基因功能的分化 (Divergence of gene function) 一般由基因突變，重復(fù)和缺失引起，也是進(jìn)化的主要驅(qū)動(dòng)力。但是在整個(gè)地球生命演化的時(shí)間尺度上研究基因功能的分化并不容易，因?yàn)椴煌锓N間巨大的進(jìn)化距離使我們很難區(qū)分在不同（物種）發(fā)育背景下發(fā)揮不同功能的同源基因到底是獲得了新分化的功能還是依靠其固有的保守多效性【1】。跨物種比較遺傳學(xué)研究的一個(gè)主要瓶頸就是可利用的自然或人工等位變異 (Alleles) 太少，因此類似的研究通常也只能揭示基因多效性的冰山一角，而對(duì)于完整理解基因的功能卻無能為力。這可能導(dǎo)致在基因功能分化的界定上張冠李戴【2, 3】。更有甚者，一些極端突變比如胚致死突變具有發(fā)育上的上位性 (Developmental epistasis) ，從而會(huì)掩蓋基因的其他功能。因此，同源基因在多大程度上經(jīng)歷了功能分化；抑或是有限的等位變異多樣性使得保守的基因多效性被深深的隱藏了? 這在許多研究中仍沒有明確的認(rèn)識(shí)。同源異型 (HOMEOBOX) 基因, 是一類包含有長約180 bp HOMWOBOX基序的基因的統(tǒng)稱。該類基因于1984年被發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于不同物種中，在進(jìn)化上高度保守，其控制生長和發(fā)育，對(duì)于理解物種的胚胎發(fā)育和進(jìn)化有重要意義。1995年，美國加利福尼亞理工學(xué)院的愛德華·劉易斯，美國普林頓大學(xué)的埃里克·維紹斯和德國馬克斯·普萊克發(fā)育生物研究所的女科學(xué)家克里斯蒂安·尼斯萊因·福爾哈德三位科學(xué)家因在HOMEOBOX研究中做出的突出貢獻(xiàn)，而獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。在植物中，WUSCHEL HOMEOBOX (WOX) 基因是一類非常重要的同源異型基因家族，通過調(diào)控分生組織干細(xì)胞的產(chǎn)生和成熟來控制植物生長和發(fā)育。不同植物的WOX同源基因雖然具有在分生組織功能上的保守性。但也有研究報(bào)道了該類基因功能上的分化。比如，十字花科擬南芥WOX8，WOX9基因突變體， wox9或wox8 wox9具有胚發(fā)育缺陷表型【4】。茄科植物番茄有一個(gè)WOX8/9同源基因，該基因的多個(gè)等位突變導(dǎo)致花序過量分枝【5】；而在番茄的兩個(gè)近親物種辣椒和矮牽牛中，wox8/9突變導(dǎo)致莖分生組織增生，卻不產(chǎn)生花。禾本科植物水稻中，wox8/9突變不但導(dǎo)致側(cè)枝分生組織增生，而且還導(dǎo)致節(jié)間縮短并影響花序分枝【6】。因此，這些跨物種的遺傳分析似乎表明，WOX8/9基因在短期和長期的進(jìn)化尺度上都發(fā)生了功能分化。但是，在目前缺乏WOX8/9等位變異多樣性；并且考慮物種特異的生長和發(fā)育過程的前提下，對(duì)以上表型的解釋所得出的這一結(jié)論可能并不一定正確。基因功能的分化可源于影響蛋白功能的編碼區(qū)的突變，也可由順式調(diào)控區(qū)域的突變而來。順式調(diào)控區(qū)域包含大量序列，可與細(xì)胞內(nèi)分子產(chǎn)生非常復(fù)雜的相互作用，因此提供了非常大的變異空間，從而在質(zhì)量和數(shù)量上來影響基因在整個(gè)發(fā)育過程中在不同組織的表達(dá)以及由此產(chǎn)生的表型。因此，對(duì)這些區(qū)域的精細(xì)研究能夠強(qiáng)有力的揭示基因多效性，并且能夠?qū)虻亩嘈Чδ苁潜Ｊ氐倪€是經(jīng)過分化產(chǎn)生的做出準(zhǔn)確的區(qū)分。為解決上述基因功能多效性在進(jìn)化上的保守性或分化性問題，來自冷泉港實(shí)驗(yàn)室的Zachary Lippman教授課題組與多個(gè)單位合作，采用CRISPR-Cas9多通道突變驅(qū)動(dòng)系統(tǒng) (CRISPR-Cas9 multiplex mutagenesis drive system)【7】，獲得了大量的番茄WOX8/9啟動(dòng)子區(qū)域等位變異株系，結(jié)合染色質(zhì)可及性及大量遺傳實(shí)驗(yàn)揭示了該基因的功能多效性是進(jìn)化上高度保守的，而非經(jīng)過功能分化產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，一些被深藏的極度保守的基因多效性可能在植物進(jìn)化中是廣泛存在的。該研究表明，靶向的順式調(diào)控突變能夠揭示基因保守功能，從而可以應(yīng)用在作物改良中以降低不良影響，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及作物改良有突破性指導(dǎo)意義。該研究以番茄WOX9基因 (SlWOX9) 為研究對(duì)象。該基因的所有已知自然變異都造成番茄生殖分生組織過量增殖，從而導(dǎo)致大量花序分枝表型。這與擬南芥中該基因調(diào)控胚發(fā)育的作用相矛盾。因此為檢測番茄wox9突變是否具有其他表型，作者創(chuàng)建了造成蛋白移碼的wox9無效突變，并發(fā)現(xiàn)該突變體具有與擬南芥wox9一樣完全胚致死表型。