)在，基于基因編輯工具CRISPR正在優(yōu)化這一過程。
在基于CRISPR的譜系追蹤中，研究人員將一系列CRISPR靶序列插入細(xì)胞的基因組中，Cas9酶周期性的切割這些靶序列，觸發(fā)DNA修復(fù)過程，并留下基因疤痕，作為細(xì)胞及其后代的唯一標(biāo)識。與慢病毒條形碼不同，該系統(tǒng)在每次細(xì)胞分裂時都可生成唯一的動態(tài)條形碼，從而使研究人員能夠重建不同細(xì)胞及其子代細(xì)胞之間的相關(guān)性[6]。荷蘭烏得勒支Hubrecht研究所（Hubrecht Institute）的干細(xì)胞生物學(xué)家Alexander van Oudenaarden說：“隨著時間的推移，變化是不斷累積的，這與之前使用的慢病毒條形碼有根本上的區(qū)別?！?/p>
另一種方法是將熒光蛋白序列與DNA重復(fù)序列（胞嘧啶和腺嘌呤堿基長重復(fù)序列）結(jié)合，在分裂的過程中，細(xì)胞會周期性地修剪熒光蛋白序列以“修復(fù)”這些看起來出了問題的重復(fù)序列，最終使得使熒光蛋白序列被移動進入基因組中可以表達的位置。Vermeulen說，這種修復(fù)大約在每10000個細(xì)胞中發(fā)生一次，并產(chǎn)生在顯微鏡下可見的微小遺傳光斑。這種熒光標(biāo)記方法的優(yōu)點是不需要化學(xué)物質(zhì)激活，他說，“這是一種細(xì)胞完全不受干擾的譜系追蹤方法?！?/p>
這些追蹤策略都有其優(yōu)缺點。例如，某些CRISPR序列比其他CRISPR序列更容易產(chǎn)生疤痕，在理論上無偏的過程中引入了偏差?；陲@微鏡和測序的策略都需要高級的計算和技術(shù)技能。盡管如此，結(jié)合單細(xì)胞RNA測序技術(shù)，這些標(biāo)記技術(shù)仍然提供了強大的工具來評估單個細(xì)胞在腫瘤中的相對重要性。
Vermeulen指出：“如果腫瘤是由癌癥干細(xì)胞驅(qū)動的，那么只有少數(shù)標(biāo)記細(xì)胞會增殖并成為大型的克隆。但是在依賴于多種類型細(xì)胞的腫瘤中，大多數(shù)細(xì)胞都會擴增。把數(shù)據(jù)放到數(shù)學(xué)模型中，就能確定兩種擴增模式的差異?！?/p>
成倍增加的檢測
這些模型可以提供有關(guān)腫瘤細(xì)胞如何生長和變化的更完整的信息，但是它們需要新的計算方法。傳統(tǒng)上用來推斷細(xì)胞間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的模型無法處理譜系追蹤數(shù)據(jù)與單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)結(jié)合產(chǎn)生的大量信息。
西雅圖華盛頓大學(xué)（University of Washington）的遺傳學(xué)家Jay Shendure認(rèn)為，這是發(fā)育生物學(xué)家長期以來一直在努力解決的問題。最早能同步進行譜系追蹤和RNA測序的CRISPR系統(tǒng)之一就是由Jay Shendure團隊所開發(fā)[7]。
在癌癥研究中進行譜系追蹤時，最大的問題還是技術(shù)：檢測到足夠數(shù)量的遺傳條形碼，并處理丟失數(shù)據(jù)。因為某些細(xì)胞群消失，或樣品中遺傳條形碼序列的數(shù)量太少而無法處理，導(dǎo)致譜系追蹤研究常常存在空位。Shendure認(rèn)為，算法很難解決這些空位的問題，因此最大化編碼遺傳條形碼的RNA序列的產(chǎn)量和穩(wěn)定性至關(guān)重要。他說：“你需要相對較高的檢出效率，例如，在一個研究中使用了X個細(xì)胞，你希望能夠檢測追蹤到其中大部分的遺傳條形碼?！?/p>
在今年發(fā)表的一項研究中[8]，UCSF癌癥研究人員Trever Bivona和他的同事對被移植到動物體內(nèi)的肺癌細(xì)胞同時進行了譜系追蹤和RNA表達水平變化的研究。基于Cas9工具，他們能夠?qū)崟r跟蹤遺傳變化是如何驅(qū)動癌細(xì)胞向遠(yuǎn)端組織播撒腫瘤細(xì)胞——即腫瘤的轉(zhuǎn)移過程。
該研究小組從動物體內(nèi)的6個不同位置獲取了40000多個小鼠細(xì)胞的譜系和基因表達數(shù)據(jù)，并發(fā)現(xiàn)在明確進入到不同分化路徑之前，細(xì)胞在不同的基因狀態(tài)間多次往復(fù)。
為了分析這大量的數(shù)據(jù)，Bivona的合作者——馬薩諸塞州劍橋懷特黑德研究所（Whitehead Institute in Cambridge）的生物學(xué)家Jonathan Weissman和加利福尼亞大學(xué)伯克利分校（University of California, Berkeley）的計算機科學(xué)家Nir Yosef——開發(fā)了一套名為Cassiopeia的工具，以幫助在CRISPR-Cas9遺傳條碼數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上重建細(xì)胞譜系[9]。其他研究人員可免費獲取他們和其他團隊的分析工具（請參閱 go.nature.com/2ptezwd）。
Bhaduri經(jīng)常使用由統(tǒng)計學(xué)家Rahul Satija和計算生物學(xué)家Aviv Regev對Bhaduri來說，她常用的是Seurat工具箱[10]。Seurat由統(tǒng)計學(xué)家Rahul Satija和計算生物學(xué)家Aviv Regev在哈佛和麻省理工的布羅德研究所開發(fā)，能夠同時分析基因表達改變以及單個細(xì)胞中特定基因的拷貝數(shù)的變化。
無論研究人員選擇哪種工具集，Bhaduri都建議這類分析的新手依靠教程并學(xué)完算法開發(fā)人員提供的課程。而那些獨立開發(fā)內(nèi)部分析軟件的人，例如Vermeulen等，則通常與生物統(tǒng)計學(xué)家合作。
當(dāng)然，人們?nèi)匀恍枰玫墓ぞ?，Shendure說?！半S著系統(tǒng)發(fā)育樹中細(xì)胞數(shù)量的增加，可能的排列數(shù)量也成倍增加，因此我們將需要更豐富的工具，才能充分認(rèn)識到到這一研究方向的潛力。”
仍然很復(fù)雜
從發(fā)育生物學(xué)的視角看癌癥干細(xì)胞的問題，已經(jīng)開始揭示驅(qū)動癌癥的許多復(fù)雜因素，以及細(xì)胞形成腫瘤的多種途徑。Rich說：“通過干細(xì)胞角度觀察癌癥，確實改變了人們對癌癥的理解能力?！?/span>
該領(lǐng)域仍然缺乏對癌癥干細(xì)胞的明確定義，但也許不需要那么明確。認(rèn)識到干細(xì)胞樣特性在腫瘤中的重要性，以及細(xì)胞微環(huán)境如何促進它們獲得這些特性，就可能足以導(dǎo)向新的療法。
某些特征為癌細(xì)胞和胚胎組織所共有，例如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的快速移動行為和乳腺癌干細(xì)胞的多能性。健康成人組織缺乏這些特征，阻斷癌細(xì)胞這些行為的療法將不傷害正常細(xì)胞，所以這些特征可能成為理想的藥物靶點。而阻斷這些行為是這些研究的終極目標(biāo)，無論這些行為是否由腫瘤干細(xì)胞所表現(xiàn)。
“截至目前，我們還沒在癌癥療法上真正取得過有力成果，表明如果以腫瘤干細(xì)胞為靶點能延長患者生存期”，Rich說，“這是缺失的一環(huán)。”
參考文獻：
1. Bhaduri, A. et al. Cell Stem Cell26, 48–63 (2020).
2. Tang, M. et al. Cell Res.30, 833–853 (2020).
3. Lilja, A. M. et al. Nature Cell Biol.20, 677–687 (2018).
4. Lenos, K. J. et al. Nature Cell Biol.20, 1193–1202 (2018).
5. Vermeulen, L. et al. Nature Cell Biol.12, 468–476 (2010).
6. Kester, L. & van Oudenaarden, A. Cell Stem Cell 23, 166–179 (2018).
7. Raj, B. et al. Nature Biotechnol. 36, 442–450 (2018).
8. Quinn, J. J. et al. Science371, eabc1944 (2021).
9. Jones, M. G. et al. Genome Biol. 21, 92 (2020).
10. Satija, R., Farrell, J. A., Gennert, D., Schier, A. F. & Regev, A. Nature Biotechnol. 33, 495–502 (2015).
原文以Elusive cancer cells dissected using developmental-biology toolkit標(biāo)題發(fā)表在2021年4月20日的《自然》的技術(shù)特寫版塊上
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