對(duì)已有的導(dǎo)致花序分枝的四個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域基因編輯突變體 (slwox9pro)的細(xì)致表型分析發(fā)現(xiàn)多個(gè)外顯的營養(yǎng)生長缺陷 (vegetative defects) ，這些新發(fā)現(xiàn)的表型同樣與在其他物種中已知的wox9突變體表型一致。這些分析表明SlWOX9同時(shí)在營養(yǎng)生長和生殖生長中發(fā)揮作用，并且其早期的胚發(fā)育功能與擬南芥中該基因功能保守。雖然已有的slwox9pro等位基因可以揭示其在營養(yǎng)生長中的作用，但并不足以表明是否SlWOX9的多效性受某些特定的順式調(diào)控區(qū)域控制。因此作者利用覆蓋了大概3.7kb SlWOX9啟動(dòng)子區(qū)域的基因編輯系統(tǒng)（CRISPR-Cas9 multiplex mutagenesis drive system）分離到額外的23個(gè)不同形式的slwox9pro等位變異。ATAC-seq表明SlWOX9啟動(dòng)子有四個(gè)峰 (peak)，其中兩個(gè)都在CRISPR-Cas9的靶標(biāo)區(qū)域內(nèi)。作者發(fā)現(xiàn)其中15個(gè)slwox9pro等位變異具有花序分枝表型，并且與第二個(gè)ATAC-seq峰 (peak-2) 片段的缺失緊密相關(guān)。表明該區(qū)域與SlWOX9基因的花序功能相關(guān)。兩個(gè)slwox9pro等位變異具有胚致死表型，并且都缺失或部分缺失了第一個(gè)ATAC-seq峰 (peak-1) 。而且，凡是在peak-1區(qū)域有變異的株系都表現(xiàn)出不同程度的莖頂端分生組織 (SAM) 終止表型。而相應(yīng)的另一個(gè)等位突變s-n5568，雖然缺失了大部分遠(yuǎn)端啟動(dòng)子區(qū)，但具有完整的peak-1區(qū)域，并沒有SAM終止表型。通過對(duì)兩個(gè)peak區(qū)域更加精細(xì)的CRISPR突變及分析驗(yàn)證了這兩個(gè)區(qū)域?qū)τ?span>SlWOX9分別在生殖生長和胚發(fā)育中的功能。作者進(jìn)一步想了解這些功能特定的順式調(diào)控區(qū)域是否存在進(jìn)化意義，通過自己開發(fā)的算法，結(jié)合已被測序的十個(gè)茄科物種的基因組數(shù)據(jù)，評(píng)估了非編碼區(qū)的保守性，并發(fā)現(xiàn)SlWOX9啟動(dòng)子具有相對(duì)較高的保守性。同時(shí)作者選取了番茄的近親物種燈籠果 (groundcherry) 作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)WOX9編碼區(qū)突變會(huì)導(dǎo)致和番茄無效突變相似的胚致死表型。通過類似的啟動(dòng)子區(qū)CRISPR-Cas9突變分析驗(yàn)證了與番茄相似的基因多效表型。這些結(jié)果表明，在茄科物種中，WOX9基因的多效功能以及控制這些功能的順式調(diào)控區(qū)域在進(jìn)化上并沒有經(jīng)歷功能分化，而是保守的。那么另一個(gè)問題就產(chǎn)生了， WOX9基因調(diào)控包括花序發(fā)育在內(nèi)的多效功能是否在進(jìn)化上關(guān)系較遠(yuǎn)的十字花科植物擬南芥中也是保守的呢？由于技術(shù)原因，作者并沒有獲得兩個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)CRISPR-Cas9等位突變的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因株系。因此作者利用RNAi降低WOX9基因的表達(dá)水平，并發(fā)現(xiàn)WOX9表達(dá)降低一半可使擬南芥產(chǎn)生類似花序的結(jié)構(gòu)。該結(jié)果表明擬南芥WOX9基因同樣具有與番茄WOX9基因類似的多效性，同時(shí)也進(jìn)一步表明由這些植物同源異型基因所控制的發(fā)育多樣性是深度保守的。植物同源異型基因WOX9的功能多效性是深度保守的，而并非發(fā)生了功能分化。綜上所述，該研究通過對(duì)不同物種WOX9基因順式調(diào)控DNA的體內(nèi)功能解析，發(fā)現(xiàn)了植物同源異型基因的深度保守的多效性，并且不同的功能多效性可以與特定的調(diào)控元件相對(duì)應(yīng)。因此，至少在WOX9基因上表明其在不同物種中的功能多效性并非是經(jīng)過功能分化產(chǎn)生的。所以，一些深度保守的基因多效性可能在植物進(jìn)化中是廣泛存在的。同時(shí)，該發(fā)現(xiàn)對(duì)于基因組編輯技術(shù)在農(nóng)業(yè)研究中的應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)作用：可通過靶向特定調(diào)控區(qū)域來達(dá)到調(diào)節(jié)特定功能的目的，從而能盡量降低對(duì)非目標(biāo)性狀的不良影響。參考文獻(xiàn)
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https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(21)00151-3
